不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.23.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量实验显示心肌损伤后，趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞。
目的：观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况。
方法：选用3月龄日本大耳白兔39只，均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组，3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞。对照组分为3个亚组，分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水。4周后处死动物，取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。
结果与结论： ①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连，并可见明显的横纹和肌小节。②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05)，其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组。③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达，且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾，但均未见有分化趋势和恶性细胞表达。结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生，除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达，但仍以目的器官表达为主

关键词: 心肌梗死, 骨髓, 心肌再生, 细胞移植, 干细胞, 兔

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that chemotaxis or direct intramyocardial injection of bone marrow stem cells can differentiate into myocardial cells, vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells in vivo following myocardial damage.

OBJECTIVE: To observe distribution, growth and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplanted by different methods in vitals.

METHODS: A total of 39 Japanese rabbits aged 3 months were selected to establish animal models of acute myocardial infarction, and then randomly divided into four groups. Three experimental groups were injected with BrdU-labeled autologous BMSCs through direct injection in myocardium, coronary artery injection and intravenous injection. The control group contained three subgroups, which were separately treated with an equal volume of saline through direct injection of coronary artery, vein and myocardium. At 4 weeks, animals were sacrificed to obtain heart, lung, liver and kidney to make tissue sections. BrdU-positive cells and BrdU- and α-striated muscle actin-positive cells were observed.

RESULTS AND CONCLUSION: ①BMSCs labeled with BrdU and BrdU + α-striated muscle actin were found in and surrounding the infarct in each experimental group. Some of them had been connected with host myocardium and each other, with obvious transverse striation and sarcomere. ②The density of blood capillary increased in each experimental group compared with the control group (P < 0.05). The effectiveness sequence was coronary artery injection group, myocardium injection group and vein injection group from good to poor. ③The cells labeled with BrdU were found in the liver, lung and kidney of two groups which were transplanted through coronary artery and vein. Moreover, numbers of BrdU-positive cells were more in the lung than in the liver and kidney of the vein injection group. But, they did not differentiate and there were no tumor cells. Results have suggested that all three transplanting methods can induce regeneration of myocardial cells and blood capillaries in and surrounding the infarct region. Except myocardium injection group, BrdU-positive cells can be determined in non-target organs, but still mainly expressed in target organs.

中图分类号:

R394.2

郭启仓，王玉芳，张宇，邬鹏宇，唐焕峰，刘志勇，李占清. 不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(23): 4275-4280.

Guo Qi-cang, Wang Yu-fang, Zhang Yu, Wu Peng-yu, Tang Huan-feng, Liu Zhi-yong, Li Zhan-qing. Distribution and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into vitals using different methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(23): 4275-4280.

参考文献

引言

材料方法

讨论

在成熟个体中，心肌细胞属于终极分化细胞，无再生和分化能力，心肌梗死后，残存心肌的代偿性肥大以及梗死心肌的纤维化最终发展为心脏衰竭。再灌注治疗不能根本上解决微循环堵塞和再灌注损伤所导致的心肌细胞的死亡。心脏移植作为终末治疗手段，也受到免疫排斥、供体不足等诸多因素的限制。根据美国心脏病协会统计资料表明，37%的患者在经历1次冠状动脉事件后1年内发生死亡，7%~22%的男性和12%~25%女性在心肌梗死后5年时间内出现心力衰竭^[4]。因此，迫切需要新的有效的治疗策略应用于心肌梗死的临床治疗。所以如何提高具有收缩功能的心肌细胞数量和质量以恢复心脏的正常结构和功能是临床上最急切、也是最合理的思考。从目前研究状况看，干细胞移植技术或许能满足这一人类美好的愿望。 BMSCs是目前研究和使用最多的种子细胞，已经从基础研究阶段步入临床试验，在治疗先天性成骨不全症，黏多糖累积病，移植物抗宿主反应等疾病中已有成功应用报道，特别是在心血管再生医学研究当中，以BMSCs移植为基础的崭新治疗策略更是吸引了广大心血管研究者的注意力^[5-7]，已公认BMSCs不仅能自我复制，而且具有多向分化潜能，在一定条件下确能分化成心肌样细胞^[8-13]。BMSCs不仅具有极大的体外扩增潜能，经过适当的传代培养也不会丧失其正常的核型和端粒酶活性^[14]，弥补了BMSCs在骨髓中含量低(在1×10⁶个骨髓单个核细胞中仅有2~5个MSCs)的不足。本工作证实，BMSCs经两三代培养细胞数可达1×10⁸，完全能满足组织工程要求的细胞数量。直视下心肌内直接注射移植是目前绝大多数动物实验采用的方式，方法可靠，效果满意。但因开胸创伤大，并发症多，在临床上可能不是一种理想的方法。然而，如果患者在施行CABG或其他心脏手术时，同时运用则不失为一种好方法。本实验结果提示，该方法移植效果优于静脉注射，不及经冠脉注射，但其最大优点是非目的器官无BMSCs植入，是其他两种方法不能比拟的。冠脉内注射移植具有不需要开胸手术、高选择性和微创等特点，有利于在目前的医疗设备条件下开展临床研究和应用^[15]。在van den Bos等^[16]所述的BOOST研究中，经冠脉内注射骨髓干细胞后试验组射血分数由50.0%增加到56.7%。Wang等^[17]在实验中将非诱导的MSCs注入升主动脉(远端暂时夹闭)，细胞经冠状动脉进入心肌组织，移植后即刻在非梗塞区毛细血管中发现植入细胞。在本实验中作者参照该方法，短时阻断升主动脉远端，迅速用微量注射器经升主动脉根部注入BrdU标记的BMSCs。作者发现注射瞬间带有颜色标记的注射液即可通过冠脉进入心肌，而且阻断升主动脉20s不会对实验动物造成太大损伤。实验结果提示，经冠脉注射移植的效果是所有3种方法中最好的，如果临床研究中使用介入技术，先开通阻塞血管再选择性地经靶血管注射，效果可能会更好。但非目的器官也有BrdU阳性的细胞植入是其缺点。经外周静脉注射移植具有方法简便、安全、价廉、更微创、可操作性强等优点。经静脉注射移植严格讲属全身移植，选择性差，因此非目的器官也有BrdU阳性细胞植入，而且较冠脉移植者明显。静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾，这可能与血液流向有关，移植细胞最先到达肺脏，但心肌内BrdU阳性细胞仍然是最多的。组织学观察显示经3种不同方法移植BMSCs后，心肌组织中均可检测到相当数量的BrdU表达阳性细胞及BrdU和α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞，而且与其周围心肌细胞排列方向一致。高倍镜下，BrdU阳性细胞之间以及与宿主心肌细胞之间均有突起相连，并可见明显的横纹和肌小节。BrdU阳性细胞在心肌中广泛分布，但主要分布在梗死心肌周边区，少量分布于梗死区域，说明BMSCs在某些细胞因子、尤其坏死细胞释放物等因素的作用下，确有“归巢”或称“回家”功能。其生理机制有如下可能，急性心肌梗死发生后，损伤局部存在炎症反应，可表达多种趋化因子如白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1、基质细胞衍生因子1、肿瘤坏死因子等，同时，血管内皮细胞多种黏附分子表达上调。心肌梗死造成的这一系列微环境改变可能是干细胞归巢的始动因素，Helmuth^[18]称之为“干细胞听到损伤组织的召唤”；也有研究认为，干细胞归巢于缺血组织的过程：循环血中的干细胞在损伤局部由流动状态转为滚动状态，然后与内皮细胞黏附，再穿过内皮细胞迁移，黏附定位于缺血组织^[19]。大量实验显示心肌损伤后，趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞^[20]，这与本实验结果大致相同。干细胞的分化不是单个细胞的孤立行为，是在一定条件下发生的。Liechty等^[21]将人的MSCs进行宫内胎羊异种异体移植，发现移植的细胞位点专一性地分化为软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胸腺细胞。表明MSCs在异基因动物仍然能够存活，并环境依赖性地分化为不同组织细胞，而分化成什么样的细胞，取决于MSCs所在的组织微环境而不是其DNA编码，微环境的作用是使细胞的静止基因活化从而产生所谓的跨系分化。干细胞处于三维空间结构中，受到细胞-细胞、细胞-细胞外基质间相互作用的影响，对环境中的调节信号作出反应，甚至机械作用力也可能影响其分化的方向和进程。Orlic等^[22]则认为使MSCs向心肌细胞分化的信号可能来自损伤的心肌，这些信号分子促进BMSCs向心肌缺血坏死区域迁移、增殖和分化。干细胞因子作为c-kit的配体，被认为参与了造血干细胞和其他原始细胞向靶器官的迁移。在随后的研究中，Orlic等^[23]用重组鼠干细胞因子、重组人粒细胞集落刺激因子给小鼠注射，9 d后，超声心动图检测表明：心功能得到明显改善，梗死面积平均下降40%，死亡率下降68%。证实了干细胞因子和粒细胞集落刺激因子对MSCs的迁移、聚集和促分化作用。也有作者认为，组织损伤所产生的炎症信号如肿瘤细胞坏死因子可能促进了干细胞向损伤局部的迁移和分化^[24]。这一点可以解释经静脉注射移植虽然非目的器官也有标记阳性的细胞植入，而且移植细胞最先经过肺脏，但聚集标记阳性细胞最多的还是目的器官的目的区域。 Kobayashi等^[15]发现小鼠心脏植入骨髓基质细胞后植入的细胞具有明显的诱导血管新生作用。Asahara及同事^[26]发现急性心肌梗死后骨髓源性循环内皮祖细胞进入梗死边缘区，并与梗死边缘区的芽生血管形成相关，提示骨髓基质细胞参与梗死区新生血管形成。这些研究结果提示将骨髓干细胞移植到梗死区域，植入细胞感受植入区微环境的变化，发生微环境依赖性分化，形成包含内皮细胞在内的新生组织(心肌)并刺激血管再生，增加局部血流灌注，提高梗死区室壁厚度，增加整体心脏功能^[27-29]。本实验结果显示：BMSCs经上述3种途径中的任何一种移植后，其梗死区及边缘区新生毛细血管密度较对照组均有增加，在各实验组新生的毛细血管中均发现有BrdU阳性的内皮细胞。提示植入的MSCs可能参与植入区血管再生，或是参与血管壁内皮损伤的修复，促进梗死区侧枝循环的建立，进一步提高梗死区局部心肌组织血流灌注，这对残存心肌的保护、移植细胞的成活和分化都有积极意义^[30-31]。

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