低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架

doi:10.12307/2023.543

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4776-4782.doi: 10.12307/2023.543

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架

吴江1，2，殷瀚2，严子能1，2，田广招2，丁振罡1，2，袁勋1，2，付力伟2，田壮2，眭翔2，刘舒云2，郭全义1，2

1贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；2中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2022-08-08 接受日期:2022-09-26 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-01
通讯作者: 郭全义，博士，主任医师，教授，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:吴江，男，1997年生，贵州省黔西县人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事软骨组织工程相关方向的研究。
基金资助:
国家重点研发计划课题 (2019YFA0110600)，项目负责人：郭全义

Preparation of hierarchical porous cartilage composite scaffolds loaded with stromal cell-derived factor-1 using low-temperature deposition 3D printing

Wu Jiang1, 2, Yin Han2, Yan Zineng1, 2, Tian Guangzhao2, Ding Zhengang1, 2, Yuan Xun1, 2, Fu Liwei2, Tian Zhuang2, Sui Xiang2, Liu Shuyun2, Guo Quanyi1, 2

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2022-08-08 Accepted:2022-09-26 Online:2023-10-28 Published:2023-04-01
Contact: Guo Quanyi, MD, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Wu Jiang, Master candidate, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Key Research and Development Plan Project, No. 2019YFA0110600 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

低温沉积3D打印：在低温条件下3D打印凝胶状油墨，即生物墨水可在低温平台(-20 ℃至-30 ℃)上立即凝固，然后将冷冻支架转移至冷冻干燥机成型。
基质细胞衍生因子1：作为一种细胞因子，能够促进干细胞的迁移和成软骨分化，提高软骨再生修复能力，是一种理想的促募集和分化因子。

背景：基于原位组织工程再生技术的飞速发展，促进体内干细胞募集策略为软骨损伤修复提供了新的方向。
目的：通过低温沉积3D打印技术构建负载基质细胞衍生因子1的分级多孔细胞外基质支架。
方法：采用化学法制备脱细胞软骨细胞外基质。制备脱细胞软骨细胞外基质匀浆，并加入基质细胞衍生因子1，作为生物墨水，采用低温沉积3D打印技术构建分级多孔细胞外基质支架，通过大体观及扫描电镜观察支架的微观结构，通过CCK-8、死活染色及鬼笔环肽骨架染色评价支架的生物相容性，检测支架的体外缓释性能，通过Transwell实验检测支架对骨髓间充质干细胞迁移的影响。

结果与结论：①扫描电镜显示，打印的细胞外基质支架呈现分级多孔的结构，孔径分布均匀，纤维交错排列，孔与孔之间相互贯通；②CCK-8实验显示，细胞外基质支架无明显的细胞毒性；死活染色显示，骨髓间充质干细胞能够很好地在细胞外基质支架上生长；鬼笔环肽骨架染色显示，骨髓间充质干细胞在细胞外基质支架上能够很好地铺展开，呈梭形；③细胞外基质支架具有良好的缓释性能，在前7 d内较快速地释放基质细胞衍生因子1，累计释放率达约60%，1-4周释放细胞因子速度逐渐减缓，4-6周的释放规律类似于零级释放动力学，42 d累计释放率约达80%，并且仍有缓慢释放的趋势；④Transwell迁移实验显示，基质细胞衍生因子1可提升细胞外基质支架募集干细胞的能力；⑤结果表明，基质细胞衍生因子1可提高低温沉积3D打印细胞外基质支架募集骨髓间充质干细胞的能力。

https://orcid.org/0000-0003-2374-091X(吴江)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 细胞外基质, 支架, 基质细胞衍生因子1, 低温沉积3D打印, 软骨损伤, 骨髓间充质干细胞, 迁移

Abstract: BACKGROUND: The treatment regimen based on the promotion of stem cell recruitment to achieve in situ regeneration and repair of cartilage damage is a new strategy in cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To prepare hierarchical porous cartilage composite scaffolds loaded with stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) using low-temperature deposition 3D printing.
METHODS: The cartilage was decellularized by a chemical method. The bioink was prepared with the addition of SDF-1 to decellularized cartilage extracellular matrix homogenate. The graded porous extracellular matrix scaffolds were constructed using low-temperature deposition 3D printing. The microstructure of scaffolds was observed by scanning electron microscopy. The biocompatibility of the scaffolds was evaluated by CCK-8, live-dead cell staining, and ghost pen peptide cell skeleton staining. The in vitro sustained release of the scaffolds was tested, and the effects of the scaffolds on the migration of bone marrow mesenchymal stem cells were detected by Transwell assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the printed extracellular matrix scaffolds had a hierarchical porous structure, with fibers staggered and interconnected between pores. (2) The CCK-8 results indicated that the prepared extracellular matrix scaffolds had no obvious cytotoxicity. Live-dead cell staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells were able to grow well on the extracellular matrix scaffolds; ghost pen peptide cell skeleton staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells were able to spread well on the extracellular matrix scaffold in a shuttle shape. (3) The extracellular matrix scaffold had a good sustained release property. SDF-1 was released rapidly during the initial 7 days, with a cumulative release rate of about 60%. The release rate of SDF-1 gradually slowed down during 1-4 weeks, and the release pattern during 4-6 weeks was similar to the zero-order release kinetics, and the cumulative release rate reached about 80% at 42 days, and there was still a trend of slow release. (4) The results of Transwell migration assay showed that SDF-1 improved the ability of extracellular matrix scaffolds to recruit stem cells. (5) These findings suggest that SDF-1 can improve the ability of low-temperature deposited 3D printed extracellular matrix scaffolds to recruit bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: extracellular matrix, scaffold, stromal cell-derived factor-1, low-temperature deposition 3D printing, cartilage injury, bone marrow mesenchymal stem cell, migration

中图分类号:

吴江, 殷瀚, 严子能, 田广招, 丁振罡, 袁勋, 付力伟, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4776-4782.

Wu Jiang, Yin Han, Yan Zineng, Tian Guangzhao, Ding Zhengang, Yuan Xun, Fu Liwei, Tian Zhuang, Sui Xiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi. Preparation of hierarchical porous cartilage composite scaffolds loaded with stromal cell-derived factor-1 using low-temperature deposition 3D printing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4776-4782.

图/表（结果） 9

2.1 脱细胞前后猪膝关节软骨的大体观图1A为猪软骨大体观，图1B为采用化学法成功制备的脱细胞软骨细胞外基质匀浆，可见脱细胞软骨细胞外基质呈白色匀浆状。

2.2 脱细胞前后猪膝关节软骨的组织学染色见图2。

为了评估制备的细胞外基质脱细胞程度，使用DAPI染液和苏木精-伊红对脱细胞前后的软骨进行染色分析。结果显示，脱细胞前猪软骨可见大量的细胞核结构；经脱细胞处理后，猪软骨未见明显的细胞核结构，表明脱细胞成功。
为了评估有效的细胞外基质成分的保留情况，进行了番红O、甲苯胺蓝、天狼猩红染色。结果显示，脱细胞前，软骨细胞外基质富含大量的糖胺多糖及胶原成分；脱细胞后，猪软骨仍保留了大量的糖胺多糖及胶原成分。
2.3 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架的大体观及微观结构如图3A所示，实验构建的支架打印是成功的，支架大体观呈现交叉网格状结构，纤维排列整齐。不同放大倍率下的扫描电镜，可见支架微观上表现出明显的分级多孔结构，孔径较均匀分布，大孔分布在400-500 μm之间，纤维径上微孔与微孔纵横交错，相互贯通，见图3B-D所示。

2.4 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架的细胞毒性培养第1天，实验组与对照组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第4天，实验组细胞增殖吸光度值大于对照组(P < 0.05)；培养第7天，细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。综上结果表明所制备的支架是没有细胞毒性的，具备良好的生物相容性。

2.5 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架的缓释性能细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架中基质细胞衍生因子1的累计释放曲线，见图5。在缓释检测的42 d内，前1周内基质细胞衍生因子1释放较快，因子累计释放率已达约60%，呈现短期内的突释现象，随后的1-4周细胞因子释放速度逐渐减缓，而4-6周的释放规律类似于零级释放动力学，42 d累计释放率约达80%，并且仍有缓慢释放的趋势。综上实验结果说明，细胞外基质生物墨水对基质细胞衍生因子1有一定的缓释作用。

2.6 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架表面的细胞活性如图6所示，骨髓间充质干细胞接种在支架上共培养7 d后，共聚焦显微镜下观察到大量绿色荧光标记的活细胞，而红色荧光标记的死细胞数量较少，结果表明骨髓间充质干细胞能够很好地在支架上存活。

2.7 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架表面的细胞黏附将大鼠骨髓间充质细胞与支架共培养7 d后，鬼笔环肽(绿色荧光)染色后共聚焦显微镜下观察可见，骨髓间充质干细胞能够在支架上伸展开，表现出梭形形态，表明该支架有利于细胞的黏附，见图7。

2.8 细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架体外细胞募集为了验证对体外细胞募集效果，对细胞迁移DAPI染色结果及定量分析结果表明，与对照组相比，细胞外基质支架组、细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架组的骨髓间充质干细胞迁移数量增多；与细胞外基质支架组相比，细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架组的细胞迁移数量更多，见图8。

2.9 细胞外基质支架的生物相容性由CCK-8实验、细胞活死染色及细胞黏附结果可知，细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架具有良好的生物相容性。

参考文献

[1] JOUAN Y, BOUCHEMLA Z, BARDECHE-TRYSTRAM B, et al. Lin28a induces SOX9 and chondrocyte reprogramming via HMGA2 and blunts cartilage loss in mice. Sci Adv. 2022;8(34):eabn3106.
[2] LIN X, TSAO CT, KYOMOTO M, et al. Injectable Natural Polymer Hydrogels for Treatment of Knee Osteoarthritis. Adv Healthc Mater. 2022;11(9):e2101479.
[3] JOHNSTONE B, ALINI M, CUCCHIARINI M, et al. Tissue engineering for articular cartilage repair--the state of the art. Eur Cell Mater. 2013;25: 248-267.
[4] LI P, FU L, LIAO Z, et al. Chitosan hydrogel/3D-printed poly(epsilon-caprolactone) hybrid scaffold containing synovial mesenchymal stem cells for cartilage regeneration based on tetrahedral framework nucleic acid recruitment. Biomaterials. 2021;278:121131.
[5] JIANG S, GUO W, TIAN G, et al. Clinical Application Status of Articular Cartilage Regeneration Techniques: Tissue-Engineered Cartilage Brings New Hope. Stem Cells Int. 2020;2020:5690252.
[6] LU L, SHANG X, LIU B, et al. Repair of articular cartilage defect using adipose-derived stem cell-loaded scaffold derived from native cartilage extracellular matrix. J Cell Physiol. 2021;236(6):4244-4257.
[7] CLAVE A, POTEL JF, SERVIEN E, et al. Third-generation autologous chondrocyte implantation versus mosaicplasty for knee cartilage injury: 2-year randomized trial. J Orthop Res. 2016;34(4):658-665.
[8] DORAN PM. Cartilage Tissue Engineering: What Have We Learned in Practice? Methods Mol Biol. 2015;13:403-421.
[9] SZYCHLINSKA MA, STODDART MJ, D’AMORA U, et al. Mesenchymal Stem Cell-Based Cartilage Regeneration Approach and Cell Senescence: Can We Manipulate Cell Aging and Function? Tissue Eng Part B Rev. 2017;23(6):529-539.
[10] TAN AR, HUNG CT. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Functional Cartilage Tissue Engineering: Taking Cues from Chondrocyte-Based Constructs. Stem Cells Transl Med. 2017;6(4):1295-1303.
[11] GRANDE DA, SGAGLIONE NA. Regenerative medicine: self-directed articular resurfacing: a new paradigm? Nat Rev Rheumatol. 2010;6(12): 677-678.
[12] YANG Z, CAO F, LI H, et al. Microenvironmentally optimized 3D-printed TGFbeta-functionalized scaffolds facilitate endogenous cartilage regeneration in sheep. Acta Biomater. 2022;150:181-198.
[13] ZHU J, YANG S, QI Y, et al. Stem cell-homing hydrogel-based miR-29b-5p delivery promotes cartilage regeneration by suppressing senescence in an osteoarthritis rat model. Sci Adv. 2022;8(13):eabk0011.
[14] HUANG B, LI P, CHEN M, et al. Hydrogel composite scaffolds achieve recruitment and chondrogenesis in cartilage tissue engineering applications. J Nanobiotechnology. 2022;20(1):25.
[15] ZHANG S, HU B, LIU W, et al. Articular cartilage regeneration: The role of endogenous mesenchymal stem/progenitor cell recruitment and migration. Semin Arthritis Rheum. 2020;50(2):198-208.
[16] YANG Z, LI H, YUAN Z, et al. Endogenous cell recruitment strategy for articular cartilage regeneration. Acta Biomater. 2020;11:431-452.
[17] SUN X, YIN H, WANG Y, et al. In Situ Articular Cartilage Regeneration through Endogenous Reparative Cell Homing Using a Functional Bone Marrow-Specific Scaffolding System. ACS Appl Mater Interfaces. 2018;10(45):38715-38728.
[18] LI J, CHEN H, ZHANG D, et al. The role of stromal cell-derived factor 1 on cartilage development and disease. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(3):313-322.
[19] ZHANG Y, LI X, LI J, et al. Knee Loading Enhances the Migration of Adipose-Derived Stem Cells to the Osteoarthritic Sites Through the SDF-1/CXCR4 Regulatory Axis. Calcif Tissue Int. 2022;111(2):171-184.
[20] KANG H, PENG J, LU S, et al. In vivo cartilage repair using adipose-derived stem cell-loaded decellularized cartilage ECM scaffolds. J Tissue Eng Regen Med. 2014;8(6):442-453.
[21] YANG Q, PENG J, GUO Q, et al. A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2008;29(15):2378-2387.
[22] CHAWLA S, MIDHA S, SHARMA A, et al. Silk-Based Bioinks for 3D Bioprinting. Adv Healthc Mater. 2018;7(8):e1701204.
[23] LIU W, WANG D, HUANG J, et al. Low-temperature deposition manufacturing: A novel and promising rapid prototyping technology for the fabrication of tissue-engineered scaffold. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2017;70(Pt 2):976-982.
[24] WANG C, YUE H, HUANG W, et al. Cryogenic 3D printing of heterogeneous scaffolds with gradient mechanical strengths and spatial delivery of osteogenic peptide/TGF-beta1 for osteochondral tissue regeneration. Biofabrication. 2020;12(2):025030.
[25] LIAN M, SUN B, HAN Y, et al. A low-temperature-printed hierarchical porous sponge-like scaffold that promotes cell-material interaction and modulates paracrine activity of MSCs for vascularized bone regeneration. Biomaterials. 2021;274:120841.
[26] CHEN M, LI Y, LIU S, et al. Hierarchical macro-microporous WPU-ECM scaffolds combined with Microfracture Promote in Situ Articular Cartilage Regeneration in Rabbits. Bioact Mater. 2021;6(7):1932-1944.
[27] WANG C, LAI J, LI K, et al. Cryogenic 3D printing of dual-delivery scaffolds for improved bone regeneration with enhanced vascularization. Bioact Mater. 2021;6(1):137-145.
[28] PATI F, JANG J, HA DH, et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat Commun. 2014;5:3935.
[29] CHEN P, TAO J, ZHU S, et al. Radially oriented collagen scaffold with SDF-1 promotes osteochondral repair by facilitating cell homing. Biomaterials. 2015;39:114-123.
[30] YANG Z, ZHAO T, GAO C, et al. 3D-Bioprinted Difunctional Scaffold for In Situ Cartilage Regeneration Based on Aptamer-Directed Cell Recruitment and Growth Factor-Enhanced Cell Chondrogenesis. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(20):23369-23383.
[31] 杨振,李浩,付立伟,等.3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架[J].中国组织工程研究,2021,25(34):5445-5452.
[32] FU L, YANG Z, GAO C, et al. Advances and prospects in biomimetic multilayered scaffolds for articular cartilage regeneration. Regen Biomater. 2020;7(6):527-542.
[33] MCGONAGLE D, BABOOLAL TG, JONES E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2017;13(12):719-730.
[34] CHEN SH, WANG XL, XIE XH, et al. Comparative study of osteogenic potential of a composite scaffold incorporating either endogenous bone morphogenetic protein-2 or exogenous phytomolecule icaritin: an in vitro efficacy study. Acta Biomater. 2012;8(8):3128-3137.
[35] ALMEIDA HV, ESWARAMOORTHY R, CUNNIFFE GM, et al. Fibrin hydrogels functionalized with cartilage extracellular matrix and incorporating freshly isolated stromal cells as an injectable for cartilage regeneration. Acta Biomater. 2016;36:55-62.
[36] BURNSED OA, SCHWARTZ Z, MARCHAND KO, et al. Hydrogels derived from cartilage matrices promote induction of human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation. Acta Biomater. 2016;43: 139-149.
[37] ZHENG X, YANG F, WANG S, et al. Fabrication and cell affinity of biomimetic structured PLGA/articular cartilage ECM composite scaffold. J Mater Sci Mater Med. 2011;22(3):693-704.
[38] MARTIN AR, PATEL JM, LOCKE RC, et al. Nanofibrous hyaluronic acid scaffolds delivering TGF-beta3 and SDF-1alpha for articular cartilage repair in a large animal model. Acta Biomater. 2021;126:170-182.
[39] CHEN Y, WU T, HUANG S, et al. Sustained Release SDF-1alpha/TGF-beta1-Loaded Silk Fibroin-Porous Gelatin Scaffold Promotes Cartilage Repair. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(16):14608-14618.
[40] TIAN G, JIANG S, LI J, et al. Cell-free decellularized cartilage extracellular matrix scaffolds combined with interleukin 4 promote osteochondral repair through immunomodulatory macrophages: In vitro and in vivo preclinical study. Acta Biomater. 2021;127:131-145.

引言

成人的关节软骨自我再生能力有限，一旦损伤，如果得不到及时的治疗修复最终可能导致骨性关节炎的发生[1-3]。近年来组织工程在关节软骨再生领域取得了良好的进展[4-5]，尤其是以细胞为基础的软骨组织工程在动物模型及临床应用中展现出了不俗的潜力[6-8]。然而，在体外培养过程中，外源性间充质干细胞的应用受到了自我更新能力差、细胞表型异常和分化潜能降低的限制[9]；此外，将其移植到软骨损伤处后，再生的软骨常常出现异常肥大和纤维化的问题，严重影响了新生关节软骨的功能[10-11]。
为了解决上述问题，科学家们基于原位组织工程策略将内源性干细胞招募到软骨损伤部位，从而达到软骨再生的目的[12-14]。关节腔内的间充质干细胞对于软骨缺损修复至关重要，然而，当关节软骨发生损伤时，内源性间充质干细胞到达损伤区域的数量有限，因此探索并开发出具有招募内源性干细胞功能的仿生支架是关节软骨理想化再生的潜在方案[15-17]。基质细胞衍生因子1是具有强趋化能力的稳态因子[15]，其参加了许多复杂的生物调节过程，包括软骨细胞的增殖、迁移和分化功能[18]，特别是治疗性干细胞的归巢[19]，这充分满足了关节软骨原位再生的要求。团队前期研究发现，脱细胞软骨细胞外基质是天然的生物材料，它不仅保留了软骨特异性的基质成分，而且能够模拟软骨细胞生长的天然微环境，有利于内源性干细胞的黏附、增殖和成软骨分化[20-21]。
组织工程支架的传统制备工艺普遍存在无法精确控制支架性能的缺点[22]。低温沉积制造作为一种新兴的增材制造技术[23]，能够将快速沉积制造和相分离技术相结合，打印喷嘴挤出的生物墨水可立即在低温平台上凝固(-20 ℃至-30 ℃)，然后将冷冻支架冻干，在打印的纤维上形成互联的微孔结构。与传统的熔融沉积制造技术相比，低温沉积制造技术可以避免高温或者有毒溶剂在打印时对生活材料或者引入支架生物活性因子的破坏，保证了生物活性物质的功能[24]；而且除了可以制备宏观大孔外，还可以在打印的纤维丝径上形成相互连通的微孔结构，从而形成分级多孔支架，这种支架不仅提供了利于细胞黏附的拓扑结构，同时微孔的存在有利于细胞生长和营养物质的交换[25-27]。这种3D打印技术为打印出理想的仿生支架提供了可能。
此次实验旨在利用基于细胞外基质和低温沉积生物打印技术，同时结合生物活性因子的优势构建出理想的软骨仿生支架，系统评价该支架的物理化学特性和生物相容性，探究其因子缓释性以及对大鼠骨髓间充质干细胞的招募作用，为进一步的体内修复实验提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验，多组间采用单因素ANOVA 分析，两两比较采用Bonferroni检验。
1.2 时间及地点实验于2021年5月至2022年5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料猪软骨从北京市屠宰市场采购。
1.3.1 实验动物出生48 h SD大鼠乳鼠10只，雌雄不拘，体质量12-18 g，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验方案由中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂及仪器基质细胞衍生因子1(近岸蛋白质科技有限公司，中国)；DMEM/F-12培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗(Gibco公司，美国)；0.25%胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；人基质细胞衍生因子1 ELISA试剂盒(江苏科特中国)；Actin微丝绿色荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；甲苯胺蓝染色试剂盒、苏木精-伊红染色液 (北京瀚海拓新生物技术有限公司，中国)；番红O染色及天狼猩红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；DAPI染液(Molecular Probes公司，美国)；40 g/L多聚甲醛(北京化学试剂有限公司，中国)；SUNP BIOMAKER 生物打印机(上普博源生物科技有限公司，中国)；扫描电子显微镜 (Hitachi S-4800 型，日本)；EPOCH TAKE 3 酶标仪(BioTek公司，美国)；激光共聚焦显微镜(Nikon公司，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 脱细胞软骨细胞外基质的制备脱细胞细胞外基质是根据之前的方法制备的[28]，对其稍加修改。取出新鲜猪膝关节软骨组织，切碎软骨，放入低渗Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0)，6次冷冻(-80 ℃)，6次解冻(37 ℃)，制成软骨匀浆。将软骨匀浆在37 ℃下用0.25%胰蛋白酶在PBS中剧烈搅拌24 h，每4 h更换一次胰蛋白酶溶液，高渗缓冲液洗涤胰蛋白酶软骨悬浮液(1.5 mol/L NaCl在50 mmol/L Tris-HCl中，pH=7.6)，加入核酸酶溶液(50 U/mL DNAse和1 U/mL RNAse A在10 mmol/L Tris-HCl中，pH=7.5)37 ℃下搅拌4 h，1%Triton X-100溶液处理24 h，低渗Tris-HCl溶液清洗经过酶处理过的软骨悬浮液20 h，用低渗Tris-HCl溶液清洗3 d，流水继续冲洗3 d以洗去残余的化学试剂，4 ℃保存备用。
1.4.2 脱细胞前后软骨的大体观观察脱细胞前后软骨大体形态。
1.4.3 脱细胞前后软骨的组织学染色
DAPI及苏木精-伊红染色：在脱细胞前后，将猪软骨经OCT包埋后行冰冻切片(厚度约7 µm)，40 g/L多聚甲醛固定15 min，自来水清洗2次，行DAPI及苏木精-伊红染色，显微镜下观察脱细胞前后的细胞核残留情况。
番红O及甲苯胺蓝、天狼猩红染色：在脱细胞前后，将猪软骨经OCT包埋后行冰冻切片(厚度约7 µm)，40 g/L多聚甲醛固定15 min，自来水清洗2次，行番红O及甲苯胺蓝、天狼猩红染色(具体染色步骤详见说明书)，常规脱水封固，置于显微镜下观察。
1.4.4 细胞外基质生物墨水的制备将制备的脱细胞软骨细胞外基质匀浆放到容器中进行冷冻干燥处理，用粉碎机将其打成粉末。取一定质量的上述粉末，溶解于1%乙酸中，制备出50 g/L的脱细胞软骨细胞外基质生物墨水。将基质细胞衍生因子1加入到细胞外基质生物墨水中，制备细胞外基质/基质细胞衍生因子1生物墨水，根据之前的实验研究，将生物墨水中基质细胞衍生因子1的最终质量浓度调节为2 mg/L[29]。
1.4.5 低温沉积制造3D打印软骨支架基于课题组先前对软骨组织工程支架的设计方案，此次实验进行了简单的修改[26，30-31]。
简单来说，采用低温沉积制造技术对支架进行了3D打印，设定支架丝径与丝径之间的距离为450 μm，选取500 μm打印喷头；生物墨水被转移至打印机的注射器中，并保持在大约4 ℃；接收板温度设置在-20 ℃至-30 ℃；成功打印后将支架冷冻，冻干24 h，形成分级多微孔支架。将支架浸泡在含50 mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二酰亚胺和20 mmol/L n-羟基琥珀酰亚胺的体积分数95%乙醇中，4 ℃下交联24 h。然后用三蒸馏水冲洗支架去除残留化学物质，再次冻干24 h，得细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架。最后用60Coγ-辐照(0.05 mGy)对支架进行消毒，进行后续实验。
1.4.6 细胞外基质支架的理化性质评估
大体观和微观结构：取细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架，观察其大体形态，然后经过冷冻干燥以及真空喷金处理之后，在扫描电镜下观察其微观形态并采集照片。
缓释性能检测：取长×宽×高为5 mm×5 mm×1.2 mm的细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架3个。置于5 mL冻存管中，加入0.5 mL含有体积分数0.5%牛血清白蛋白的PBS溶液(pH=7.4)中，置于37 ℃恒温摇床上以60 r/min 振荡，分别于第1，4，7，14，21，28，35，42天收集上清液，采用ELISA试剂盒检测上清液中缓释基质细胞衍生因子1的量，计算支架缓释出因子的累计释放比例，并作出缓释百分比曲线。
1.4.7 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养取SD大鼠乳鼠，脱颈处死，置于体积分数75%乙醇浸泡消毒30 min。无菌条件下取乳鼠股骨和胫骨，置于含有双抗的 PBS 溶液(pH=7.4)中，将其剪成1.0-2.0 mm3 碎块，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，随后移入25 cm2培养瓶，每两三天更换培养液。显微镜下观察，待细胞生长至 80%-90%融合时进行传代，于细胞培养箱培养至P3代备用。
1.4.8 细胞外基质支架的细胞毒性
支架浸提液的制备：依据国家 ISO10993-12(2019)标准，将无菌的细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架按照3 cm2/mL浸泡于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃孵育24 h，收集浸提液。
CCK-8实验：将 P4代骨髓间充质干细胞按2 000个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞黏附贴壁2 h后弃去含有体积分数10%胎牛血清的原培养基，分别更换为细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架浸提液(实验组)与新鲜的含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(对照组)，每孔100 μL。培养1，4，7 d 后弃去原培养基，以PBS(pH=7.4)清洗2遍，然后每孔加入110 μL含有10 μL CCK-8溶液和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，于细胞培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)内孵育2 h，最后在450 nm波长处检测吸光度值。每组样品重复3次，结果取平均值。
1.4.9 细胞外基质支架表面的细胞活性取P4代骨髓间充质干细胞，消化计数后种植于细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架上，细胞密度为2×105个/支架，置于 37 ℃培养箱中孵育2 h。待细胞贴壁后，添加含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，孵育7 d 后进行死活染色，具体操作步骤参考说明书。以无菌PBS轻柔清洗3次，吸净PBS，Nikon共聚焦显微镜拍照观察。
1.4.10 细胞外基质支架表面的细胞黏附细胞接种方法同1.4.9。培养7 d后，以PBS(pH=7.4)清洗 2次，置入40 g/L多聚甲醛固定15 min，以PBS清洗3遍，加入鬼笔环肽染色工作液，避光孵育60 min，以PBS洗涤3遍，加入DAPI染液，避光染色15 min，以PBS清洗3遍，Nikon共聚焦显微镜拍照观察。
1.4.11 细胞外基质支架体外募集细胞实验利用Transwell小室检测细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架对于骨髓间充质干细胞的募集能力，以DMEM培养基为阴性对照。
在24孔板中插入Transwell小室，将细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架、细胞外基质支架分别加入下室中，随后取600 μL的DMEM培养基加入下室，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。之后于上室中加入100 μL的骨髓间充质干细胞混悬液，细胞密度为2×104个/室，继续放入到37 ℃恒温箱中孵育24 h。取出样本，以PBS(pH=7.4)洗涤后，用40 g/L多聚甲醛固定迁移至下室的细胞30 min，用湿棉签擦除上室中未迁移的细胞，DAPI染色15 min，以PBS洗3遍，荧光显微镜下观察拍照。统计迁移的骨髓间充质干细胞数量，利用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，Bethesda，MD)来定量迁移的细胞。每组样品分别重复3次，细胞迁移数量取平均值。
1.5 主要观察指标细胞外基质/基质细胞衍生因子1支架的大体形态学、微观结构、细胞毒性、因子缓释性及其对骨髓间充质干细胞黏附和迁移的影响。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析。数据以x±s表示，进行方差统计分析，组间采用独立样本t检验，两两比较采用Bonferroni检验，多组间采用单因素ANOVA 分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军总医院统计学专家审核。

讨论

关节软骨的理想化再生是再生医学的主要挑战之一，组织工程技术的出现为软骨缺损的修复带来了新的希望[32]。其中，基于内源性干细胞的软骨修复策略显示出了良好的潜力。有研究表明，关节腔内的内源性间充质干细胞是成人软骨修复的主要驱动因素，但是因为缺损区域内源性间充质干细胞数量不足限制了其再生能力[33]。一个理想的软骨组织工程支架，不仅需要能够招募相当数量的内源性干细胞到缺损区域，而且还能提供细胞增殖分化所需的良好微环境。理想的支架制造技术尤为重要，既要能精确构建理想结构的支架，还要能保护引入支架的生物因子活性[34]。因此，此次实验基于内源性干细胞招募的策略，利用低温沉积3D打印技术制备出细胞外基质/基质细胞衍生因子1软骨支架，并对其物理化学特性及生物相容性进行了系统性表征；除此之外，对基质细胞衍生因子1在支架中的缓释特性以及支架对大鼠骨髓间充质干细胞的招募作用也进行了探究。
大量研究表明，关节软骨细胞外基质能够在很大程度上保留天然软骨的组成成分，这对于再生微环境的提供至关重要[35-36]。首先根据之前的方法成功制备出来了软骨细胞外基质[37]，并且组织学染色结果显示脱细胞后的软骨依然保留了大部分的糖胺多糖以及胶原成分，最后将细胞外基质溶于相应的溶剂后制备成了具有可打印性的生物墨水。与传统的熔融沉积打印技术相比[24]，此次实验选择了更加优良的低温沉积打印构建出细胞外基质软骨仿生支架，在扫描电镜下观测其微观结构，可以看到细胞外基质现交叉网格状结构，并且表现出明显的分级多孔结构，这不仅有利于细胞的黏附生长，还有利于氧气和营养物质的交换。进一步的CCK-8实验以及死活染色实验显示，随着时间的推移，支架对于细胞没有明显的毒性，这充分证实了其良好的生物相容性。此外，细胞骨架染色结果还展现出了支架上的细胞具有良好的伸展性，说明支架利于细胞的黏附和基本形态的维持。
除了细胞所需的再生微环境外，组织工程支架对于内源性干细胞的招募作用也至关重要。既往的研究表明，基质细胞衍生因子1能够促进干细胞的迁移[19，38]。2015年 CHEN等[29]制备了负载基质细胞衍生因子1径向定向和随机的胶原蛋白支架，实验显示该支架在体外促进了蛋白的迁移，在体内有效促进软骨缺损的修复。2019年，CHEN等[39]阐明基质细胞衍生因子1联合转化生长因子β1协同增强骨髓干细胞的迁移，并且基质细胞衍生因子1α/转化生长因子β1修饰的丝素蛋白明胶多孔支架在促进体内软骨形成方面具有协同作用。此次实验将基质细胞衍生因子1负载到低温沉积细胞外基质支架中，并在体外探索其缓释性能以及对大鼠骨髓间充质干细胞的招募作用。体外缓释实验结果显示，基质细胞衍生因子1在前 1 周呈现突释现象，其累计释放率约 60%，在随后 1-4 周释放速度减缓，继而 4-6 周近似于线性缓慢释放，累计释放时间长达42 d。初期的突然释放，可以使得关节腔内的因子浓度迅速提升，从而达到招募大量内源性干细胞的作用，后期的缓慢释放则为干细胞的增殖和分化提供稳定的促进作用。此次实验利用Transwell迁移装置来进行体外干细胞的招募模拟，实验结果表明，细胞外基质支架有一定的招募干细胞的作用，这可能归因于保留在脱细胞外基质中的趋化成分[40]，但作用有限，负载基质细胞衍生因子1后软骨支架的细胞招募作用得到了明显增强。因此，基质细胞衍生因子1作为细胞因子有望在体内同样达到募集干细胞的作用，在软骨再生修复中发挥至关重要的作用，这个之前研究结论一致。
综上所述，此次实验基于内源性干细胞招募策略，通过低温沉积3D打印技术成功构建了负载基质细胞衍生因子1的细胞外基质软骨支架，该支架具有均匀的分级多孔结构以及良好的生物相容性；此外，该支架长期的生物活性因子缓释性能可以发挥优秀的内源性干细胞招募作用，对于关节软骨理想化的再生提供了一种有潜力的策略。但仍需要进一步探讨其对于干细胞成软骨分化的调控作用，此外还需要在动物模型中完善体内干细胞募集以及原位损伤修复的实验。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架

Preparation of hierarchical porous cartilage composite scaffolds loaded with stromal cell-derived factor-1 using low-temperature deposition 3D printing

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[1]	孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[3]	杨怡天, 王璐, 姚蔚, 赵彬. 生物支架与巨噬细胞在骨再生中的相互影响及应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1071-1079.
[4]	李诚, 郑国爽, 蒯贤东, 于炜婷. 海藻酸盐支架修复关节软骨[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1080-1088.
[5]	唐昊天, 廖荣东, 田京. 压电材料修复骨缺损的应用及设计思路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1117-1125.
[6]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[7]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[8]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[9]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[10]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.
[11]	郭颖奇, 宫先旭, 张岩, 肖寒, 王野, 谷文光. 半月板外突与髌股关节软骨损伤及骨髓病变：MRI半定量评分的评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 600-605.
[12]	王绍娜, 刘飞祥, 应春苗, 高晨, 张运克. 中药联合骨髓间充质干细胞调控脑缺血再灌注损伤后血脑屏障的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5377-5384.
[13]	吴志文, 申恩谱, 李贝贝, 刘丹平, 綦惠. 高表达软骨调素1骨髓间充质干细胞来源外泌体促进骨关节炎软骨细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5277-5282.
[14]	郑晓晗, 冯晓丽, 胡兰, 高仕君, 魏艳召, 黄婷, 孙圣童, 魏绪芳, 王埮, 赵振强. 巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5348-5356.
[15]	宋美玲, 李征宇, 艾子政, 李京娜, 曾庆丰, 韩倩倩, 董谢平. 不同比例羟基磷灰石/β-磷酸三钙涂层支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4809-4816.