2.1   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的理化特性表征   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的粒径主要集中在(79.42±23.12) nm，透射电镜下呈现典型的杯状囊泡结构。Triton X-100裂解实验显示其裂解率呈浓度依赖性，约90%的颗粒可被裂解，表明多数颗粒具有膜结构。经蛋白酶K、DNA酶 I和RNA酶 A处理后，证实金银花源性细胞外囊泡样颗粒内含蛋白质、RNA，脂质薄层分析显示其含多种脂质。经模拟胃液和肠液消化30 min后，金银花源性细胞外囊泡样颗粒浓度分别保持在70%和90%以上，表明其具有良好的胃肠消化抵抗力。见图1。



2.2   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的生物相容性   CCK-8实验结果显示，金银花源性细胞外囊泡样颗粒在12，24，48 h内对RAW 264.7细胞生长无显著影响，表明其具有良好的生物相容性，对细胞活力无明显抑制作用。共聚焦显微镜下观察到DiI荧光标记的金银花源性细胞外囊泡样颗粒在RAW264.7细胞内呈现明显的内化现象，主要分布在细胞核周围的细胞质中，流式细胞术显示8 h摄取率超过90%，表明金银花源性细胞外囊泡样颗粒具有良好的细胞摄取效率。见图2。



2.3   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的体外抗炎活性   RT-qPCR和ELISA分析显示，与正常对照组相比，模型组白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2的mRNA表达和细胞上清中白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2水平显著升高(P < 0.000 1)。与模型组相比，金银花源性细胞外囊泡样颗粒组白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2的mRNA表达和细胞上清中白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2水平显著降低，且表现出浓度依赖性(P < 0.000 1)。
此外，阳性对照组和金银花汤剂组同样显著降低了这些炎症递质的表达，且阳性对照组优于金银花源性细胞外囊泡样颗粒组，而金银花源性细胞外囊泡样颗粒组优于金银花汤剂组。见图3。



2.4   金银花源性细胞外囊泡样颗粒对巨噬细胞极化的影响   流式细胞术结果显示，与正常对照组相比，脂多糖和干扰素γ诱导后，巨噬细胞CD86表达显著增强，表明细胞向M1型极化。与模型组相比，金银花源性细胞外囊泡样颗粒和地塞米松均显著降低了CD86+细胞率(P < 0.000 1)，且高浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒的抑制效果与地塞米松相当。ELISA检测显示，与正常对照组相比，模型组CD86水平显著升高，而CD206和白细胞介素10水平显著降低(P < 0.000 1)。与模型组相比，不同浓度的金银花源性细胞外囊泡样颗粒组、阳性对照组和金银花汤剂组均能显著抑制CD86的升高(P < 0.000 1)，并显著提高CD206和白细胞介素10水平，其中高剂量金银花源性细胞外囊泡样颗粒组优于其他两组。见图4。



2.5   转录组学分析金银花源性细胞外囊泡样颗粒的抗炎机制   转录组学分析揭示了金银花源性细胞外囊泡样颗粒对脂多糖诱导炎症反应的调节机制。主成分分析结果显示，正常对照组、模型组和囊泡组在基因表达模式上明显分离。与正常对照组相比，模型组的RAW264.7细胞基因表达发生显著变化，共鉴定出2 835个差异基因，其中1 714个上调，1 121个下调。金银花源性细胞外囊泡样颗粒干预后，囊泡组细胞基因表达出现逆转，与模型组相比，共鉴定出476个差异基因，其中108个上调，368个下调，表明金银花源性细胞外囊泡样颗粒对脂多糖诱导的炎症反应具有显著的调节作用。差异火山图进一步展示了这些基因的表达变化。见图5。



GO分析显示差异基因在免疫反应、炎症反应和对脂多糖的细胞反应等生物过程中富集，整体下调，提示金银花源性细胞外囊泡样颗粒抑制脂多糖诱导的炎症反应。在分子功能层面，差异基因在细胞因子活性和趋化因子活性中富集，其下调表明金银花源性细胞外囊泡样颗粒通过调节这些分子活性减轻炎症。此外，差异基因在丝状伪足和吞噬小泡中富集，可能与细胞运动性和吞噬作用有关。为了进一步探讨金银花源性细胞外囊泡样颗粒的抗炎机制，采用KEGG分析差异基因显著富集的通路。结果显示，差异基因显著富集于肿瘤坏死因子、核因子κB和Toll样受体信号通路，这些通路在炎症反应中起关键作用，提示金银花源性细胞外囊泡样颗粒可能通过调节这些通路减轻脂多糖诱导的炎症反应。见图6。



为了深入探究金银花源性细胞外囊泡样颗粒对相关信号通路的调控作用，采用RT-qPCR和Western blot实验进行验证。结果显示，与正常对照组相比，模型组显著上调了肿瘤坏死因子α、Toll样受体4和核因子κB的mRNA表达水平(P < 0.000 1)；与模型组相比，囊泡组显著抑制了这些因子的mRNA上调(P < 0.001)。Western blot实验进一步证实，与对照组相比，模型组中Toll样受体4和核因子κB蛋白表达水平升高(P < 0.001和P < 0.01)；而囊泡组相较模型组显著降低了这两种蛋白的表达(P < 0.05)。这些结果表明，金银花源性细胞外囊泡样颗粒可能通过下调核因子κB信号通路和Toll样受体信号通路相关蛋白的表达，进而有效减轻细胞内的炎症反应。见图7。

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炎症是机体对损伤、感染等有害刺激的防御反应，旨在清除有害因素、修复受损组织并恢复生理功能。若炎症失控或持续过久，可能引发多种疾病[1]，如心血管疾病中的动脉粥样硬化[2]、糖尿病中的胰岛素抵抗[3]、神经退行性疾病中的神经炎症[4]、自身免疫性疾病中的组织损伤[5]、癌症等[6]。现有抗炎药物包括非类固醇抗炎药、糖皮质激素和生物制剂等。非类固醇抗炎药可缓解炎症症状，但长期使用有胃肠道出血、溃疡等风险[7]；糖皮质激素抗炎效果显著，却可能引发骨质疏松、糖尿病、高血压等不良反应[8]；生物制剂虽具有高特异性和疗效，但价格较高且可能诱发免疫反应[9]。因此，研发更安全、有效的抗炎药物是当下的研究重点。
近年来，越来越多的研究表明，中药制剂具有抗炎作用，且与传统抗炎药物相比，具有价格较低、更易获得、安全性较高、不良反应较少的优点[10-11]。金银花是临床中常见的抗炎药物之一，研究表明，金银花提取物通过抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)以及细胞核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路，有效抑制炎症细胞分泌白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧化酶2等炎症递质，从而发挥显著的抗炎作用[12-14]。尽管金银花等传统中药在抗炎治疗中具有确切的疗效，但中药提取物在临床治疗时面临诸多挑战。例如，绿原酸等中药提取物的吸收效率较低且在代谢过程中容易被清除，导致药物在靶部位的浓度不足，从而影响治疗效果[15-16]；静脉注射含绿原酸中药注射液可能引发致敏反应，并且可能增强药物的毒副作用[17]。
如何有效解决中药提取物的临床应用瓶颈，成为当前亟待解决的课题。现代中草药囊泡技术成为潜在改良手段，它来源于中草药细胞外液或汁液，直径40-160 nm，为磷脂双分子层镶嵌功能蛋白的囊泡型微结构，包含核酸、蛋白质、脂质等多种天然活性物质。中草药囊泡具有来源丰富、产量多、生物相容性优良、不易被体内分解、携带原中药药效成分、载药性能优越等优点，能够跨越生理屏障，在跨物种细胞间进行生物信息交换，在病变部位直接发挥药理作用[18-19]。
与合成纳米粒子相比，中草药囊泡具有更低的免疫原性和更高的生物相容性，能够有效减少药物对正常组织的不良反应[20]，其双层膜结构可以保护药物免受外界环境的干扰，提高药物的稳定性和生物利用度[21]。此外，中草药囊泡的纳米级特性使其能够实现药物的精准递送和控释，减少药物在全身的分布，从而降低不良反应[22]。这些特性使中草药囊泡在药物递送领域具有广阔的应用前景，有望成为未来药物递送的重要平台。
此研究提取并表征了金银花源性细胞外囊泡样颗粒。实验表明，金银花源性细胞外囊泡样颗粒具有显著的抗炎活性，转录组学分析进一步揭示了其抗炎机制，为抗炎药物的研发提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的提取与鉴定、生物相容性分析、体外抗炎实验、转录组学分析。
1.2   时间及地点   实验于2023年6月至2025年4月在中草药囊泡广东省工程研究中心完成。
1.3   材料   金银花购自国药集团冯了性(佛山)药业有限公司。BCA(二喹啉甲酸法)试剂盒、 DNase I(D7073)、RNase A(ST576)、蛋白酶K(ST535-100mg)均购自Beyotime生物技术有限公司(北京，中国)；外泌体特异性裂解液(UR33101)购自Umibio科技集团(上海，中国)；蛋白电泳 Marker(abs923)购自Absin生物科技有限公司(上海，中国)；反转录试剂PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047Q)、RNA Marker(3587A)均购自Takara Biomedical Technology有限公司(北京，中国)；miRNeasy Mini Kit(217004)购自QIAGEN公司(德国)；PBS(G4202-500ML)、胎牛血清(G8002-500ML)、DMEM高糖培养基(PM150210)均购自Servicebio生物技术有限公司(武汉，中国)；脂多糖购自Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading有限公司(上海，中国)；地塞米松购自Beijing Mayoda Technology有限公司(北京，中国)；PE Anti-Mouse CD86 Antibody (E-AB-F0994D)、干扰素γ、Triton X-100(E-IR-R122)、CCK-8 试剂、细胞膜红色荧光探针(DiI)(C1306)均购自Elabsciences生物科技股份有限公司(武汉，中国)；FITC标记鬼笔环肽(CA1620)、DAPI溶液(28718-90-3)均购自Solarbio科技有限公司(北京，中国)；PCR引物由Beijing Tsingke Biotech有限公司合成；UltraSYBR Mixture (High ROX)(CW2602S)购自北京康为世纪生物科技有限公司(北京，中国)；小鼠白细胞介素6 ELISA检测试剂盒(JL20268-96T)、小鼠白细胞介素1β ELISA 检测试剂盒(JL18442-96T)、小鼠环氧化酶2 ELISA检测试剂盒(JL45838-96T)、小鼠CD86 ELISA 检测试剂盒(JL29533-96T)、小鼠CD206 ELISA检测试剂盒(JL20140-96T)、小鼠白细胞介素10 ELISA检测试剂盒(JL20242-96T)均购自上海江莱生物科技有限公司(上海，中国)；快速高分辨电泳缓冲液(G2149-1L)、免冰浴快速转膜缓冲液(G2148-1L)、β-actin(ZB15001-HRP-100)抗体均购自 Servicebio生物技术有限公司(武汉，中国)；核因子κB p65抗体(10745-1-AP)、Toll样受体4抗体(19811-1-AP)均购自Proteintech有限公司(武汉，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的提取与鉴定
(1)金银花源性细胞外囊泡样颗粒的提取：采用超速离心法提取金银花源性细胞外囊泡样颗粒。具体步骤：将金银花中药干品与PBS按100 g∶2 000 mL的比例混合，浸泡30 min，使用破壁机榨取汁液，榨取时间为5 min；随后，将榨取的汁液置于4 ℃环境下，以3 000×g离心30 min，去除大植物组织和细胞碎片；使用超滤法进行浓缩，使用抽真空泵和0.22 µm滤膜对上清液进行过滤，取滤液至新的离心管中，于4 ℃超速离心机中以100 000×g离心70 min，弃去上清液，用1 mL PBS重悬沉淀，得到金银花源性细胞外囊泡样颗粒重悬液，将其冻存于-80 ℃冰箱中备用。
(2)透射电镜观察金银花源性细胞外囊泡样颗粒的形态：将提取出来的纳米粒子5-10 μL滴加于铜网上，沉淀3 min，用滤纸从边缘处吸去浮液，PBS漂洗后使用磷钨酸室温负染，常温干燥5 min，上机成像(电镜操作电压80-120 kV)，透射电镜观察并照相。
(3)纳米流式细胞检测仪检测纳米粒子的粒径和浓度：采用纳米流式细胞检测仪检测金银花源性细胞外囊泡样颗粒的粒径和浓度，自动生成粒径分布直方图。
(4) Triton X-100裂解实验：取500 μL稀释后的纳米粒子与500 μL用PBS稀释的不同浓度Triton X-100溶液，充分混匀，室温孵育30 min，用纳米流式细胞检测仪检测样品的粒子浓度。以加入500 μL PBS的样品作为对照，统计不同浓度Triton X-100溶液处理后剩余纳米粒子所占的比例。
(5)蛋白凝胶电泳鉴定金银花源性细胞外囊泡样颗粒的蛋白：①蛋白提取：将金银花源性细胞外囊泡样颗粒与裂解液按体积比1∶1混匀后置于冰上裂解10 min，于4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清，按照BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。②蛋白酶K处理蛋白样品：取16 μL金银花源性细胞外囊泡样颗粒蛋白样品分别与4 μL蛋白酶K(1 mg/mL)或PBS混匀；取16 μL PBS和4 μL蛋白酶K(1 mg/mL)混匀，作为对照；将上述样品在58 ℃孵育3 h。③蛋白凝胶电泳：按照生产厂商的说明书配制10% PAGE凝胶，分别取蛋白Marker和上述样品10 μL加入凝胶孔中，恒压120 V条件下电泳 60-90 min。④银染：将电泳后的凝胶置于固定液(25 mL无水乙醇、5 mL醋酸和20 mL超纯水混合)中固定40 min，以确保蛋白质条带稳定，防止后续操作中条带扩散或变形；使用30%无水乙醇漂洗凝胶10 min；使用100 mL纯水漂洗凝胶10 min；将凝胶置于增敏液(0.5 mL银染增敏液和49.5 mL超纯水混合)中增敏2 min；使用100 mL纯水漂洗凝胶2次，每次漂洗1 min；将凝胶置于银染液(0.5 mL银溶液和49.5 mL超纯水混合)中染色10 min；使用100 mL纯水漂洗凝胶，漂洗时间小于1.5 min；将凝胶置于显色液(5 mL银染基本显色液、25 µL银染显色加速液和45 mL超纯水混合)中显色3-7 min；将凝胶置于终止液(0.25 mL银染终止液和47.5 mL超纯水混合)中终止10 min；使用100 mL纯水漂洗凝胶5 min；使用凝胶成像系统对染色后的凝胶进行拍照记录，分析蛋白质条带的分布和强度。
(6)核酸电泳鉴定金银花源性细胞外囊泡样颗粒的核酸：①样品准备：取适量金银花源性细胞外囊泡样颗粒样本，分别加入DNase I和RNase A处理，以检测样本中是否存在DNA和RNA成分。②核酸酶处理：将金银花源性细胞外囊泡样颗粒样本分为4组，每组39 µL。其中2组分别加入5 µL DNase I和5 µL DNase Reaction buffer，用于降解DNA；另外2组分别加入1 µL RNase A和1 µL RNase Reaction buffer，用于降解RNA。设置对照组，分别加入11 µL PBS和1 µL RNase A，以排除试剂本身的干扰。③反应条件：将上述处理后的样本在37 ℃下孵育30 min，确保核酸酶充分作用。④琼脂糖凝胶电泳检测：反应结束后，取适量处理后的样本进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过电泳条带的有无及位置，判断金银花源性细胞外囊泡样颗粒中是否存在核酸成分。
(7)薄层色谱分析鉴定金银花源性细胞外囊泡样颗粒的脂质：分别取金银花源性细胞外囊泡样颗粒与氯仿和甲醇以3∶8∶4的比例混匀，10 000×g离心10 min，得到3层成分：上层(水+甲醇相)、中层(蛋白沉淀相)、下层(有机相)，将上层与中层的物质小心弃去；将上述步骤得到的下层液体进行100 ℃干燥得到非极性脂质，加入适量氯仿重悬；点板(硅胶G板)上样，用微量吸管将所有样本点到板上；使用展开剂(氯仿∶甲醇∶乙酸=190∶9∶1)将板内的脂质延展至板⅔处；使用显色剂进行显色，再将板放至100 ℃碳化。
(8)金银花源性细胞外囊泡样颗粒的胃肠稳定性评估：配制模拟胃液(0.1 mol/L HCl溶液，pH 1.2，含1 mg/mL胃蛋白酶)和模拟肠液(0.1 mol/L PBS，pH 7.4，含1 mg/mL胰蛋白酶)，使用纳米流式细胞仪检测金银花源性细胞外囊泡样颗粒样品粒子数并稀释至一定初始浓度，分别加入模拟胃液和肠液中，在37 ℃下孵育30 min后再次检测粒子浓度。通过比较不同时间点的颗粒浓度，计算颗粒浓度的保留率，以评估金银花源性细胞外囊泡样颗粒在模拟胃肠消化环境中的稳定性。
1.4.2   细胞培养   RAW264.7小鼠巨噬细胞系购自浙江美森细胞科技有限公司(中国浙江)。RAW 264.7细胞在含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，培养条件为37 ℃、体积分数5% CO₂的恒温加湿培养箱。
1.4.3   金银花源性细胞外囊泡样颗粒的生物相容性实验
(1)CCK-8实验：RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞密度接种于96孔板，过夜后换为含不同浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒(0，5×106，5×107，5×108，5×109，5×1010颗粒/mL)的无血清培养基，共孵育12，24，48 h。孵育结束，PBS洗去多余金银花源性细胞外囊泡样颗粒，加CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，在酶标仪450 nm波长处测吸光度值，计算细胞活力。
(2)细胞摄取实验：使用DiI(橙红色荧光探针)对金银花源性细胞外囊泡样颗粒进行标记。将5 μL 1 mg/mL DiI溶液与含1×1010个粒子的金银花源性细胞外囊泡样颗粒悬浮液混合，在37 ℃下避光孵育30 min，随后100 000×g离心70 min去除未结合的DiI，用PBS洗涤沉淀3次，得到纯化的DiI标记金银花源性细胞外囊泡样颗粒，并用流式纳米分析仪测定颗粒浓度。
将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞密度接种于6孔板和玻璃底培养皿中，孵育过夜，细胞在无血清培养基中与5×108粒子/mL DiI标记的金银花源性细胞外囊泡样颗粒在37 ℃下孵育2，4，8 h。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次以去除残留的金银花源性细胞外囊泡样颗粒，重悬于PBS中进行流式细胞术分析。此外，玻璃底培养皿培养的细胞用多聚甲醛溶液固定20 min，DAPI染色观察细胞核，FITC染色观察细胞骨架。使用共聚焦显微镜(牛津仪器Andor，BC43，英国)捕获细胞荧光图像，分析金银花源性细胞外囊泡样颗粒在细胞内的摄取、分布及与细胞骨架的相互作用。

1.4.4   体外抗炎实验   将RAW264.7细胞以每孔2×105个细胞密度接种至6孔板，孵育过夜。按以下分组配制药液：正常对照组(新鲜培养基)、模型组(1 µg/mL脂多糖溶液)、阳性对照组(1 µg/mL脂多糖溶液+5.0 µmol/L地塞米松溶液)、囊泡组(1 µg/mL 脂多糖溶液+不同浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液，粒子浓度分别为5×107，5×108颗粒/mL)、金银花汤剂组(1 µg/mL脂多糖溶液+1.5 mg/mL金银花汤剂溶液)。囊泡粒子浓度为预实验中根据疗效选出的最佳组合，金银花汤剂浓度根据囊泡粒子浓度参照等量消耗原则进行转化，且转化后的浓度在既往研究中被证实具有显著抗炎疗效[23]。各孔更换相应药液，继续培养24 h。培养结束后，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求检测白细胞介素6、白细胞介素1β、环氧化酶2水平；收集细胞沉淀，提取总RNA并反转录为cDNA，RT-qPCR检测白细胞介素6、白细胞介素1β、环氧化酶2 mRNA表达。RT-qPCR条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算相对表达量。各基因及内参序列引物见表1。

1.4.5   RAW 264.7细胞极化实验  
(1)流式细胞仪检测细胞表面标志物：将RAW264.7细胞以每孔2×105个细胞密度接种至6孔板，孵育过夜。配制以下药液：空白组(新鲜培养基)、正常对照组(新鲜培养基)、模型组(1 µg/mL脂多糖溶液+50 ng/mL干扰素γ溶液)、阳性对照组(1 µg/mL脂多糖溶液+5.0 µmol/L地塞米松溶液)、囊泡组(1 µg/mL脂多糖溶液+50 ng/mL干扰素γ溶液+不同浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液，粒子浓度分别为5×107，5×108颗粒/mL)。将各孔更换为相应药液，继续培养24 h。培养结束后，取细胞沉淀，加入5%抗小鼠CD86抗体溶液(空白组加入等量PBS)，重悬后避光4 ℃孵育30 min，使用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达水平。
(2) ELISA检测巨噬细胞极化标志物：将RAW264.7细胞以每孔2×105个细胞密度接种至6孔板，孵育过夜。按以下分组配制药液：正常对照组(新鲜培养基)、模型组(1 µg/mL脂多糖溶液+50 ng/mL干扰素γ溶液)、阳性对照组(1 µg/mL脂多糖溶液+5.0 µmol/L地塞米松溶液)、囊泡组(1 µg/mL脂多糖溶液+50 ng/mL干扰素γ溶液+不同浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液，粒子浓度分别为5×107，5×108 颗粒/mL)、金银花汤剂组(1 µg/mL脂多糖溶液+50 ng/mL 干扰素γ溶液+1.5 mg/mL金银花汤剂溶液)，各孔更换为相应药液，继续培养24 h。培养结束后，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求检测巨噬细胞标记物CD86、CD206、白细胞介素10水平。
1.4.6   转录组学分析金银花源性细胞外囊泡样颗粒的抗炎机制  
(1)炎症模型建立：将RAW264.7细胞以每孔5×106个细胞密度分别接种至3个100 mm培养皿中，孵育过夜。按以下分组配制药液：正常对照组(新鲜培养基)、模型组(1 µg/mL脂多糖溶液)、囊泡组(1 µg/mL 脂多糖溶液+5×108颗粒/mL金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液)。各培养皿更换相应药液，继续培养24 h。培养结束后，收集细胞沉淀并进行细胞计数。
(2)转录组学分析：①RNA提取：按说明书要求加入TRIzol溶液提取总RNA，NanoDrop测定浓度和纯度，Agilent Bioanalyzer评估完整性。②转录组测序文库制备：从1 µg总RNA起始，提取mRNA并合成双链cDNA，末端修复后连接接头，AMPure XP磁珠纯化，USER酶处理，PCR扩增，Illumina NovaSeq平台测序。③数据分析：BMKCloud平台质量控制，Hisat2比对参考基因组，StringTie预测新转录本，Nr等数据库注释基因功能，FPKM公式量化表达水平，DESeq2或edgeR分析差异表达，KEGG分析差异基因主要聚集通路。

(3) RT-qPCR验证：将RAW264.7细胞以每孔2×105个细胞密度接种至6孔板，孵育过夜。按以下分组配制药液：正常对照组(新鲜培养基)、模型组(1 µg/mL脂多糖溶液)、囊泡组(1 µg/mL 脂多糖溶液+5×108 颗粒/mL金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液)。各孔更换相应药液，继续培养24 h。培养结束后，收集细胞沉淀，提取总RNA并反转录为cDNA，RT-qPCR检测肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、核因子κB p65 mRNA表达。RT-qPCR条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算相对表达量。各基因及内参引物序列见表2。

(4) Western blot验证：①样品制备与蛋白提取：培养结束后，收取细胞沉淀，加入预冷的RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，置于冰上裂解30 min。随后，将裂解液于4 ℃以14 000×g离心15 min，收集上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度一致后，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃变性10 min。②SDS-PAGE电泳：根据蛋白浓度，取等量蛋白样本(约30 µg)加入到10% SDS-PAGE凝胶中，以200 V恒压电泳分离蛋白质。电泳结束后，将凝胶置于转膜缓冲液中平衡10 min。③转膜：将凝胶与聚偏二氟乙烯膜置于转膜装置中，按照“阴极-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-阳极”的顺序放置，确保无气泡。在4 ℃条件下，以400 mA恒流转膜30 min，将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上。④封闭与抗体孵育：转膜结束后，将聚偏二氟乙烯膜置于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，室温封闭1 h。随后，加入一抗[β-actin(1∶5 000)、Toll样受体4(1∶2 000)、核因子κB p65(1∶2 000)]，4 ℃孵育过夜，第2天用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入二抗(稀释度通常为1∶5 000)，室温孵育1 h，再次用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。⑤化学发光检测：将洗涤后的聚偏二氟乙烯膜置于化学发光成像系统中，加入适量ECL化学发光试剂，室温孵育1 min。使用化学发光成像系统进行曝光成像，记录条带的强度和位置。通过分析条带的强度，评估目标蛋白的表达水平。⑥数据分析：使用Image J软件对Western blot条带进行定量分析，计算目标蛋白与内参蛋白(如β-actin)条带强度的比值，以评估目标蛋白的相对表达水平。
1.5   主要观察指标   ①金银花源性细胞外囊泡样颗粒的形态、粒径、脂质、蛋白和核酸成分等基本特征；②RAW264.7细胞在不同浓度金银花源性细胞外囊泡样颗粒处理下的活力、对金银花源性细胞外囊泡样颗粒的摄取情况及其在细胞内的分布；③炎症模型中，不同处理组细胞上清液中白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2等炎症递质水平，以及细胞总RNA中白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2 mRNA表达；④RAW264.7细胞极化实验中，不同处理组细胞上清液中CD86、CD206、白细胞介素10水平，以及细胞表面CD86标志物的表达。
1.6   统计学分析   实验数据运用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析和统计图绘制。如果数据符合正态性分布，则采用x±s表示，否则采用M(P25-P75)表示。当组间差别有统计学意义时，运用Bonferroni法进行多重比较。数据若满足正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组间均数分析；若不满足，则采用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)，多重比较运用Bonferroni校正法调整显著性值，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过学校生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

抗炎药物的研发一直是医学领域的重点，但现有药物如非类固醇抗炎药、糖皮质激素和生物制剂存在显著局限性。近年来，纳米技术在抗炎治疗中展现出潜力。纳米递药系统通过改善药物溶解度、提高药物稳定性和生物利用度，显著提升了药物的递送效率和病灶部位的药物浓度[24-25]。然而，纳米药物系统在生产成本、工艺复杂性和生物安全性方面仍面临挑战[26-29]。例如，高成本和复杂工艺限制了其大规模生产和临床转化，而部分纳米材料的生物相容性和降解性问题可能导致体内积累和潜在毒性。为解决这些问题，亟需通过材料优化、工艺改进及创新推动临床转化和广泛应用。
中草药囊泡在抗炎和药物递送等治疗领域展现出巨大潜力。作为植物囊泡的一个重要分支，中草药囊泡继承了植物囊泡的多种特性，并展现出独特的优势。从各种均质化的植物和果汁中，研究者们发现了形态和分子特征与哺乳动物外泌体相似的膜封闭结构，这些结构展现出潜在的生物活性[30-32]。
其中，最为突出的生物活性包括抗炎、抗癌和抗氧化等[33-35]。植物囊泡与哺乳动物外泌体不仅在形态上相似，功能也相近。它们包含DNA、小RNA (sRNA)、microRNA(miRNA)和蛋白质等成分，能够在炎症、肿瘤等疾病的治疗中发挥积极作用[36]。与动物来源的囊泡相比，中草药囊泡因其来源广、产率高、活性成分丰富、毒性低等显著特点而被广泛认可[37-40]。近年来，多项研究揭示了中草药囊泡在抗炎治疗中的广泛应用前景。生姜源性纳米粒子被证实具有治疗炎症性肠疾病和肠炎相关肿瘤的作用[41]，以及保护肝脏免受酒精诱导的损伤[42]。食用姜黄来源外泌体作为一种新型结肠靶向疗法，具备预防结肠炎和促进结肠炎伤口修复的作用[43]。从新鲜姜黄根茎中分离得到的囊泡样颗粒，可降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1等炎症因子的表达，促进巨噬细胞分化为M2表型以缓解炎症[44]。这些研究成果为中草药囊泡在抗炎应用中提供了坚实的科学依据，提示其对提高中医临床疗效潜力巨大，是突破中医药研究瓶颈的重要新技术。
金银花作为一种常见的抗炎中药，主要化学成分包括黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂苷类、有机酸类和挥发油等[45]，这些成分赋予了金银花广泛的药理作用，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、降血糖、降血脂、增强免疫和止血等[46]。这些成分通过多种机制发挥抗炎作用，例如通过抑制核因子κB信号通路的激活，减少促炎因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和一氧化氮)的产生[47]。尽管已有研究证实了金银花的抗炎效果，但目前针对金银花源性细胞外囊泡样颗粒的抗炎作用仍属空白。鉴于金银花在传统中药中的广泛应用及显著的抗炎活性，深入探究其细胞外囊泡样颗粒的抗炎潜力具有重要意义。此类研究不仅有助于揭示金银花抗炎作用的新机制，还可能为开发新型抗炎药物提供理论依据和实践指导。
此研究聚焦于金银花源性细胞外囊泡样颗粒这一新型药效物质，并初步探讨了这种植物囊泡作为抗炎药物的潜力。通过超滤-超离法成功提取到典型杯状囊泡结构的金银花源性细胞外囊泡样颗粒，并证实它具有膜结构、蛋白质、核酸及脂质等细胞外囊泡的典型特征。金银花源性细胞外囊泡样颗粒对RAW 264.7细胞无毒性，并且能被有效内化，同时展现出对胃肠道消化的耐受性。为了进一步探究金银花源性细胞外囊泡样颗粒的生物学功能，建立了RAW264.7细胞炎症模型。结果显示，金银花源性细胞外囊泡样颗粒能有效降低炎症递质白细胞介素6、白细胞介素1β和环氧化酶2水平，并抑制巨噬细胞向M1型极化，从而证实了其抗炎潜力。转录组学分析提供了金银花源性细胞外囊泡样颗粒抗炎作用的分子层面见解。GO分析指出，金银花源性细胞外囊泡样颗粒通过影响免疫和炎症反应相关基因的表达，尤其是下调这些基因来抑制脂多糖诱导的炎症。KEGG通路分析进一步确认了金银花源性细胞外囊泡样颗粒在肿瘤坏死因子、核因子κB和Toll样受体等关键炎症信号通路中的调节作用，这些通路在炎症反应中起着核心作用。RT-qPCR和Western blot验证实验支持了转录组学分析的结果，显示金银花源性细胞外囊泡样颗粒能够下调脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、核因子κB等炎症相关蛋白的表达，从而减轻炎症反应。
在此研究中，金银花源性细胞外囊泡样颗粒在关键调控指标(CD86、CD206及白细胞介素10)的改善效能显著优于地塞米松及传统金银花汤剂。为确保比较的科学性，实验采用等量消耗原则确定金银花汤剂浓度：即配置相同体积的金银花源性细胞外囊泡样颗粒溶液和金银花汤剂溶液所需消耗的金银花饮片质量相等(1.5 mg/mL)，且该质量浓度金银花汤剂经前期研究验证可在RAW264.7巨噬细胞炎症模型中稳定发挥抗炎效应[23]。等量消耗条件下的疗效优势进一步验证了金银花源性细胞外囊泡样颗粒作为新型抗炎制剂的潜力。另外，金银花源性细胞外囊泡样颗粒可能携带原中药的多种药效成分，例如蛋白质、核酸、脂质等天然活性物质，或可发挥协同抗炎作用[48-49]；再者，金银花源性细胞外囊泡样颗粒粒径小，可以更容易地穿过细胞膜，进入细胞内部，从而促进药物在细胞内的吸收和利用[50]，为抗炎治疗提供了新视角。
此研究存在以下局限性：目前仅在体外细胞水平进行，缺乏体内实验验证。体内环境复杂，药物的药代动力学、组织分布及与机体免疫系统相互作用等均需进一步探究。
基于当前研究结果，后续研究将采用多组学分析金银花源性细胞外囊泡样颗粒的主要成分，明确其所含代谢物、脂质、蛋白等；开展体内实验，利用活体成像等技术分析金银花源性细胞外囊泡样颗粒在体内的药代动力学、组织器官分布，据此建立相应的炎症模型研究体内抗炎活性，并从抗炎疗效、安全性、生物利用度、治疗靶点等多个方面与传统金银花汤剂或者单体进行对比。
综上所述，此研究初步揭示了金银花源性细胞外囊泡样颗粒自身的抗炎潜力。基于此研究的成果，金银花源性细胞外囊泡样颗粒有望成为一种新型的抗炎药物，为炎症性疾病的治疗提供新的选择。

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文题释义：

细胞外囊泡样颗粒：此处特指中草药囊泡，即从中药细胞外液或中药汁液中分离得到的纳米级脂质双层囊泡。这些囊泡具有与哺乳动物外泌体相似的形态和功能，它们由磷脂双分子层构成，包含蛋白质、核酸和脂质等生物活性成分，能够在细胞间传递生物信息，发挥多种生物学功能。中草药囊泡因其来源广泛、产量高、生物相容性好且毒性低等优点，成为中药现代化研究的热点之一，尤其在抗炎、抗氧化等领域展现出巨大的应用潜力。#br#

金银花：作为中国传统中药材，金银花的主要化学成分包括黄酮类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类、有机酸类、挥发油等多种类型。这些成分赋予了金银花广泛的药理作用，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、降血糖、降血脂、增强免疫和止血等。

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近年来，随着纳米技术和中医药学的深度融合，中草药源性纳米粒子日益受到关注。当前研究热点集中于探索中草药纳米粒子的生物活性、作用机制及其在药物递送系统中的应用潜力。目前研究表明，中草药纳米粒子具有良好的生物相容性和显著的药理活性，如抗炎、抗氧化和免疫调节等。在抗炎领域，生姜、姜黄等中草药源性纳米粒子已被证实对多种炎症模型具有显著疗效，可有效调节炎症相关信号通路，抑制促炎因子的释放。本实验聚焦于金银花源性纳米粒子的抗炎活性及机制研究，处于该领域的前沿探索阶段。通过提取金银花中的细胞外囊泡样颗粒并系统研究其抗炎作用，本研究不仅验证了金银花在抗炎治疗中的应用潜力，还初步揭示了其通过调节关键炎症信号通路发挥抗炎作用的分子机制。这一成果为开发新型中草药源性抗炎纳米药物提供了重要实验依据，推动了中草药纳米技术在抗炎治疗中的应用发展。未来，随着对中草药纳米粒子的研究不断深入，其在炎症性疾病治疗中的应用前景将更加广阔，有望为临床提供更安全、高效的治疗选择。

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