减体积肝移植在大鼠脂肪肝供肝肝移植模型中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0094

摘要/Abstract

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文题释义：
大鼠减体积肝移植：减体积肝移植包括活体肝移植和劈离式肝移植，是全肝移植的必要补充。大鼠减体积性肝移植是一种难度较高的动物手术模型，在切除肝叶时要稍远离所要切除的肝叶血管蒂根部，以免影响邻近肝叶的血液回流。
脂肪肝大鼠模型：是用于研究人类脂肪肝病变及治疗的可靠模型，主要有先天性、转基因动物、化学物质诱导、病毒诱导及高脂饲料诱导这5种实验性模型。用高脂饲料诱导的脂肪肝模型，因其病例特点与人类相似，形成率高、死亡率低，方法简单而被广泛使用。

摘要
背景：肝移植供体缺乏，脂肪肝在人群中发病率高，中度以上脂肪肝作为边缘供体，肝移植后移植物丢失风险高，为提高这类供体利用率，需要建立稳定的大鼠模型作为研究对象。
目的：建立适合脂肪肝供肝的稳定大鼠减体积肝移植模型。
方法：随机各选取20对SD-SD脂肪肝供肝肝移植大鼠，全体积组行全体积原位肝移植术，减体积组行减体积肝移植术。供肝恢复灌流后，观察记录两组大鼠呼吸动度、呼吸频率、心跳及大血管充盈情况，术后观察大鼠恢复情况，解剖死亡大鼠了解死因；记录两组手术时间并作比较；两组大鼠术后进行生存分析；比较两组大鼠术后肝功能及病理组织学改变，评估差异性。
结果与结论：①供肝恢复灌注后，全体积组肝移植受体大鼠呼吸频率、心率快于减体积肝移植组受体大鼠 (P < 0.05)，下腔静脉充盈情况相对较差；②减体积组受体大鼠术后一般情况恢复好于全体积组大鼠；③全体积组修肝时间短于减体积组，但受体手术时间明显长于减体积组(P < 0.05)；全体积组受体大鼠术后早期死亡率明显高于减体积组，主要死亡原因是腹腔出血、空气栓塞和低血容量性休克；两组受体大鼠后续存活时间比较差异无显著性意义；④两组受体大鼠术后肝功能肝酶学和总胆红素总体差异无显著性意义，病理组织学表现相似；⑤综上，脂肪肝供肝大鼠减体积肝移植模型稳定可靠，解决了脂肪肝供肝全体积肝移植术中术野暴露不清、术后易致受体大鼠循环失稳的问题，是研究脂肪肝供肝肝移植的理想动物模型之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4126-282X(赵英鹏)

关键词: 脂肪肝供肝, 全体积肝移植, 减体积肝移植, 大鼠, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Because of liver donor deficiency and high incidence of fatty liver, moderate fatty liver as a marginal donor results in a high risk for graft loss after liver transplantation. Therefore, it is imperative to establish a stable rat model by which we can enhance the utilization of these liver donors.
OBJECTIVE: To establish a viable and stable model of reduced-size liver transplantation with fatty liver donor in rats.
METHODS: Forty pairs of fatty liver donor and recipient rats were randomly chosen. The recipient rats in experimental group received reduced-size liver transplantation and the rats in control group received orthotopic liver transplantation. The breath, heart rate, and vessel filling situation were observed. The postoperative recovery, cause of death, and survival conditions were observed. The operation time was compared between two groups. Besides, the postoperative liver function and pathological changes were assessed.
RESULTS AND CONCLUSION: After graft reperfusion, in the control group, the respiratory rate and heart rate were significantly faster than those in experimental group (P < 0.05), but the vessel filling of inferior vena cava was poor. Rats in the experimental group recovered better than those in the control group (P < 0.05). The operation time in the control group was significantly prolonged compared with the experimental group (P < 0.05). The early mortality in the control group was significantly higher than that in the experimental group, which mainly caused by intra-abdominal hemorrhage, air embolism and hypovolemic shock. The survival time, histology and liver function indexes postoperatively did not differ significantly between two groups. To conclude, the rat model of reduced-size liver transplantation is stable, which reveals clear field of operation and stable circulation, so it is a ideal model for liver transplantation with fatty liver donors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Fatty Liver, Liver Transplantation, Bilirubin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵英鹏，李立，陈刚，白建华，刘其雨. 减体积肝移植在大鼠脂肪肝供肝肝移植模型中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 582-586.

Zhao Ying-peng, Li Li, Chen Gang, Bai Jian-hua, Liu Qi-yu. Reduced-size liver transplantation with fatty liver donors in a rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 582-586.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析全体积组和减体积组各20对大鼠受体均进入分析，无脱失。

2.2 正常喂养大鼠和脂肪肝大鼠对比脂肪肝大鼠和普

通喂养大鼠体质量、肝湿质量均呈进行性增长，至8周末脂肪肝模型组大鼠体质量及肝脏指数明显高于对照组(P < 0.05)，见表1。

2.3 两组肝移植术后大鼠生命体征对比供肝恢复灌注后，全体积肝组大鼠呼吸频率、心率快于减体积组大鼠(P < 0.05)，下腔静脉充盈情况相对较差。术后全体积肝移植组大鼠自主活动缓慢，对刺激反应迟钝，进食进水差，解大便量少；而减体积肝移植组大鼠术后以上情况相对较好，见表2。

2.4 两组大鼠手术时间、供肝冷保存时间、修肝时间、无肝期时间及生存比较见表3。

减体积组大鼠术中受体手术时间、无肝期时间及供肝冷保存时间明显短于全体积组大鼠(P < 0.05)，供体手术时间两组差异无显著性意义，修肝时间全体积组较短。成活率方面，两组大鼠72 h内存活率总体差异无显著性意义(P=0.126)，但全体积肝移植组大鼠术后早期2-4 h内死亡率较高(图2)，死亡原因主要是腹腔出血、空气栓塞和低血容量性休克。

2.5 术后两组大鼠肝功能比较术后4，24 h两组大鼠肝功能比较，谷丙转氨酶、总胆红素数值差异无显著性意义，见表4。

2.6 肝组织切片苏木精-伊红染色结果两组大鼠肝移植术后24 h 肝组织切片苏木精-伊红染色结果显示，光镜下两组肝组织病变情况相似，均表现为肝脏大泡性脂肪变性，肝细胞排列紊乱、细胞间大量炎症细胞浸润，可见片状细胞坏死区，细胞结构消失，部分细胞核固缩或裂解，可见凋亡小体，肝小叶中央静脉区有淤血表现，见图3。

参考文献

[1] Nadig SN, Bratton CF, Karp SJ. Marginal donors in liver transplantation: expanding the donor pool . J Surg Educ. 2007;64(1): 46-50.

[2] Gallegos-Orozco JF, Vargas HE. Should antihepatitis B virus core positive or antihepatitis C virus core positive subjects be accepted as organ donors for liver transplantation. J Clin Gastroenterol. 2007;41(1): 66-74.

[3] Omura T, Ascher NL, Emond JC. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 1996; 62(2): 292-293.

[4] Tran TT, Changsri C, Shackleton CR, et al. Living donor liver transplantation: histological abnormalities found on liver biopsies of apparently healthy potential donors. J Gastroenterol Hepatol. 2006;21: 381-383.

[5] Lee JY, Kim KM, Lee SG, et al. Prevalence and risk factors of non-alcoholic fatty liver disease in potential living liver donors in Korea: a review of 589 consecutive liver biopsies in a single center. J Hepatol. 2007; 47: 239-244.

[6] Urena MA, Ruiz-Delgado FC, Gonzalez EM, et al. Assessing risk of the use of livers with macro and microsteatosis in a liver transplant program. Transplant Proc. 1998;30: 3288-3291.

[7] Higgins GM, Anderson RM. Experimental pathology of the liver. 1. Restoration of liver of white rat following surgical removal. Arch Pathol Lab Med. 1931; 12: 186-202.

[8] 刘涵生,张爱群,董家鸿. 大鼠肝切除模型研究进展[J]. 医学综述, 2013,19(8):1348-1351.

[9] Schwartz LM, Lagranha CJ. Ischemic postconditioning during reperfusion activates Akt and ERK without protecting against lethal myocardial ischemia-reperfusion injury in pigs. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006; 290 (3): H1011-1018.

[10] Pichlmayr R, Grosse H, Hauss J, et al. Technique and preliminary results of extracorporeal liver surgery (bench procedure) and of surgery on the in sity perfused liver. Br J Surg. 1990;77(1): 21-26.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2013年6月至2015年1月在昆明医科大学天然药物重点实验室完成。

1.3 材料雄性SD大鼠80只，SPF级，体质量60-90 g，购自昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(滇) 2011-0006。其中模型组按随机数字表法挑选40只通过喂饲富含饱和脂肪酸的高脂饲料同时以体积分数56%乙醇灌胃8周建立大鼠脂肪肝模型，肝脏脂肪变性程度≥50%作为供体；同批次普通饲料饲养另40只大鼠(对照组)作为受体。40对SD-SD大鼠脂肪肝供肝肝移植模型大鼠中，随机选取20对为全体积组，另20对为减体积组。

1.4 方法

1.4.1 减体积肝移植减体积肝移植组供肝在获取后切除肝左外侧叶(约30%)，保留左内侧叶、中叶、右外侧叶、三角叶和乳头叶，即保留约70%左右的供体肝脏，参考Omrua等^[3]的方法在体外切除肝叶，见图1。

将肝脏翻转，暴露肝左外叶发向门静脉的属支，肝动脉和胆管的分支多伴行在门静脉分支左右，看清其走行之后，用弯显微镊挑起左外叶肝蒂的结构，带线引入4-0丝线结扎，于结扎线之间切断上述结构；轻轻提起肝左外叶，在其根部距肝上下腔静脉约0.4 cm处以4-0丝线结扎，结扎线远端剪除肝叶。后续移植采用Kamada创建的“二袖套法”。

1.4.2 全体积肝移植供肝不做肝叶切除术，移植同样采用Kamada创建的“二袖套法”。

1.5 主要观察指标供肝恢复灌注后，观察记录受体大鼠呼吸动度、频率，心跳及大血管充盈情况，术后观察大鼠自主活动、对刺激反应、饮食及粪便情况。大鼠死亡后均常规进行尸解，了解死因，条件允许情况下抽血并取肝组织作检查。

观察记录两组大鼠手术时间、供肝冷保存时间、修肝时间、无肝期时间、成活率，并进行生存分析。术后拟4， 24 h时间点每组随机处死5只大鼠(另10只大鼠进行生存分析)，收集血及肝脏组织标本，检测肝功能；肝脏组织做成石蜡切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察组织形态改变。

对于在移植模型建成之前意外死亡或未到术后处死时间点提前死亡的大鼠模型，采取追加补充同等模型。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义；生存分析采用乘积极限法(Kaplan-Meier法)作生存曲线，用Log-rank法进行显著性检验，检验水α=0.05。

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讨论

肝移植作为治疗各种终末期肝病的有效手段，在国内已成功开展近20年，其疗效不断提高，手术患者例数也逐年增加。现今国内每年接受肝移植手术的患者约为3 000人，但是等待肝移植的人数却为30万，供肝面临严重不足。供肝中，脂肪肝又是常常遇到的问题，使供肝的质量也成为令人担忧的问题。在美国，大约25%的潜在供肝由于脂肪变性被剔除。美国学者Tran等^[4]对70例潜在供肝活检，发现超过60%的有肝脏异常，其中脂肪肝占38.5%。Lee等^[5]对589例潜在供肝者进行肝穿活检，发现303例(51.4%)患者有非酒精性脂肪性肝病，其中轻、中和重度脂肪变性分别为229例(38.9%)、53例(9.0%)和8例(1.4%)，非酒精性脂肪性肝炎有13例(2.2%)。脂肪肝供体对移植物和受体的存活存在风险，特别是移植后供肝发生移植物无功能的概率较高，且一旦发生，常导致移植失败，危及受体患者生命，必须再次进行移植。以往的研究证实供肝脂肪变性程度大于30%发生早期移植物功能不良是脂肪变性程度小于30%的3.7倍^[6]。

本实验所建脂肪肝供肝大鼠肝移植模型，由于供体肝质量和体积大于受体(供肝湿质量平均超过受体肝40%)，造成术中术野受遮挡严重手术难度加大，同时由于复流后移植肝内血量超过原受体肝血量致体循环不稳，使建模失败率增加，所以课题组改良手术方案，进行切除供肝左外叶的减体积肝移植术，使移植术野暴露充分，同时增加回心血量维持受体循环平稳。

本实验减体积肝移植术是切除了大鼠肝脏的左外侧叶，占肝脏总体积的30%，在体外完成肝叶切除。大鼠肝部分切除术模型是Higgins等^[7]首先创建，主要应用于肝脏肿瘤、肝脏再生和肝脏移植等模型的研究。大鼠肝脏相对独立的管道系统比较容易绕线以阻断血流或结扎肝蒂行肝叶切除。肝乳头叶、左叶切除较容易，但左内叶与中叶头侧部分相连，切除整个左叶孔引起出血，肝右外叶和三角叶包绕下腔静脉，且有较多微小静脉直接开口下腔静脉，不易彻底切除。权衡之下，作者选择了切除肝左外叶，既能减少切除后创面出血的概率，同时因左外叶占各叶体积百分比之首，能达到减小供体体积及含血量的双重目的，切除所需时间也最短，可尽量减少不必要的冷保存时间。虽然肝左外叶容易切除，但应仔细避免结扎管道系统时扎到中叶及左内叶肝门血管的分支，导致左内叶及左中叶缺血^[8]。本课题组的方法是尽可能贴近左外叶肝实质内结扎管道系统，即使切除后近端残留少许肝组织，因其管道系统已完全离断，不会发生出血。供肝肝叶切除的减体积过程是在体内取肝时完成还是体外修肝时完成也是一个存在争议的问题。在体内进行有利于及时发现肝断面出血或血液回流障碍等问题，方便补救^[9]。但切除过程中对供肝的翻动、挤压、牵拉等会造成肝组织不同程度的淤血，导致灌注效果不好，供肝出现花斑样改变，影响其质量；体外进行的肝切除也称离体肝切除术，是由德国汉诺威器官移植中心的Pichlmaryr等^[10]最早提出。离体肝切除自体肝移植术还为部分难以切除的肝脏肿瘤提供了新的手术思路，而后也在动物实验中展开研究。在体外进行肝切除，不用考虑切除过程中引起出血的问题，而且肝脏漂浮在冷灌注液中，不易被牵拉撕裂或挤压到，容易操作；切除肝叶时不用再分离肝脏周围韧带及其他组织，可避免损伤周围结构，同时缩短了切肝耗时。

为保证减体积肝移植模型质量能达到原体积肝移植模型水准，作者对两组受体大鼠术中术后指标进行了对比。移植肝恢复灌注后，将两组大鼠呼吸频率、心率及大血管充盈情况进行比较，减体积组受体大鼠呼吸、心率每分钟次数明显少于全体积组(P < 0.05)，下腔静脉充盈也较好，这主要是由于减体积部分肝脏的存血量进入循环，增加了受体大鼠的循环血量，保证了全身各脏器血供，而全体积组受体大鼠术中失血加上供肝增大体积部分的存血，使得有效循环血量减少，故引起呼吸心率增快，大血管部分塌陷，甚至低血容量性休克，这对于术中和术后早期大鼠生命体征的维持非常不利，即使术后给予补液改善容量不足，但对于机体组织供氧疗效不佳。从两组模型手术时间比较来看，减体积组受体手术时间、无肝期时间、供肝冷保存时间均明显短于全体积组，修肝时间长于全体积组，综合比较，减体积组大鼠手术时间特别是供肝冷缺血时间、无肝期时间明显缩短，更有利于提高模型建立成功率，其优势主要在于无肝期供肝体积的明显减小，下腔静脉吻合和双袖套套管视野清晰，便于操作，很多为了暴露术野的多余动作省略，节省了时间，也降低了无肝期较长带来的诸多并发症的概率。Kaplan-meier法生存分析曲线显示，术后24 h后，两组大鼠存活概率相似，但术后早期全体积组大鼠死亡率较高，分析原因主要是术野暴露困难致部分肝上下腔静脉吻合针距不均匀、吻合口张力过大致开放后呼吸运动膈肌上下牵拉致静脉撕裂出血或血管排气不彻底致空气栓塞及低血容量引起休克。术后存活的大鼠中，比较其术后4，24 h肝功能谷丙转氨酶、总胆红素指标情况，两

组变化差异无显著性意义；病理组织切片变化均为肝细胞片状坏死、炎性细胞浸润、肝细胞大泡性脂肪变性及肝细胞条索排列紊乱等相似表现，说明两组脂肪肝供肝大鼠肝移植模型建成功后，其大鼠模型在生理、病理各方面病变相似，减体积肝移植并未对模型质量产生影响。

因此在经典“二袖套法”基础上，建立的脂肪肝供肝大鼠减体积肝移植模型稳定可靠，并未增加受体大鼠的死亡率及肝功能不全，解决了脂肪肝供肝全体积肝移植术中术野暴露不清、术后致受体大鼠循环失稳的问题，是研究脂肪肝供肝肝移植的理想动物模型。

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[1]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[4]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[5]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[6]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[7]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[8]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[9]	白胜超, 高扬, 王博, 李俊平, 王瑞元. 针刺干预大负荷运动损伤模型大鼠骨骼肌线粒体功能的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3648-3653.
[10]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[11]	徐伟龙, 左媛, 辛大奇, 贺晨阳, 赵鹏, 史鸣, 周博源, 刘雅婷, 赵岩. 急性钳夹型脊髓损伤模型大鼠造模方式的选择：一项网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3767-3772.
[12]	董丽萍, 罗怀青, 袁衡, 龙娟, 许少辉. 增龄对大鼠缺血后肢侧支血管生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3156-3161.
[13]	王朝格, 翁锡全, 林宝璇, 陈丽娜, 徐国琴. 低温运动干预肥胖大鼠的脂肪组织类型及功能改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3162-3167.
[14]	崔田田, 易岚, 欧阳厚淦, 吴慧婷, 欧阳彦楚, 陈楚. 热敏灸对盆腔炎症模型大鼠影响的三焦焦膜理论分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3168-3172.
[15]	李平, 林煜, 陈翔, 刘振涛, 肖莉莉, 林学义, 华鹏. 二至丸提取物干预去势骨质疏松雌性模型大鼠的骨重建特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 191-195.