游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠软骨的保护效应

doi:10.12307/2024.353

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (20): 3170-3175.doi: 10.12307/2024.353

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游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠软骨的保护效应

朱仕杰1，杨轶婷1，曹宇汀1，郑良栋1，林开利2，朱睿1

1同济大学医学院，同济大学附属养志康复医院，上海市 200092；2上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海市 200011

收稿日期:2023-04-18 接受日期:2023-06-15 出版日期:2024-07-18 发布日期:2023-09-09
通讯作者: 朱睿，博士，副教授，同济大学医学院，同济大学附属养志康复医院，上海市 200092
作者简介:朱仕杰，男，1997年生，上海市人，汉族，同济大学在读硕士，主要从事运动干预骨关节炎的基础研究。
基金资助:
国家重点研发计划项目(2020YFC2008703)，项目负责人：朱睿

Cartilage protective effect of swimming exercise in aged mice with knee osteoarthritis

Zhu Shijie1, Yang Yiting1, Cao Yuting1, Zheng Liangdong1, Lin Kaili2, Zhu Rui1

1School of Medicine, Yangzhi Rehabilitation Hospital, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

Received:2023-04-18 Accepted:2023-06-15 Online:2024-07-18 Published:2023-09-09
Contact: Zhu Rui, MD, Associate professor, School of Medicine, Yangzhi Rehabilitation Hospital, Tongji University, Shanghai 200092, China
About author:Zhu Shijie, Master candidate, School of Medicine, Yangzhi Rehabilitation Hospital, Tongji University, Shanghai 200092, China
Supported by:
National Key Research and Development Program, No. 2020YFC2008703 (to ZR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外基质：产生于多细胞有机体中，细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖。研究表明，细胞外基质含有大量信号分子，积极调控细胞活动。其中，软骨细胞外基质可保护软骨细胞免受机械应力的破坏作用。

Ⅱ型胶原：胶原蛋白有不同的类型，其中Ⅱ型胶原主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织，它是由丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成的网状结构，具有一定的机械强度。

背景：游泳运动是膝骨关节炎重要的非药物治疗手段，可以有效缓解膝骨关节炎，但目前游泳运动对老年膝骨关节炎的影响和机制尚不明确。

目的：探讨游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠关节软骨的影响。
方法：将6只3月龄雄性C57BL/6小鼠作为年轻组，将12只18月龄雄性C57BL/6小鼠随机分为老年组和游泳组，每组6只。游泳组小鼠进行1周的适应性游泳和8周的正式游泳运动。干预结束后，对各组小鼠进行步幅分析和取材。通过血常规检测外周血白细胞和淋巴细胞总数；苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色法观察软骨形态；软骨细胞计数和改良Mankin’s评分评估关节软骨损伤程度；免疫组织化学染色和RT-qPCR法检测关节软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的蛋白和mRNA表达。

结果与结论：①与年轻组相比，老年组小鼠步幅明显下降(P < 0.05)，外周血白细胞和淋巴细胞计数均明显升高(P < 0.05)，关节软骨表面不平整、软骨细胞异常、蛋白多糖丢失，软骨细胞计数显著下降(P < 0.05)，改良Mankin’s评分明显升高(P < 0.05)，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白和mRNA表达减少(P < 0.05)、基质金属蛋白酶13的表达增加(P < 0.05)。②与老年组相比，游泳组小鼠步幅明显上升(P < 0.05)，外周血的淋巴细胞计数明显下降(P < 0.05)，关节软骨表面较平整、软骨细胞较正常、蛋白多糖丢失较少，软骨细胞计数显著升高(P < 0.05)，改良Mankin’s评分明显下降(P < 0.05)，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白和mRNA表达增加(P < 0.05)、基质金属蛋白酶13的表达减少(P < 0.05)。③结果说明，游泳运动可减少老年小鼠的血中炎性细胞，改善关节软骨细胞、基质成分及软骨组织形态，对老年膝骨关节炎小鼠软骨具有保护效应。

https://orcid.org/0000-0001-9831-0741(朱仕杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 游泳运动, 老年, 膝骨关节炎, 软骨保护, 细胞外基质

Abstract: BACKGROUND: Swimming is an important non-pharmacological treatment for knee osteoarthritis, which can effectively alleviate the disease. However, the effect and mechanism of swimming on senile knee osteoarthritis are still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of swimming exercise on the articular cartilage of aged mice with knee osteoarthritis.
METHODS: Six 3-month-old male C57BL/6 mice were selected as the young group, and twelve 18-month-old male C57BL/6 mice were randomized into the aged group and the swimming group, with six mice in each group. Mice in the swimming group received adaptive swimming for 1 week and formal swimming for 8 weeks. After the intervention, stride length analysis and sampling were performed in each group. The total number of leukocytes and lymphocytes in peripheral blood was detected by blood routine examinations. The morphology of the articular cartilage was observed by hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining. Chondrocyte counts and the modified Mankin’s score were used to evaluate the degree of articular cartilage damage. The protein and mRNA expressions of type II collagen, aggrecan and matrix metalloproteinase 13 in articular cartilage were detected by immunohistochemical staining and RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the young group, the mice in the aged group showed significantly decreased stride length (P < 0.05), significantly increased numbers of peripheral leukocytes and lymphocytes (P < 0.05), significantly decreased count of chondrocytes (P < 0.05), significantly increased modified Mankin’s score (P < 0.05), significantly decreased protein and mRNA expression of type II collagen and aggreca (P < 0.05), and significantly increased matrix metalloproteinase 13 expression (P < 0.05). Moreover, hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining showed the uneven surface of the articular cartilage, abnormal chondrocytes, and proteoglycan loss in the aged group. Compared with the aged group, swimming exercise significantly improved the stride length of mice (P < 0.05), decreased the count of peripheral blood lymphocytes (P < 0.05), increased the count of chondrocytes (P < 0.05), decreased the modified Mankin’s score (P < 0.05), increased the protein and mRNA expression of type II collagen and aggrecan (P < 0.05), and decreased the expression of matrix metalloproteinase 13 (P < 0.05). Hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining showed that the articular surface of mice in the swimming group was smooth, chondrocytes were normal, and proteoglycan loss was less. All these findings indicate that swimming exercise can reduce the number of inflammatory cells in the blood of aged mice, improve articular chondrocytes, matrix composition and cartilage tissue morphology; thus, it has a protective effect on the cartilage of aged mice with knee osteoarthritis.

Key words: swimming exercise, elderly, knee osteoarthritis, cartilage protection, extracellular matrix

中图分类号:

朱仕杰, 杨轶婷, 曹宇汀, 郑良栋, 林开利, 朱睿. 游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠软骨的保护效应[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3170-3175.

Zhu Shijie, Yang Yiting, Cao Yuting, Zheng Liangdong, Lin Kaili, Zhu Rui. Cartilage protective effect of swimming exercise in aged mice with knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(20): 3170-3175.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析共选用18只雄性C57BL/6小鼠，实验过程中无小鼠死亡。
2.2 步幅与年轻组相比，老年组小鼠步幅显著减少 (P < 0.05)；与老年组相比，游泳组小鼠步幅显著增加 (P < 0.05)；游泳组和年轻组小鼠步幅差异无显著性意义 (P > 0.05)，见图1。

2.3 外周血白细胞和淋巴细胞计数与年轻组相比，老年组小鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数显著升高 (P < 0.05)；与老年组相比，游泳组小鼠外周血白细胞计数有下降趋势，但差异无显著性意义 (P > 0.05)，淋巴细胞计数显著下降 (P < 0.05)；游泳组和年轻组小鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数差异无显著性意义 (P > 0.05)，见图2。

2.4 关节软骨形态学变化与年轻组相比，老年组小鼠关节软骨存在明显破坏和裂隙，软骨表面不平整，软骨细胞数量明显减少且形态异常，软骨基质染色明显减少，蛋白多糖丢失较多，软骨纤维化增加；与老年组相比，游泳组小鼠关节软骨较为完整，软骨表面较平整，软骨细胞局部增多，软骨基质染色较好，蛋白多糖丢失较少，软骨纤维化不明显；但与年轻组相比，游泳组小鼠关节软骨仍存在较明显的软骨细胞和基质破坏，见图3，4。

2.5 软骨损伤程度与年轻组相比，老年组和游泳组小鼠膝关节软骨细胞计数下降 (P < 0.05)，改良Mankin’s评分升高 (P < 0.05)；与老年组相比，游泳组小鼠膝关节软骨细胞计数升高 (P < 0.05)，改良Mankin’s评分下降 (P < 0.05)，见图5。

2.6 关节软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的蛋白表达与年轻组相比，老年组和游泳组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白表达均显著减少 (P < 0.05)，老年组小鼠基质金属蛋白酶13的蛋白表达显著增多 (P < 0.05)；与老年组相比，游泳组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白表达均显著增多 (P < 0.05)，基质金属蛋白酶13的蛋白表达显著减少 (P < 0.05)，见图6和表3。

2.7 关节软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的mRNA表达与年轻组相比，老年组和游泳组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原的mRNA表达均明显减少 (P < 0.05)，老年组的聚集蛋白聚糖显著减少 (P < 0.05)、基质金属蛋白酶13显著增加 (P < 0.05)；与老年组相比，游泳组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达均明显增多 (P < 0.05)，基质金属蛋白酶13的mRNA表达显著减少 (P < 0.05)，见图7。

参考文献

[1] KATZ JN, ARANT KR, LOESER RF. Diagnosis and Treatment of Hip and Knee Osteoarthritis: A Review. JAMA. 2021;325(6):568-578.
[2] CORYELL PR, DIEKMAN BO, LOESER RF. Mechanisms and therapeutic implications of cellular senescence in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2021;17(1):47-57.
[3] ZENG C, DUBREUIL M, LAROCHELLE MR, et al. Association of Tramadol With All-Cause Mortality Among Patients With Osteoarthritis. JAMA. 2019;321(10):969-982.
[4] LIAO Y, REN Y, LUO X, et al. Interleukin-6 signaling mediates cartilage degradation and pain in posttraumatic osteoarthritis in a sex-specific manner. Sci Signal. 2022;15(744):eabn7082.
[5] ZHENG L, ZHANG Z, SHENG P, et al. The role of metabolism in chondrocyte dysfunction and the progression of osteoarthritis.Ageing Res Rev. 2021;66:101249.
[6] LIN J, JIA S, ZHANG W, et al. Recent Advances in Small Molecule Inhibitors for the Treatment of Osteoarthritis. J Clin Med. 2023;12(5): 1986.
[7] 刘静. 中国老年膝关节骨关节炎诊疗及智能矫形康复专家共识[J]. 临床外科杂志,2019,27(12):1105-1110.
[8] FERNANDES L, HAGEN KB, BIJLSMA JW, et al. EULAR recommendations for the non-pharmacological core management of hip and knee osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2013;72(7):1125-1135.
[9] ARDEN NK, PERRY TA, BANNURU RR, et al. Non-surgical management of knee osteoarthritis: comparison of ESCEO and OARSI 2019 guidelines.Nat Rev Rheumatol. 2021;17(1):59-66.
[10] BOWDEN JL, HUNTER DJ, DEVEZA LA, et al. Core and adjunctive interventions for osteoarthritis: efficacy and models for implementation. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(8):434-447.
[11] KOLASINSKI SL, NEOGI T, HOCHBERG MC, et al. 2019 American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and Knee. Arthritis Rheumatol. 2020;72(2):220-233.
[12] DANNAWAY J, NEW CC, NEW CH, et al. Aquatic exercise for osteoarthritis of the knee or hip (PEDro synthesis). Br J Sports Med. 2017;51(16):1233-1234.
[13] BARTELS EM, JUHL CB, CHRISTENSEN R, et al. Aquatic exercise for the treatment of knee and hip osteoarthritis. Cochrane Database Syst Rev. 2016;3(3):CD005523.
[14] AL-HASHEM F, EL KARIB AO, BIN-JALIAH I, et al. Exercise protects against insulin-dependent diabetes-induced osteoarthritis in rats: A scanning electron microscopy study. Ultrastruct Pathol. 2017;41(3):252-257.
[15] HSIEH YL, YANG CC. Early intervention of swimming exercises attenuate articular cartilage destruction in a rat model of anterior cruciate ligament and meniscus knee injuries. Life Sci. 2018;212:267-274.
[16] XUE T, NING K, YANG B, et al. Effects of Immobilization and Swimming on the Progression of Osteoarthritis in Mice.Int J Mol Sci. 2022;24(1): 535.
[17] ZHANG J, QI B, LIU M, et al. Influence of swimming exercise on the expression of apoptotic gene caspase-3 in chondrocytes in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13(4):2511-2517.
[18] MARTINS GA, DEGEN AN, ANTUNES FTT, et al. Benefits of electroacupuncture and a swimming association when compared with isolated protocols in an osteoarthritis model. J Tradit Complement Med. 2021;12(4):375-383.
[19] DA SILVA L A, THIRUPATHI A, COLARES MC, et al. The effectiveness of treadmill and swimming exercise in an animal model of osteoarthritis. Front Physiol. 2023;14:1101159.
[20] DAANS M, LUYTEN FP, LORIES RJ. GDF5 deficiency in mice is associated with instability-driven joint damage, gait and subchondral bone changes. Ann Rheum Dis. 2011;70(1):208-213.
[21] AIGNER T, COOK JL, GERWIN N, et al. Histopathology atlas of animal model systems – overview of guiding principles. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18: S2-S6.
[22] ALVES-SIMÕES M. Rodent models of knee osteoarthritis for pain research. Osteoarthritis Cartilage. 2022;30(6):802-814.
[23] KAYA S, BAILEY KN, SCHURMAN CA, et al. Bone-cartilage crosstalk informed by aging mouse bone transcriptomics and human osteoarthritis genome-wide association studies. Bone Rep. 2022;18: 101647.
[24] ZHANG X, DENG XH, SONG Z, et al. Matrix Metalloproteinase Inhibition With Doxycycline Affects the Progression of Posttraumatic Osteoarthritis After Anterior Cruciate Ligament Rupture: Evaluation in a New Nonsurgical Murine ACL Rupture Model.Am J Sports Med. 2020;48(1):143-152.
[25] ORHAN C, TUZCU M, DURMUS AS, et al. Protective effect of a novel polyherbal formulation on experimentally induced osteoarthritis in a rat model. Biomed Pharmacother. 2022;151:113052.
[26] RUI F, JIAWEI K, YUNTAO H, et al. Undenatured type II collagen prevents and treats osteoarthritis and motor function degradation in T2DM patients and db/db mice.Food Funct. 2021;12(10):4373-4391.
[27] ROBINSON WH, LEPUS CM, WANG Q, et al. Low-grade inflammation as a key mediator of the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2016;12(10):580-592.
[28] LOESER RF, COLLINS JA, DIEKMAN BO. Ageing and the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2016;12(7):412-420.
[29] GREENE MA,LOESER RF.Aging-related inflammation in osteoarthritis.Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(11):1966-1971.
[30] TALAHALLI R, ZARINI S, TANG J, et al. Leukocytes regulate retinal capillary degeneration in the diabetic mouse via generation of leukotrienes. J Leukoc Biol. 2013;93(1):135-143.
[31] 颜春鲁, 安方玉, 蒋国凤, 等. 藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎大鼠血细胞变化及炎症因子表达的影响[J]. 生物学杂志,2020,37(6):84-87.
[32] KLEIN JC, KEITH A, RICE SJ, et al. Functional testing of thousands of osteoarthritis-associated variants for regulatory activity. Nat Commun. 2019;10(1):2434.
[33] BERGHOLT MS, ST-PIERRE JP, OFFEDDU GS, et al. Raman Spectroscopy Reveals New Insights into the Zonal Organization of Native and Tissue-Engineered Articular Cartilage. ACS Cent Sci. 2016;2(12):885-895.
[34] BORTOLUZZI A, FURINI F, SCIRÈ CA. Osteoarthritis and its management - Epidemiology, nutritional aspects and environmental factors. Autoimmunity Rev. 2018;17(11):1097-1104.
[35] KIM TH, YOO JY, CHOI KC, et al. Loss of HDAC3 results in nonreceptive endometrium and female infertility. Sci Transl Med. 2019;11(474): eaaf7533.
[36] RAHMATI M, NALESSO G, MOBASHERI A, et al. Aging and osteoarthritis: Central role of the extracellular matrix. Ageing Res Rev. 2017;40:20-30.
[37] Poole AR, Kobayashi M, Yasuda T, et al. Type II collagen degradation and its regulation in articular cartilage in osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2002;61 Suppl 2(Suppl 2):ii78-81.
[38] GOOLJARSINGH LT, LAKDAWALA A, COPPO F, et al. Characterization of an exosite binding inhibitor of matrix metalloproteinase 13. Protein Science. 2007;17(1): 66-71.
[39] HU Q, ECKER M. Overview of MMP-13 as a Promising Target for the Treatment of Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2021;22(4):1742.
[40] AGARWAL P, LEE H PYO, SMERIGLIO P, et al. A dysfunctional TRPV4–GSK3β pathway prevents osteoarthritic chondrocytes from sensing changes in extracellular matrix viscoelasticity.Nat Biomed Eng. 2021; 5(12):1472-1484.
[41] CAO Z, LIU W, QU X, et al. miR-296-5p inhibits IL-1β-induced apoptosis and cartilage degradation in human chondrocytes by directly targeting TGF-β1/CTGF/p38MAPK pathway.Cell Cycle. 2020;19(12):1443-1453.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年1月在同济大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 动物与分组 6只3月龄的成年雄性C57BL/6小鼠为年轻组，体质量 (26.31±0.86) g；12只18月龄的老年雄性C57BL/6小鼠按随机抽样法分为老年组和游泳组，体质量 (35.78±2.05) g，每组6只。小鼠由上海必凯科翼生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK (沪) 2018-0006，饲养于同济大学动物实验中心SPF动物房。实验方案经同济大学动物实验伦理委员会批准，批准号：TJAA13023101。实验过程中严格遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
1.3.2 实验仪器与主要设备全自动血液细胞分析仪 (深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；玻片扫描影像系统 (深圳生强科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒 (中国Solarbio公司)；番红O-固绿染色试剂盒 (中国Servicebio公司)；兔抗Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13多克隆抗体 (武汉Proteintech公司)；SV超敏两步法组化试剂盒 (武汉Boster公司)；DAB显色试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司)；荧光定量PCR仪(美国Roche公司)；PrimeScript RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本Takara公司)。
1.4 实验方法老年膝骨关节炎小鼠模型为小鼠自然衰老形成。
1.4.1 游泳运动干预年轻组和老年组小鼠饲养在笼中不进行游泳运动；游泳组小鼠进行无负重游泳运动。游泳运动干预分为2个阶段：①适应性游泳阶段：第1周进行，每次干预5 min，1次/d，3 d，以减少游泳引起的应激反应；②正式游泳运动阶段：第2-9周进行：每次干预15 min，1次/d，每周3 d，共8周。游泳运动于41 cm×27 cm×25 cm的透明水缸中进行，水深为15 cm，水温控制在 (32±1) ℃，游泳结束后用毛巾擦干小鼠并放回笼中。
1.4.2 标本采集及处理干预及步幅分析结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠 (3 mL/kg) 麻醉小鼠，心脏取血用于血常规检测；取血后断颈处死，取右膝关节用多聚甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋和切片，苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色观察膝关节软骨形态变化，免疫组织化学染色和RT-qPCR检测膝关节软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的表达情况。
1.5 主要观察指标
1.5.1 步幅分析运用足印分析法分析小鼠步幅。定制长50 cm、宽7 cm的步道，由于小鼠喜欢黑暗盒子，在步道尽头放置一个暗盒。步幅分析时，在小鼠后爪涂上墨水，让小鼠沿着步道行走，并在步道底部的白纸上留下足印。小鼠步幅定义为同侧两个连续足印之间的直线距离[20]。
1.5.2 血常规检测外周血白细胞和淋巴细胞计数小鼠心脏取血50 μL，置于含EDTA-K2血球分析用1.5 mL抗凝管中，立即上机检测外周血白细胞和淋巴细胞计数。
1.5.3 苏木精-伊红染色与番红O-固绿染色法观察关节软骨形态变化取小鼠右膝关节冠状切片进行组织学染色。①苏木精-伊红染色法：染色前烤片2 h，脱蜡至水，苏木精染液5 min，蒸馏水2 min，分化液3 min，自来水2 min，伊红染液2 min，蒸馏水3 s，脱水透明，中性树脂封固，玻片扫描机采集图像。②番红O-固绿染色法：染色前烤片2 h，脱蜡至水，固绿染液5 min，自来水2 min，分化液10 s，自来水稍洗，番红染液5 s，四缸无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，玻片扫描机采集图像。

1.5.4 软骨细胞计数和改良Mankin’s评分使用苏木精-伊红染色切片进行软骨细胞计数，计数内侧胫骨平台关节软骨中的软骨细胞数目。使用番红O-固绿染色切片进行改良Mankin’s评分，该评分包括4个维度：①软骨结构；②软骨细胞；③软骨基质染色；④潮线完整性，共14分[21]。得分越高，关节软骨损伤程度越高，骨关节炎越严重，具体评分标准见表1。

1.5.5 免疫组织化学染色法检测软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的蛋白表达取各组小鼠右膝关节冠状切片，染色前烤片2 h，脱蜡至水。体积分数3% H2O2溶液室温孵育10 min，以去除内源性的过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3；柠檬酸抗原修复液95 ℃修复20 min，冷却至室温，PBS冲洗5 min×3；组化笔画圈，5% BSA溶液37 ℃封闭30 min；一抗4 ℃过夜孵育，PBS冲洗5 min×3；二抗37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3；DAB显色，苏木精复染，返蓝液返蓝，脱水透明，中性树胶封固，玻片扫描机采集图像，并使用ImageJ进行量化。其中，兔抗Ⅱ型胶原多克隆抗体以1∶400稀释，兔抗聚集蛋白聚糖多克隆抗体以1∶100稀释，兔抗基质金属蛋白酶13多克隆抗体以1∶100稀释。

1.5.6 RT-qPCR法检测软骨中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13的mRNA表达取小鼠左膝关节软骨，放于-80 ℃冰箱冻存，用于RT-qPCR检测。使用Trizol试剂提取小鼠软骨组织中的总RNA，检测RNA的纯度和含量，然后用PrimeScript RT Master Mix将总RNA反转录为cDNA。采用TB Green染色法，以各组cDNA为模板，加入缓冲液、引物等进行RT-qPCR。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA表达量。引物由生工生物(上海)合成，引物序列见表2。

1.6 统计学分析采用Graphpad prism 8.0软件对实验数据进行统计学分析和作图，数据经Shapiro-Wilk正态性检验符合正态分布后采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey法，设P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经同济大学医学院生物统计学专家审核。

讨论

游泳运动是适合老年膝骨关节炎的运动类型，它增加膝关节活动的同时，避免过大的关节负荷[7]。游泳过程中，水的浮力可有效减轻运动时的关节负荷，水的阻力强化了运动效果，适当的水温可缓解肌肉痉挛、疼痛，并改善关节周围的血液循环[17]。相关基础研究也表明，游泳运动可以通过减轻炎症并改善氧化应激[14]、抑制软骨细胞凋亡[17]、维持软骨细胞外基质的稳态等途径[15]，缓解创伤性骨关节炎。然而，游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠的影响及潜在作用机制还是不明的。
目前，骨关节炎动物模型根据诱导方法可大致分为手术诱导、化学诱导、机械诱导和自发性4种，自发性模型模拟了非创伤性骨关节炎的进展，因而被认为更接近人类骨关节炎[22]。研究表明，老年雄性C57BL/6小鼠在18月龄时表现出与年龄相关的软骨退变[23]。因此，此次研究将自然衰老的18月龄雄性C57BL/6小鼠作为老年膝骨关节炎模型，经组织学染色、软骨细胞计数和改良Mankin’s评分结果显示：老年组小鼠关节软骨较年轻组破坏明显、软骨细胞异常、数目显著下降，改良Mankin’s评分显著升高。因此，可认为研究所用的老年膝骨关节炎模型小鼠造模成功。
膝骨关节炎患者遭受疼痛和步态障碍，具有特征性的步态模式[24]。碘乙酸钠诱导的膝骨关节炎大鼠表现出步幅的显著下降[25]。此外，衰老也会引起步幅的显著下降，与年轻db/db小鼠相比，老年db/db小鼠的步幅显著下降[26]。因此，步幅可作为小鼠膝骨关节炎和衰老程度的评价指标。足印分析法是高效、便捷的小鼠步态实验手段，可以测量小鼠步幅及其他步态评价指标[20，24]。此次研究中，相比于年轻组，老年组小鼠的步幅显著下降，提示老年组小鼠由于自发膝骨关节炎导致了步态障碍；而相比于老年组，游泳组小鼠的步幅显著上升。这说明，游泳运动可以改善老年小鼠自发的膝骨关节炎和步态障碍。
低度炎症在骨关节炎的发病机制中发挥着关键的作用[27]，也是促进骨关节炎发生的衰老相关因素之一[28]。大量研究表明，随着年龄的增长，体内脂肪因子和细胞因子的产生增加，导致了低度系统性炎症[29]。白细胞参与全身的急性和慢性炎症反应[30]，研究表明，与假手术组相比，膝骨关节炎模型大鼠外周血的白细胞计数显著升高[31]。因此，外周血白细胞及淋巴细胞计数可以反映小鼠全身的炎症反应，且炎症反应与膝骨关节炎发生和发展有关。此次研究中，老年组小鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数均显著高于年轻组，提示衰老可引起小鼠全身炎症反应的增强；而与老年组相比，游泳组小鼠外周血淋巴细胞计数显著降低，说明游泳运动可部分缓解老年小鼠体内炎症反应。
关节软骨损伤是膝骨关节炎的典型病理表现[32]。对关节软骨的组织学染色有助于评估软骨损伤程度。此次研究组织染色的结果显示：游泳组小鼠的关节软骨表面较老年组平整，软骨基质染色更好，蛋白多糖丢失更少，软骨细胞更多，改良Mankin’s评分更低，提示游泳运动可改善老年小鼠关节软骨损伤，缓解老年膝骨关节炎；然而，相比于年轻组，游泳组小鼠的关节软骨仍存在较为明显的软骨损伤，软骨细胞显著下降，改良Mankin’s评分显著升高。结果提示，虽然游泳运动对关节软骨具有一定的软骨保护作用，但无法完全修复衰老导致的关节软骨损伤。
关节软骨是覆盖在滑膜关节表面的一种光滑且无血管的结缔组织，主要由软骨细胞和细胞外基质组成[33-34]。其中，细胞外基质是由蛋白聚糖、胶原、水、矿物质和纤维蛋白组成的复杂网络，赋予关节软骨生物力学特性[35-36]。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖是细胞外基质中表达最为丰富的胶原和蛋白聚糖[37]，它们有助于细胞外基质的合成。而基质金属蛋白酶13是参与骨关节炎细胞外基质分解代谢的关键酶，能够分解细胞外基质中的Ⅱ型胶原[38-39]。在健康关节中，软骨细胞外基质的合成和分解代谢处于平衡。而在膝骨关节炎中，软骨细胞增殖和细胞外基质合成逐渐减少，相反软骨细胞凋亡和细胞外基质分解逐渐增加[40]，最终导致细胞外基质稳态的破坏，这也是膝骨关节炎的典型特征之一[41]。此次研究中，与年轻组相比，老年组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原和聚集蛋白的蛋白和mRNA的表达均显著减少，基质金属蛋白酶13的蛋白和mRNA表达均显著增加，说明老年小鼠关节软骨存在细胞外基质稳态的破坏以及软骨基质成分改变，而与老年组相比，游泳组小鼠关节软骨中基质金属蛋白酶13的表达减少，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达均增加。提示游泳运动可改善关节软骨细胞外基质的稳态，从而改善老年膝骨关节炎；此外，游泳运动虽改善了软骨基质成分，对老年膝骨关节炎发挥了软骨保护效应，却无法完全挽救老年膝骨关节炎。
此次研究尚存在一些不足：首先，老年膝骨关节炎小鼠的游泳运动方案还未有文献报道，因此，此次研究的游泳运动方案是综合了年轻膝骨关节炎大鼠相关研究参数和预实验的结果确定的，但仍具有一定的局限性；其次，由于老年膝骨关节炎小鼠模型饲养和造模周期较长，在兼顾实验可信度和可行性的基础上，研究将样本量定为每组6只，但仍存在样本量偏少的问题，因此，后续研究中，将设计更大样本量的实验，以增加实验结果的可信度。
综上所述，游泳运动可减少老年小鼠的血中炎性细胞，改善关节软骨细胞、基质成分及软骨组织形态，对老年膝骨关节炎小鼠软骨具有保护效应。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

游泳运动对老年膝骨关节炎小鼠软骨的保护效应

Cartilage protective effect of swimming exercise in aged mice with knee osteoarthritis

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[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[3]	侯泽欣, 许本柯, 戴媛, 何川, 张朝驹, 李孝林. 老年人跌倒腕关节背伸损伤机制的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 886-890.
[4]	张泽毅, 杨亦敏, 李文彦, 张美珍. 足前进角对不同年龄膝关节炎患者下肢动力学影响的系统综述和Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 968-975.
[5]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[6]	杨梦晓, 付常喜. 力量训练改善去卵巢模型大鼠骨损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3150-3156.
[7]	尹林伟, 黄夏荣, 屈萌艰, 杨璐, 王金玲, 贾飞阳, 廖阳, 周君. 跑台运动对老年大鼠骨质疏松及wnt/β-catenin信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 231-236.
[8]	李鹏, 韩小松, 向柄彦, 何颖异, 黄坤, 刘利, 罗洪建, 阮世强. 数字化三维重建在老年股骨转子间骨折半髋关节置换中的应用及经济学效果[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2814-2818.
[9]	周思睿, 黄坤, 柏帆, 刘利, 周阳阳. 罗斯曼指数对老年髋膝关节置换后非计划再入院和并发症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2835-2839.
[10]	江渝, 罗燕, 林希圣, 王昳琳, 高泽福, 吕厚辰, 张里程, 唐佩福, 刘玉杰. 痴呆对老年髋部骨折术后并发症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2895-2900.
[11]	杨云云, 陈祁青, 赵继荣, 朱宝, 马东, 黄军凯, 安德浩, 邹继鹏, 刘伟航. 中药单体介导相关信号通路治疗椎间盘退行性变研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2918-2924.
[12]	王珂, 张泽毅, 张力文, 张美珍. 不同年龄膝骨关节炎患者坐起生物力学特征的系统综述和Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2939-2946.
[13]	赵莎莎, 贺庆, 李佳, 吴迎. 补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2542-2549.
[14]	姚思琦, 黎文正, 汪虹. 转化生长因子β/Smad信号通路与瘢痕疙瘩的靶向治疗[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2619-2624.
[15]	刘鑫鑫, 耿治中, 陈建. 不同干预周期的高强度间歇性训练对老年人认知能力影响的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2282-2289.