2.1   通过FRET成像显示MDCK上皮微组织的形成   MDCK细胞是一种常用的研究上皮形态发生的模型细胞系，由Rab GTP酶调控顶基底极性的形成[35]。基于FRET技术可视化观测MDCK微组织发生和ERK活性变化，构建了稳定表达ERK FRET探针的细胞株。将细胞培养在100% Matrigel凝胶上(模拟基底膜)、包埋在Matrigel凝胶中，以及培养基含有MEK抑制剂(PD98059，10 μmol/L)、RAF抑制剂(Sorafenib，5 μmol/L)的凝胶上。这2种抑制剂均是ERK上游信号分子特异性抑制剂，对照组为添加溶剂二甲基亚砜。使用含2% Matrigel的DMEM高糖培养基进行培养，每隔2 d更换1次培养基。在生长的第3，9天进行活细胞FRET成像(20倍物镜)，通过FluoCell软件程序分析FRET荧光比值(FRET/ECFP)，以及Image J软件计算细胞团的直径。其中，MDCK微组织的颜色代表FRET/ECFP的相对荧光比值，从蓝到红代表ERK活性从低到高的分布。
培养第9天之后，与包埋在Matrigel凝胶中相比，在Matrigel凝胶上生长的微组织FRET比值更高，代表了更高的ERK活性(图1A，B)，细胞团的直径更大(图1C)，提示改变培养的基质环境对MDCK微组织的形态发生有重要影响。用共聚焦显微镜拍摄培养第9天后的微组织图片，证明已形成了类似三维组织结构。使用PD98059、Sorafenib处理的MDCK微组织与对照组相比，ERK活性降低(图1A，B)，直径更小(图1C)；通过CCK-8实验分析，这2种抑制剂对MDCK细胞增殖有一定抑制作用(图1D)。这些结果表明ERK活性对MDCK上皮微组织的生长有重要调控作用。



2.2   细胞收缩力调节MDCK上皮微组织的形成   基于以上实验，进一步检测细胞肌动蛋白收缩力是否参与调节MDCK微组织的发生。Y27632抑制Rho下游的ROCK信号通路[36]，Blebbstanin和ML-7分别抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ型ATP酶和肌球蛋白Ⅱ轻链激酶(MLCK)，从而抑制细胞中的收缩力作用[37-38]。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、Y27632(40 μmol/L)、Blebbsitatin(40 μmol/L)、ML-7(40 μmol/L)的培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。
培养第9天后，均形成了MDCK微组织(图2A)，与对照组(二甲基亚砜)相比，加入3种抑制剂之后ERK活性降低(图2A，B)，细胞团变小(图2C)。通过CCK-8实验检测细胞增殖活性，发现Y27632对细胞增殖有一定促进作用、Blebbsitatin对细胞没有影响、ML-7对细胞增殖有一定抑制作用(图2D)。这些结果表明，抑制细胞内收缩力后，ERK活性降低，微组织体积变小，显示细胞收缩力作用是该微组织正常生长的必要条件。



2.3   钙离子通道对MDCK微组织发生的调节作用   细胞钙信号常见于力学信号转导过程[39]，课题组近期工作表明内质网膜上的钙通道在细胞-细胞力学通讯中至关重要[40]。该研究通过使用多种阻滞剂来研究Ca2+通道是否参与调控MDCK微组织的形成。2-APB能够选择性地抑制内质网上IP3R Ca2+ 通道，硝苯地平(Nifedipine)能够抑制质膜上L型Ca2+ 通道，Thapsigargin选择性地抑制内质网上的SERCA钙泵。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、2-APB(10 μmol/L)、Nifedipine(10 μmol/L)、Thapsigargin(10 μmol/L)的培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。
培养第9天之后，用2-APB和Nifedipine处理的细胞能够形成微组织形态，而Thapsigargin处理的细胞没有组织形态的发生(图3A)。与对照组(二甲基亚砜)相比，2-APB和Nifedipine处理后ERK活性和细胞团大小显著下降(图3B，C)。CCK-8实验显示这3种抑制剂对细胞增殖都有明显抑制作用(图3D)。该结果显示选择性抑制IP3R Ca2+ 通道和质膜上L型Ca2+通道导致MDCK微组织变小，而Thapsigargin对细胞的毒性较大，影响微组织的正常形态发生。



2.4   机械敏感离子通道Piezo与整合素信号调控MDCK上皮微组织的生长   Piezo是细胞膜上的一种机械敏感离子通道，可以将机械信号转化为生物信号，并导致多种细胞反应[41]。整合素是由亚基α和β组成的二聚体，作为细胞膜上的受体与胞外基质配体相互作用，调节多种动态细胞过程，如细胞迁移、吞噬作用以及生长和发育的细胞内分子信号[42]。该研究进一步检测细胞质膜上机械敏感受体分子Piezo和整合素对MDCK微组织发生的影响。GsMTx4可以选择性抑制Piezo，GdCl3是力学敏感型钙离子通道阻滞剂；AIIB2抗体可以作用于整合素代表型β1亚基，起到一定的阻滞作用。将MDCK细胞分别培养在含二甲基亚砜(0.1%)、GsMTx4(5 μmol/L)、GdCl3(25 μmol/L)、AIIB2(2 μg/mL)的DMEM高糖培养基中，每隔2 d更换1次培养基(含2% Matrigel)。
培养第9天后，与对照组(二甲基亚砜)相比，加入Piezo抑制剂的实验组ERK活性更低(图4A，B)、直径更小(图4C)。CCK-8实验分析显示该抑制剂对细胞增殖没有显著影响(图4D)。这些结果初步表明Piezo1力敏感通道对MDCK细胞中的ERK活性和组织形态大小发挥有效调控作用。加入AIIB2抗体后，实验组中仅形成没有完整组织形态的细胞簇，CCK-8实验分析表明AIIB2对MDCK细胞增殖没有显著影响(图4A-D)，这些结果证实整合素在该组织形态发生中具有重要作用。



2.5   不同细胞外基质环境介导的肾小管形成   基于以上细胞力敏感受体的作用，该研究进一步检测不同胞外基质环境对MDCK微组织生长的影响。将细胞分别培养在100% Matrigel凝胶、用PBS稀释过1倍的50% Matrigel凝胶、50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(0.5 mg/mL)、50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(1 mg/mL)和50%Matrigel基质胶+Ⅰ型胶原(2 mg/mL)上。
培养第9天后，与100% Matrigel凝胶相比，50% Matrigel凝胶上MDCK微组织的ERK活性和直径没有显著性差异(图5A-C)。在基质中加入不同质量浓度Ⅰ型胶原后，对MDCK微组织形态发生有显著影响，生成长形的细胞团(图5A)。与50% Matrigel凝胶条件比较，添加Ⅰ型胶原的各组ERK活性没有显著变化(图5B)。通过测量长轴方向的大小，发现Ⅰ型胶原质量浓度越高，形成的细胞团长度越长(图5D)。这些结果表明胞外基质胶的组成对MDCK的形态发生有重要影响。

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在哺乳动物的肾、肺、唾液和乳腺中，上皮器官形成了由导管和腺泡组成的复杂结构，导管末端为高度分支的小叶单元，由多个单独的腺泡组成，每个腺泡含有一个中央腔，一层被肌上皮细胞包围的极化管腔和一个基底膜[1-2]。生物体内，细胞存在于一个复杂且丰富的微环境中，其中包含多种细胞外基质成分以及细胞分泌因子，细胞和多细胞结构可以在细胞外基质环境中机械地排列和集中，并且可以通过分化、分支或紊乱来感知和响应机械力学信号[3-4]。课题组近期对上皮形态发生的研究证明了细胞-细胞黏附和细胞-细胞外基质相互作用的重要性[5]。3D Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞培养系统是研究肾上皮分支形态发生和肾小管生成的常用模型[5]，将单个细胞嵌入Matrigel胶中会形成类似于简单立方体上皮组织的空心腺泡[6]。MDCK腺泡也常被用于研究细胞极性、生物分子的分泌[7]。目前，国内的研究人员利用该腺泡实验模型来深入研究细胞内部分泌和分泌通路，并将这些研究应用于疾病诊断和治疗[8-9]。
在生理、病理条件下，力学因素在组织、器官、机体等较宏观水平上存在作用，例如胚胎发育过程中血管、心脏、肺、肾脏等组织器官的形成。目前生物力学在组织器官层次上的作用已成为一个重要的研究方向[10-11]。研究已证明机械力如细胞骨架张力、细胞间黏附、细胞-细胞外基质黏附对MDCK微组织结构的形成与维持起重要作用[12-13]。
钙信号是将机械刺激转化为生化信号的力学敏感成分，也是细胞增殖的关键调节因子，在肾脏生理学和各种肾脏疾病发病机制中起重要作用[14-15]。抑制Rho-Rock-肌球蛋白途径会消除管腔扩张，肾小管组织结构减小[16-17]。细胞膜上力敏感离子通道Piezo在各种组织中表达，例如肾脏、皮肤和肺[18-19]，拉伸MDCK会使Piezo1触发钙电流，通过丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)1/2激活细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2来促进细胞周期蛋白转录并启动有丝分裂[20]，而Piezo在MDCK组织形成中的作用尚不明确。整合素是一类细胞表面受体，不仅促进生长因子受体信号传导，而且在模拟体内的三维培养中发挥着多种作用，抑制β1整合素会导致MDCK腺泡缺失中央腔，生长成缺乏组织形态的细胞簇[21]。有研究发现，随着基质刚度的增加，在Ⅰ型胶原凝胶中培养的MDCK腺泡会因缺乏流腔形态而形成扁平的单层集落[22-24]。
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术已被广泛应用于研究活细胞中的蛋白质间互作、细胞信号传导、蛋白质构象和活性变化等[25-26]。在国内FRET也被应用于药物筛选、分子诊断和疾病研究，有助于提高生物医学研究的水平和质量[27-28]。ERK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节分化、上皮细胞分裂和组织稳态上起重要作用[29-30]。
ERK/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路已被证明对于MDCK肾小管组织生成起必要作用[31]。基于FRET的EKAREV-NLS生物传感器有助于组织中的细胞特异性读出，并且通过结构域之间的相互磷酸化作用将ERK活性转变为FRET变化[32]。
该研究结合FRET技术探测力学因素对MDCK微组织形成的影响，主要研究内容包括：①ERK信号通路和细胞收缩力信号对MDCK上皮微组织生长的作用；②质膜和内质网上的钙离子通道对细胞中ERK活性和微组织生长的影响；③细胞膜上力学敏感受体Piezo离子通道和整合素信号、细胞培养的基质成分对微组织形态发生的调节作用。通过FRET探针可视化MDCK上皮微组织发生和ERK活性变化，探索不同的细胞力学和环境物理因素对其生长的影响。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   利用FRET技术在细胞水平上探测力学作用对MDCK微组织形态发生的影响。
1.2   时间及地点   实验于2022年6月至2023年6月在常州大学生物医学工程与健康科学研究院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞种类与来源   MDCK细胞购自北京贝纳科技有限公司，将细胞培养在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、体积分数5% CO2的加湿培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，可对其进行传代处理或取对数生长期的细胞进行实验。
1.3.2   实验试剂及仪器   DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、0.25%蛋白酶、转染试剂盒Lipofectamine 3000均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Matrigel胶购自BD Biotechnology公司；Ⅰ型胶原购自Advanced Biomatrix公司。实验中使用的抑制剂：2-氨基乙氧基二苯硼酸盐(2-APB，一种具有细胞渗透性的IP3R钙通道抑制剂，使用浓度为10 µmol/L)、硝苯地平(质膜L型钙通道抑制剂，使用浓度为10 µmol/L)、Blebbistatin(肌凝蛋白ⅡATP酶抑制剂，使用浓度为40 µmol/L)均购自Sigma公司； ML-7(MLCK抑制剂，使用浓度为40 µmol/L)、Y27632 (ROCK抑制剂，使用浓度为40 µmol/L)、毒胡萝卜素(Thapsigargin，内质网上SERCA钙泵抑制剂，使用浓度为10 µmol/L)、GsMTx4 (Piezo阳离子的机械敏感性通道抑制剂，使用浓度为5 µmol/L)、GdCl3(力学敏感型钙离子通道阻滞剂，使用浓度为25 µmol/L)、
PD98059(MEK抑制剂，使用浓度为10 µmol/L)均购自MCE公司；Sorafeninb (RAF抑制剂，使用浓度为5 µmol/L)、CCK-8细胞增殖试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；AIIB2 (ITGB1抑制型抗体，使用质量浓度为2 µg/mL)购自DSHB公司；CO2 细胞培养箱购自日本三洋公司；倒置显微镜(Primo Vert)、倒置活细胞荧光显微镜(cell observer) 购自德国Zeiss公司。
1.4   实验方法  
1.4.1   构建稳定表达ERK FRET探针的MDCK细胞株   为了阐明形成MDCK组织内在的力学生理功能和分子信号机制，将细胞核定位的ERK FRET探针EKAREV-NLS导入MDCK细胞内，结合抗性和荧光表达筛选稳定细胞株[33]。用Lipofectamine 3000试剂将EKAREV-NLS表达质粒转染进入MDCK细胞，约48 h后加入质量浓度为300 µg/mL的G418抗生素进行筛选，每3 d更换1次含G418的培养基。2周后在显微镜下观察，将长成荧光簇的细胞团挑选到96孔板中进行单克隆培养，筛选出100%荧光转染率的细胞株。
1.4.2   实验模型的制备   由于Matrigel基质胶价格较昂贵，该研究设计了聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)模具，可减少实验中基质胶用量，同时方便定量控制细胞接种密度和基质胶表面积。制备模具时，将PDMS碱与交联剂(Sylgard 184 kit，Dow Corning)以10∶1的质量比充分混合，倒入一个大皿中，抽真空后70 ℃固化4 h，然后打孔得到高度1 cm、直径0.5 cm的PDMS圆形腔室。将制好的PDMS圆形腔室进行等离子清洗处理1 min，使其具有一定的疏水性能够与共聚焦皿底部贴合，超声清洗5 min，体积分数70%乙醇浸泡，然后用无菌的镊子贴于共聚焦皿底部，组装成PDMS模具。
1.4.3   在Matrigel基质胶上进行细胞培养   在PDMS模具里铺上30 µL 100% Matrigel溶液，在37 ℃下放置15 min；将MDCK细胞(2×104个/cm2)接种在水凝胶上；使用含有2% Matrigel的DMEM高糖培养基进行培养，每2 d更换1次培养基。
1.4.4   FRET荧光显微镜成像   FRET显微镜系统配置有多点定位和自动调焦功能，以及维持温度和体积分数5% CO2条件的细胞培养盒。显微镜上增强型青色荧光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein，ECFP)成像通道的荧光滤片参数为激发(436±10) nm、分光455 nm、发射(480±20) nm；FRET成像通道的荧光滤片参数为激发(436±10) nm、分光455 nm、发射(535±15) nm。FRET成像时选择20倍物镜，并使用Zeiss软件自动快速切换ECFP和FRET成像通道，实现双通道图像的实时采集。单个实验跨度为9 d，分别在第3，9天通过显微镜成像观测MDCK组织生长直径和FRET活性。
1.4.5   CCK-8法分析各种抑制剂对MDCK细胞增殖的影响   以每孔1 000-2 000个细胞的密度将MDCK细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁伸展后，加入对应的抑制剂，每组有六七个重复组合。培养3 d后，向每孔加入10 µL CCK-8溶液，放入培养箱孵育4 h，酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。
1.5   主要观察指标   MDCK培养第9天的形成图、基于FRET数据处理的ERK活性、MDCK组织直径大小、MDCK细胞的增殖活性。
1.6   统计学分析   采用Graphpad Prism 6软件完成数据处理和统计分析，每次选择30-40个为一组，手动沿细胞团画圈，取细胞团周边一圈的区域测量其FRET均值。通过图像分析软件Fluocell 6.0.0进行数据分析[34]，减去背景信号后，测量ECFP和FRET图像的荧光信号，并以空间像素对像素的方式校准2个通道的比值，定量的FRET数据以散点表示。
在细胞微组织的培养分析中，用Image J软件对细胞团荧光图像进行处理，“Set Scale”设定比例尺，“Ctrl M键”手动跟踪每个细胞团的直径，并将Result窗口中的数据保存为Excel，然后使用Graphpad Prism 6进行统计分析，数据以散点表示。在CCK-8试剂盒检测细胞增殖的结果分析中，将酶标仪测量的吸光度值保存为Excel进行统计分析，数据以柱状图表示。
采用Graphpad Prism 8软件比较不同实验组间的统计学差异，针对不同实验条件进行多次t检验分析显著性差异。所有描述的实验都在不同时间进行了3次独立重复，得出相似的结论，并根据不同时间获得的数据进行统计量化。
文章统计学方法已经通过常州大学生物医学工程与健康科学研究院统计学专家审核。

三维培养能在一定程度上模拟体内环境，又具有直观的细胞培养及条件可控的优势[43]。MDCK细胞培养系统可用来研究上皮分支形态发生模型[5，44]，将细胞在三维胶原基质中培养10 d能够形成类似上皮结构的空心单克隆微组织[45]。课题组已经展示生理环境下MDCK细胞与可溶性细胞外基质的相互作用可组装成球形和管状组织形态[3]。
该研究利用FRET技术可视化检测不同力学因素对ERK活性、MDCK微组织生长的影响。培养过程中使用MAPK信号通路抑制剂对ERK活性、组织培养大小都有下调作用，显示MAPK信号通路可以通过ERK活性调节MDCK上皮微组织模型的生长。通过抑制肌动蛋白收缩力信号，结果显示ERK活性和细胞生长速度下降，微组织变小，因此细胞收缩力对该微组织生长有关键的调节作用。钙离子是细胞内重要的力学信号转导成分，抑制质膜和内质网膜上的钙离子通道也明显降低了ERK活性、细胞生长速度和微组织的体积，而内质网钙泵抑制剂Thapsigargin对细胞生长的毒性较大，细胞培养未能有效地形成微组织。这些结果表明细胞收缩力和钙信号调节MDCK上皮微组织的生长。
Piezo是细胞膜上的一种机械敏感成分，可以将机械信号转换为电化学信号[46]；整合素和胞外基质相互作用，调节局部黏附能力传递细胞力学信号。该研究检测力学敏感的Piezo和整合素在MDCK上皮微组织模型发生中的作用，实验结果显示抑制Piezo下调了ERK活性和微组织大小，而应用抗体抑制整合素后，ERK活性降低，细胞不能生长成微组织形态。该研究进一步采用不同的细胞外基质组成来改变细胞培养的物理微环境，当细胞培养在50% Matrigel和100% Matrigel凝胶上时，微组织的大小没有显著性差异；加入一定质量浓度的Ⅰ型胶原(0.5，1.0，2.0 mg/mL)后，微组织的形态由显微镜视野下的圆形变成了不太规则的长形，并且随胶原质量浓度增加而进一步延长。这些检测证实MDCK上皮微组织的发生受到细胞膜上力学敏感受体和基质成分的调控，尤其整合素与基质互作影响显著。该研究初步探究了这几种力学因素对MDCK细胞微组织生长的影响，尚未研究具体的细胞力学信号转导机制以及如何调控微组织生长过程。
总之，该研究通过FRET探针技术可视化观测MDCK上皮微组织的形成和ERK活性变化，结果初步显示细胞力学和微环境中的机械信号在微组织发生中具有关键作用，为体内组织结构发生的力学生物学机制提供初步的理论依据，对上皮细胞如何在体内组织尺度上发育以及开展体外上皮组织工程增加了生物力学方面的理解。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

荧光共振能量转移技术：是指能量从一种受激发的荧光基团转移到另一种荧光基团的物理现象。前者称为供体，后者称为受体，当2个荧光染料足够靠近时(2个分子相互作用时)发生荧光共振能量转移，激发态的供体以非辐射的方式将部分能量转移到受体，使受体被激发发射荧光。荧光共振能量转移的产生须具备2个条件，一是供体的发射光谱和受体的激发(或吸收)光谱部分重叠；另外供体和受体之间的距离必须足够小(一般小于10 nm)，受空间排布影响。
MDCK细胞系：由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

基于MDCK微组织培养的实验模型已被用于研究细胞生物学、生物医学和生理学领域的多种过程，后续有望与多组织器官芯片结合起来，加速生物医学领域的进展，同时也能为囊性纤维化和慢性肾脏病等疾病的研究提供帮助。本课题通过荧光共振能量转移(FRET)探针技术可视化观测MDCK上皮微组织的形成和ERK活性变化，结果显示细胞和基质培养环境中的机械力学信号在该微组织发生中具有重要作用，细胞膜上力学敏感受体Piezo离子通道和整合素以及基质成分发挥调节功能。本工作结合FRET技术探索生物力学在微组织发生中的作用，为进一步理解组织尺度上的力学生物学功能提供了启示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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