溶胶浸渗结合电沉积制备氧化镁-磷酸钙复合抗菌涂层

doi:10.12307/2024.523

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (29): 4663-4670.doi: 10.12307/2024.523

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溶胶浸渗结合电沉积制备氧化镁-磷酸钙复合抗菌涂层

谭俊杰，杜佳恒，文振宇，闫吉元，贺葵，段可，尹一然，李忠

西南医科大学附属医院骨科，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2023-07-18 接受日期:2023-10-20 出版日期:2024-10-18 发布日期:2024-03-22
通讯作者: 段可，博士，教授，西南医科大学附属医院骨科，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，四川省泸州市 646000 尹一然，医学硕士，副教授，西南医科大学附属医院骨科，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:谭俊杰，男，1997年生，四川省泸州市人，汉族，在读硕士，主要从事骨外科学、骨修复材料方面的研究。
基金资助:
四川省科技计划项目(2020YFS0455)，项目负责人：尹一然；四川省科技计划项目(2022YFS0628)，项目负责人：闫吉元；泸州市-西南医科大学科技战略合作项目(2020LZXNYDZ08)，项目负责人：段可；西南医科大学产学研项目(2022CXY03)，项目参与人：段可

Antibacterial magnesium oxide-calcium phosphate composite coating prepared by combining electrodeposition and sol-gel impregnation

Tan Junjie, Du Jiaheng, Wen Zhenyu, Yan Jiyuan, He Kui, Duan Ke, Yin Yiran, Li Zhong

Sichuan Provincial Laboratory of Orthopedic Implant Device Research and Development and Application Technology Engineering, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2023-07-18 Accepted:2023-10-20 Online:2024-10-18 Published:2024-03-22
Contact: Duan Ke, MD, Professor, Sichuan Provincial Laboratory of Orthopedic Implant Device Research and Development and Application Technology Engineering, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Yin Yiran, Master, Associate professor, Sichuan Provincial Laboratory of Orthopedic Implant Device Research and Development and Application Technology Engineering, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Tan Junjie, Master candidate, Sichuan Provincial Laboratory of Orthopedic Implant Device Research and Development and Application Technology Engineering, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Science and Technology Project of Sichuan Province, No. 2020YFS0455 (to YYR); Science and Technology Project of Sichuan Province, No. 2022YFS0628 (to YJY); Joint Project of Luzhou and Southwest Medical University, No. 2020LZXNYDZ08 (to DK); Production, Teaching and Research Project of Southwest Medical University, No. 2022CXY03 (to DK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氧化镁-磷酸钙复合涂层：利用表面改性技术将氧化镁复合到磷酸钙涂层中，使磷酸钙涂层获得氧化镁的理化性质和生物学特性。
细菌生物膜：是指细菌黏附于植入物表面分泌细胞外基质，将自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。细菌生物膜有利于细菌生长，抵抗各种细胞免疫及抗菌物质，从而引起感染扩散、宿主对植入物反应及植入物周围骨溶解吸收等并发症。

背景：磷酸钙(CaP)涂层被广泛用于改善钛植入物与骨的整合，但存在感染风险，因此有必要赋予CaP涂层抗菌能力。

目的：通过氧化镁(MgO)溶胶浸渗制备MgO-CaP复合涂层，评价其体外抗菌能力和细胞相容性。
方法：通过滴定法确定CaP电沉积的电解液条件，在钛表面制备CaP涂层(记为Ti-CaP)；采用不同质量分数(15%，30%，50%)的MgO溶胶浸渗处理CaP涂层并煅烧成为MgO-CaP复合涂层，分别记为Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg，表征涂层的微观形貌、拉伸性能、临界载荷与体外Mg2+释放情况。将金黄色葡萄球菌菌液分别接种于纯钛片及Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg表面，24，48 h后采用稀释涂布平板法检测抗菌率。将小鼠成骨细胞悬液分别接种于纯钛片及Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg涂层钛片表面，采用CCK-8法检测细胞增殖，计算细胞存活率；同时观察复合涂层浸泡于DMEM培养基中的微观形貌变化。

结果与结论：①电沉积在钛表面制备出由片状磷酸八钙晶体堆积组成的多孔CaP涂层，经浸渗-煅烧处理后，MgO颗粒聚集填充磷酸八钙晶体的间隙，并且填充程度随MgO含量增加而上升；3组复合涂层第1天均出现Mg2+快速释放，从第3天开始Mg2+释放速率明显下降，至第7天仍可检测出少量Mg2+释放；Ti-CaP-30Mg涂层钛片的屈服强度、抗拉强度、断裂生长率与纯钛片比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg组临界载荷比较差异无显著性意义(P > 0.05)。②除纯钛片及Ti-CaP无抗菌性能外，其余样品均具有良好的抗菌性能，并且抗菌率随涂层中MgO含量的增加而增大。③共培养1，3 d，Ti-CaP-15Mg组、Ti-CaP-30Mg组和Ti-CaP-50Mg组细胞存活率低于纯钛组、Ti-CaP组(P < 0.05)；培养5，7 d，5组间细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；随着浸泡于培养基中时间的延长，涂层中MgO的含量逐渐减少。④结果表明，通过MgO浸渗处理赋予CaP涂层抗菌性的同时保持了其生物相容性。

https://orcid.org/0009-0002-4955-7769(谭俊杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨科植入物, 钛, 抗菌, 氧化镁, 磷酸钙, 抗菌涂层, 细胞毒性

Abstract: BACKGROUND: Calcium phosphate (CaP) coatings are widely used to improve the integration of titanium implants into bone but these coatings are associated with risks of infection. It is thus desirable to confer antibacterial properties to CaP coatings.
OBJECTIVE: To prepare CaP-MgO composite coatings by impregnating magnesium oxide (MgO) sol into CaP coatings and assess the in vitro antibacterial activities and cytocompatibility.
METHODS: An electrolyte was determined by titration and used for CaP coating electrodeposition on titanium (referred to as Ti-CaP). MgO was impregnated into the coating by immersing in an MgO sol with different mass fractions (15%, 30%, 50%) and subsequently calcined to form MgO-CaP composite coatings, which were recorded as Ti-CaP-15Mg, Ti-CaP-30Mg and Ti-CaP-50Mg, respectively. Microstructure, tensile properties, critical load, and Mg2+ release of coatings in vitro were characterized. Antibacterial activity was assayed using spread plate method by culturing S. aureus on the pure titanium sheet surface and Ti-CaP, Ti-Cap-15mg, Ti-Cap-30mg and Ti-Cap-50mg surfaces for 24 and 48 hours. Mouse osteoblast suspension was inoculated on pure titanium sheets and Ti-CaP, Ti-CaP-15Mg, Ti-CaP-30Mg and Ti-CaP-50Mg coated titanium sheets, respectively. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay, and cell survival rate was calculated. The morphology of composite coating soaked in DMEM was also observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Homogeneous, microporous CaP coatings consisting of octacaclium phosphate crystal flakes were prepared on titanium by electrodeposition. After sol impregnation-calcination, MgO aggregates were filled into the inter-flake voids. The extent of MgO filling and Mg concentration in the coating increased with the number of sol impregnation procedures. When immersed in phosphate buffered saline, all composite coatings actively released Mg2+ within 1 day; subsequently, the Mg2+ release slowed down on day 3. A small amount of Mg2+ release was still detected on day 7. The yield strength, tensile strength and fracture growth rate of Ti-CaP-30Mg coated titanium were not significantly different from those of pure titanium (P > 0.05). There was no significant difference in the critical load of Ti-CaP, Ti-CaP-15Mg, Ti-CaP-30Mg and Ti-CaP-50Mg groups (P > 0.05). (2) Except that pure titanium sheet and Ti-CaP had no antibacterial properties, the other samples had good antibacterial properties, and the antibacterial rate increased with the increase of MgO content in the coating. (3) After 1 and 3 days of co-culture, the cell survival rate of Ti-CaP-15Mg, Ti-CaP-30Mg and Ti-CaP-50Mg groups was lower than that of pure titanium group and Ti-CaP group (P < 0.05). After 5 and 7 days of culture, there was no significant difference in cell survival rate among five groups (P > 0.05). The content of MgO in the coating decreased gradually with the time of immersion in the medium. (4) The MgO sol impregnation added antibacterial properties to the CaP coatings while retained their biocompatibility.

Key words: orthopedic implant, titanium, antibacterial, magnesium oxide, calcium phosphate, antibacterial coating, cytotoxicity

中图分类号:

谭俊杰, 杜佳恒, 文振宇, 闫吉元, 贺葵, 段可, 尹一然, 李忠. 溶胶浸渗结合电沉积制备氧化镁-磷酸钙复合抗菌涂层[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(29): 4663-4670.

Tan Junjie, Du Jiaheng, Wen Zhenyu, Yan Jiyuan, He Kui, Duan Ke, Yin Yiran, Li Zhong. Antibacterial magnesium oxide-calcium phosphate composite coating prepared by combining electrodeposition and sol-gel impregnation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(29): 4663-4670.

图/表（结果） 11

2.1 CaP沉积边界曲线 CaP沉淀边界曲线(图1A)代表在不同Ca2+浓度下发生沉淀时的pH值，该边界pH值随Ca2+浓度上升而下降；当Ca2+< 2 mmol/L时曲线陡峭，但斜率随Ca2+浓度上升而逐渐下降；当Ca2+ > 30 mmol/L，曲线平缓。该边界曲线代表电解液的临界过饱和度，它将溶液条件( pH值、Ca2+浓度)分为2个区域：当电解液条件位于曲线上方，电解液立刻发生沉淀；当电解液条件位于曲线以下，但充分接近该曲线(即离子积高于溶度积但低于临界过饱和度)，电解液在较短时间内发生沉淀；当电解液pH值远低于沉淀边界时(如离子积低于溶度积)，电解液在较长时间不发生沉淀。
根据该曲线，合理的电沉积电解液条件应位于沉淀边界以下，但距离边界适当距离使电解液不自发沉淀，但允许阴极反应产生的局部pH值上升使溶液条件跨越该边界。此外，当Ca2+浓度< 2 mmol/L，沉淀边界斜率大，表明微小Ca2+浓度变化会引起溶液中CaP沉淀pH值的较大变化，对电沉积的稳定性有不利影响。因此，实验选择电解液浓度为5 mmol/L CaCl2、3 mmol/L NH4H2PO4。实验结果发现当该电解液pH值距沉淀边界< 0.20时，电解液会在100 min内出现沉淀(图1B)；当电解液pH远低于沉淀边界时(如pH值距边界> 1.00)，电解液在较长时间(> 20 h)不发生沉淀。因此，电解液pH 值选择为6.00(图1A箭头示)。

2.2 CaP涂层电沉积过程中过饱和度和磷酸根分布变化图2A为计算所得的实验所选该电解液在pH值变化(电沉积)过程中的过饱和度变化，可见在pH值6.00-6.70区间电解液对透钙磷石、磷酸八钙、羟基磷灰石均为过饱和，且过饱和度(log S)依次增加。图2B显示计算所得不同pH值下磷酸根离子的分布系数，可见在电解液窗口内，磷酸根离子主要以H2PO4-、HPO42-形式存在，而PO43-的存在比例< 0.5%。这些结果提示电沉积过程中CaP相的形成可能受热力学和结晶速率共同影响。

2.3 涂层理化性质表征结果
2.3.1 涂层形貌、成分与相组成扫描电镜下可见Ti-CaP涂层由长、宽2-4 μm，厚0.1-0.5 μm的片状晶体堆积组成，均匀覆盖，晶体间可见2-5 μm孔隙(图3A)。经浸涂后，Ti-CaP-15Mg可见MgO颗粒聚集成团(2-5 μm)分布于晶体间孔隙中，占据约40%晶体间孔隙(图3B)。Ti-CaP-30Mg中MgO结成团块，团块间相互连接，占据孔隙比例> 70%(图3C)。Ti-CaP-50Mg中MgO大片聚集覆盖在CaP表面，MgO层可见裂纹和直径3-5 μm的圆形孔洞，透过裂纹可见MgO层下的CaP晶体(图3D)。

X射线能谱分析发现，Ti-CaP中出现Ca、P和O元素特征峰；相较于Ti-CaP，Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50 Mg中除上述元素外还出现Mg的特征峰，且其相对峰高随浸涂液中Mg质量分数的增加而增高(图4)。

X射线衍射图谱(图5)显示，Ti-CaP在4.58°，15.98°，26.08°出现衍射峰，其中前两者为磷酸八钙的特征峰。由于磷酸八钙和羟基磷灰石分别在25.95°，25.87°存在衍射峰，因此26.08°处衍射峰难以判定为磷酸八钙或羟基磷灰石。Ti-CaP-30Mg在31.82°，35.08°出现MgO的衍射峰，在26.06°出现磷酸八钙或羟基磷灰石的衍射峰。但与Ti-CaP对比，Ti-CaP-30Mg在4.58°的衍射峰接近消失。

2.3.2 复合涂层体外镁离子释放 Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg在第1天均出现Mg2+快速释放，随时间推移释放速度逐渐减慢，从第3天开始Mg2+释放速率明显下降，趋向平缓，至第7 天仍可检测出少量Mg2+释放(图6)。

2.3.3 纯钛片与Ti-CaP-30Mg的拉伸性能纯钛片和Ti-CaP-30Mg拉伸实验载荷-位移曲线见图7。纯钛片和Ti-CaP-30Mg的屈服强度分别为(394.5±1.0) MPa和(377.6±6.5) MPa，抗拉强度分别为(475.3±15.1) MPa和(468.3±7.6) MPa，断裂伸长率分别为0.27±0.02和0.28±0.03，组间比较差异均无显著性意义(P=0.43，P=0.11，P=0.41)。两组所有指标均符合GB/T 3631-2022标准(钛及钛合金板材)要求，强度下降和伸长率上升符合热处理对晶粒尺寸和力学性能影响的规律[29]。

2.3.4 涂层临界载荷图8显示Ti-CaP-30Mg划痕实验的代表性结果。Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg、Ti-CaP-50Mg的临界载荷分别为(4.32±0.39)，(4.08±0.19)，(3.99±0.56)，(4.19±0.32) N，4组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 涂层体外抗菌性能评价结果培养不同时间后各组平板上形成的菌落数，见图9A。培养24 h后平板上形成的菌落数由多到少为：Ti≈Ti-CaP > Ti-CaP-15Mg > Ti-CaP-30Mg > Ti-CaP-50Mg。纯钛组的抗菌率接近0，Ti-CaP组的抗菌率为(1.7±1.2)%，说明无抗菌性能；而3个复合涂层组的抗菌率均> 0.85，且随浸涂液Mg质量分数的增加而上升，见图9B。Ti-CaP-15Mg组、Ti-CaP-30Mg组、Ti-CaP-50Mg组抗菌率大于纯钛组、Ti-CaP(P均< 0.05)；相比Ti-CaP-15Mg组，Ti-CaP-30Mg组抗菌率上升5.7%(P=0.01)；相比Ti-CaP-30Mg组，Ti-CaP-50Mg组抗菌率上升3.3%，但差异无显著性意义(P=0.10)。培养48 h后，纯钛、Ti-CaP仍然无抗菌性能，而3个复合涂层组的抗菌率仍均> 0.85，且随浸涂液Mg质量分数的增加而上升，见图9B。Ti-CaP-15Mg组、Ti-CaP-30Mg组、Ti-CaP-50Mg组抗菌率大于纯钛组、Ti-CaP(P均< 0.05)；相比Ti-CaP-15Mg组，Ti-CaP-30Mg组抗菌率上升11.1%(P < 0.01)；相比Ti-CaP-30Mg组，Ti-CaP-50Mg组抗菌率上升2.1%，但差异无显著性意义(P=0.63)。

2.5 涂层细胞毒性实验结果各组样品与小鼠成骨细胞培养后的CCK-8检测结果，见图10。共培养1 d，纯钛组和Ti-CaP组细胞存活率> 0.95，3个复合涂层组细胞存活率为0.46-0.49，且随浸涂液Mg质量分数的增加而下降，Ti-CaP-15Mg组、Ti-CaP-30Mg组和Ti-CaP-50Mg组细胞存活率低于纯钛组、Ti-CaP涂层钛片组(P均< 0.05)。共培养3 d，总体趋势与共培养1 d一致，但3个复合涂层组相比共培养1 d的细胞存活率略有上升。共培养5 d，3个复合涂层组细胞存活率明显上升，其中Ti-CaP-15Mg组达0.88，Ti-CaP-50Mg组达0.72，5组间细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。共培养7 d，3个复合涂层组细胞存活率均升至0.89-0.97，5组间细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

图11为3组复合涂层样品在DMEM培养基中浸泡1-7 d后的代表性扫描电镜照片。浸泡第1天，涂层中MgO将磷酸钙完全覆盖；浸泡第3天，MgO含量减少，其下层磷酸钙晶体开始显露；浸泡第5天，MgO仅出现在磷酸钙晶体间隙中，证实涂层中MgO含量随浸泡时间延长而减少。

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引言

钛(Ti)及其合金因具有良好的力学性能和骨整合性常用作骨植入材料[1]，但钛植入器械存在感染的风险，如目前关节置换的感染率达2.5%-10%[2]。骨植入物感染多与细菌生物膜有关[3]，而生物膜内的细菌对抗生素的敏感性远低于浮游细菌[4]，导致骨植入器械感染难以治疗[2]，因此赋予钛植入物抗菌能力具有临床意义。
磷酸钙(CaP)是人体硬组织的无机成分，主要包括羟基磷灰石[Ca10(OH)2(PO4)6]等。等离子喷涂CaP涂层现被广泛用于改善钛的骨整合[5]，但该技术只适用于形状相对简单的器械，较难应用于多孔金属等复杂形态[6]。电沉积法可在各种形态导电基材表面制备均匀的CaP涂层[7]，其原理为：将基材作为阴极浸入含有Ca2+、PO43–的电解液，施加电压，阴极反应(如H+还原)造成基材附近pH值上升，引起CaP结晶形成涂层[8]。一项5年随访研究发现在骨质减少患者中，表面电沉积涂覆CaP人工髋关节股骨柄的位移显著低于等离子喷涂CaP股骨柄[9]。但是，CaP本身不具有抗菌能力。细菌培养、动物模型和临床随访研究报道，CaP涂层的细菌黏附和体内感染高于钛[10-12]。
许多研究将CaP涂层与抗生素或重金属复合赋予其抗菌能力。ALTOMARE等[13]用电沉积法在钛表面制备含庆大霉素的CaP涂层，并证实其在金黄色葡萄球菌培养中形成抑菌圈。KOSE等[14]制备掺银的等离子喷涂CaP涂层，发现其植入兔膝关节后能减少细菌定植和术后感染率。PIERRE等[15]采用电沉积法制备含铜CaP涂层，发现其在体外抑制牙龈卟啉单胞菌增殖。但是抗生素易引起耐药，所以在临床上使用日益受限。银和铜等重金属为人体非必需或微量元素，具有一定毒副作用[16]。
镁是人体常量元素(成人约含镁24 g[17])，参与能量代谢等多种生理过程[18]。镁及其化合物具有良好的安全性，目前推荐成人每日镁适宜摄入量为330 mg[19]。PATEL等[20]将氧化镁(MgO)纳米颗粒分别与人肠细胞、宫颈癌细胞共培养，发现其在< 300 μg/mL下无明显毒性。近期研究报道MgO颗粒具有抗菌能力。SAWAI等[21]报道MgO颗粒在体外琼脂培养中能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。BHATTACHARYA等[22]发现纳米MgO颗粒在细菌悬液中生成活性氧，加入自由基清除剂(抗坏血酸)后抗菌率显著降低，提示产生活性氧是MgO的抗菌机制之一。有研究证实MgO能抑制细菌生物膜形成，如COELHO等[23]制备了MgO-羟基磷灰石复合颗粒，并用稀释涂板实验发现其在体外能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌形成生物膜。
目前尚无研究报道利用复合MgO赋予CaP涂层抗菌性，因此，此次实验结合电沉积和溶胶凝胶法制备出MgO-CaP复合涂层，检验其抗菌性，同时表征复合涂层的理化性质和生物安全性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备、理化性质表征、体外抗菌实验及体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析和SNK检验，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年9月在四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室完成。
1.3 材料 Ti片(TA2，厚度0.1 mm、4 mm，北京研诺信诚科技有限公司)；铂片( 10 mm×10 mm，耀乐仪器)；小鼠成骨细胞(BFN60805977，生命科学)；金黄色葡萄球菌标准菌株[CMCC(B)26003，南京乐诊生物技术]；无水氯化钙(CaCl2，广东广试试剂科技有限公司)；磷酸二氢铵( NH4H2PO4)、十六烷基三甲基氯化铵、乙酸镁(麦克林试剂)；NaCl(国药化学试剂)；氢氧化钠(西陇科学)；草酸(罗恩试剂)；无水乙醇、氢氟酸(成都科隆化学)；平板计数琼脂、LB肉汤、镁离子浓度试剂盒(北京索莱宝科技)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术)；可编程直流电源(2260B-80-13，Tektronix中国)；马弗炉( SX2-4-13，重庆观致科技)；扫描电子显微镜(KYKY-EM6900，北京中科科仪)；X射线能谱仪(630M，Bruker)；紫外可见分光光度计(721，上海佑科仪器仪表)；X射线衍射仪(TD-3500，丹东通达科技)；万能力学试验机(MIT-100，常州三丰仪器)；纳米划痕仪(UNHT，Anton Paar)；恒温培养箱、生物安全柜、酶标仪(Thermo)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)。
1.4 方法
1.4.1 CaP沉淀边界测定为选择合适电解液条件(Ca2+浓度、pH值)，采用滴定法确定不同Ca2+浓度下的CaP沉淀pH值[24]。配制含100 mmol/L NaCl、0.2-50 mmol/L CaCl2、0.2-50 mmol/L NH4H2PO4的系列溶液作为电解液，其中Ca/P摩尔比固定为1.67。用50 mmol/L NaOH滴定上述溶液，当出现沉淀后继续晃动电解液，若沉淀30 s不消失迅速测量并记录pH值。根据所消耗NaOH滴定液的体积计算此时Ca2+浓度，并相应得到Ca2+浓度-pH关系(即CaP沉淀边界)。
1.4.2 CaP涂层电沉积及热力学分析将钛片切割成4 cm×5 cm样品，用1%氢氟酸腐蚀1 min，去离子水中超声清洗5 min后干燥备用。配制含5 mmol/L CaCl2、3 mmol/L NH4H2PO4、100 mmol/L NaCl的电解液，用50 mmol/L NaOH将其调整至pH值=6.00±0.02。将钛片和铂片部分浸没于电解液中，分别连接直流电源负极和正极，施加2.80 V电压并保持60 min，制备出涂覆CaP涂层的样品(记为Ti-CaP)。

为理解CaP的电沉积过程，用下列公式计算上述电解液在不同pH值下相对3种液相中有可能出现的CaP相[羟基磷灰石，磷酸八钙，透钙磷石]的过饱和度(S)：

其中，HA为羟基磷灰石，OCP为磷酸八钙，DCPD为透钙磷石，ksp，HA、ksp，OCP、ksp，DCPD分别为这3种液相的溶度积，分别为2.35×10-59，3.31×10-37，2.39×10-7；[PO43-]、[HPO42-]用总磷酸盐浓度(3 mmol/L)、各自在不同pH值下的的分布系数和各自活度系数三者的乘积计算。其中，分布系数进行如下计算：

其中，Ka1、Ka2、Ka3为磷酸的3级电离常数，分别为7.6×10-3，6.3×10-8，4.4×10-13；活度系数用Debye-Hückel公式计算[25]。
1.4.3 MgO-CaP涂层的制备根据文献[26]和前期预实验结果，以乙酸镁为原料制备Mg质量分数分别为15%，30%，50%的MgO溶胶。配制3瓶50 mL含1 mmol/L十六烷基三甲基氯化铵的乙醇溶液，分别加入2.19，4.37，7.12 g乙酸镁，40 r/min搅拌2 h并用50 mmol/L草酸溶液调整pH值至6.00±0.05，配制成浸涂液。将Ti-CaP浸入浸涂液中15 s，垂直拉起(1 cm/s)，室温干燥4 h后再重复上述操作1次；烘箱干燥(40 ℃，24 h)后转入马弗炉，5 ℃/min升温至650 ℃后保持4 h，获得载MgO-CaP涂层钛片。按浸涂液的Mg含量，将3组浸涂样品分别记为Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg。
1.4.4 涂层理化性质表征扫描电镜观察Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg的微观形貌，利用X射线能谱分析涂层表面元素。使用X射线衍射仪(CuKα，40 kV，25 mA)检测Ti-CaP、Ti-CaP-30Mg的物相成分。
涂层中Mg2+释放：将Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg均剪成1 cm×1 cm，分别浸泡在10 mL PBS(37 ℃，pH=7.40)中7 d，定期收集50 µL溶液并补液，使用镁试剂盒检测Mg2+浓度，如下计算累积释放量：

拉伸实验：将4 mm厚钛板加工成哑铃状拉伸试样(标距段长度30 mm)，制备Ti-CaP-30Mg，按照GB/T 228.1-2010标准(金属材料拉伸试验)，利用万能力学试验机以速度1 mm/min进行拉伸实验，以纯钛板为对照组，测试抗拉强度及延伸率。每组3个平行样。因各实验组热处理温度相同，仅选择Ti-CaP-30Mg为代表进行测试。
纳米划痕实验：将5 mm厚钛板切成1 cm×1 cm样品，分别制备Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg和Ti-CaP-50Mg，用曲率半径为100 μm的半球形划痕头以2 mm/min速度划过样品表面，同时以30 N/min速率逐渐增加法向载荷，划痕全长为2 mm[27]。光学显微镜下拍摄划痕照片，记录涂层明显剥落时载荷作为涂层临界载荷。每组3个平行样。
1.4.5 涂层体外抗菌性能评价复苏金黄色葡萄球菌。吸取0.5 mL金黄色葡萄球菌原液与LB液体培养基混匀，吸出100 µL溶液涂布于琼脂平板，将平板倒置于培养箱中24 h 后，挑取单菌落于4 mL液体培养基中，恒温摇床振荡(37 ℃，150 r/min)培养 24 h。调整菌液中细菌浓度为108 CFU/mL(650 nm吸光度值=0.14)[28]，再逐级稀释至105 CFU/mL 备用。

利用稀释涂布平板法评价样品的体外抗菌能力。将Ti、Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg、Ti-CaP-50Mg样品(均1 cm×1 cm)干热灭菌(200 ℃，30 min)后分别放入24孔板，每孔接种300 µL 金黄色葡萄球菌菌液(105 CFU/mL)，转入37 ℃恒温培养箱中。培养24，48 h后，每孔加入2.7 mL 生理盐水，移液枪吹打10次后将菌液吸入15 mL离心管，将菌液以1∶10体积比逐次稀释106倍。吸取100 µL稀释后的菌液接种于琼脂平板，涂布均匀，37 ℃培养24 h后拍照并观察菌落数，计算抗菌率。以无样品的空白孔板为对照组，同上操作。每组3个平行样。

1.4.6 涂层细胞毒性评价复苏小鼠成骨细胞，移入10 mL离心管内1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入2 mL DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗)后吹打，再加入3 mL该培养基，吹打混匀；将细胞转至细胞培养瓶中培养(37 ℃，95%湿度，体积分数5%CO2)，每2 d换液一次。将细胞传代，取第2代用于后续实验。

将Ti(对照组)、Ti-CaP、Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg、Ti-CaP-50Mg样品(1 cm×1 cm)干热灭菌( 200 ℃，30 min)后放入24孔板，每孔接种1 mL小鼠成骨细胞悬液(2×104 /孔)，每2 d换液一次。培养1，3，5，7 d，取出孔板，每孔加入100 µL CCK-8溶液，孵育2 h后每孔吸取100 µL，测量450 nm吸光度值，计算细胞存活率。空白组为仅加入2 mL DMEM但无细胞的孔板。

根据GB/T 16886.5-2017标准(医疗器械生物学评价)，细胞存活率≥0.7视为无细胞毒性。
为了解细胞毒性结果与涂层降解的关系，将Ti-CaP-15Mg、Ti-CaP-30Mg、Ti-CaP-50Mg分别浸泡在2 mL DMEM培养基中，转入细胞培养箱中保持(37 ℃，95%湿度，体积分数5%CO2)1，3，5，7 d，扫描电镜下观察样品表面形貌。
1.5 主要观察指标钛片的理化性能、抗菌性能与细胞毒性。
1.6 统计学分析利用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用t检验分析两组间数据差异，采用单因素方差分析和SNK检验分析多组间数据差异。P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经西南医科大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

当钛作为阴极时其表面发生析氢反应，包括H+或水分子还原，这些反应导致钛表面附近H+浓度降低，OH-浓度上升。pH值升高引起溶液中H2PO4-、HPO42- 脱去H+向PO43-转化，造成钛附近CaP过饱和形成晶体，并沉积在钛片表面。在沉积过程中，随着涂层生长覆盖钛基体使其局部导电性减弱，涂层生长减缓；而未形成涂层或涂层较薄处，局部导电性与阴极反应都相对较强，涂层形成相对较快，这种负反馈作用使得电沉积CaP涂层高度均匀。
根据滴定曲线，此次实验所用电解液pH值达到约6.70会形成CaP相。但涂层中检测到磷酸八钙，羟基磷灰石是否存在无法确定，未发现透钙磷石，这表明该电解液中晶体形成同时受动力学(结晶速率)和热力学(过饱和度)因素影响。按照磷酸根离子的分布系数曲线，在pH=7.0附近HPO42-约占总磷酸根离子的40%，而PO43-的比例< 0.5%，在此pH值区间，羟基磷灰石的两种组成阴离子PO43-、OH-浓度均很低，其成核-生长速率受限；反之，由于磷酸八钙的组成阴离子为HPO42-、PO43-，其中HPO42-的分布系数较大，因此对磷酸八钙形成速率的限制相对较小。此外，由于HPO42-的分布系数大，透钙磷石的形成速率所受限制较小，但其过饱和度(热力学驱动力)最小，因此可能不利于克服成核所需的能垒。DE ROOIJ等[30]用恒定组分技术研究各种CaP相的形成pH值范围，发现磷酸八钙形成的pH范围为6.0-7.0，羟基磷灰石在pH > 7.4时形成，透钙磷石在pH < 5.5时形成。BROWN[31]发现磷酸八钙作为骨成分之一能指导胶原纤维矿化。JEONG等[32]研究发现，磷酸八钙骨移植替代材料能促进鼠临界骨缺损愈合，表明磷酸八钙具有良好的骨传导性。
溶胶浸渗是提高多孔材料致密度、力学性能和赋予其新功能的重要方法[33-34]。SPIRANDELI等[34]利用生物玻璃溶胶渗透多孔β-磷酸三钙支架，提高支架的体外生物相容性和抗菌活性。此次实验通过扫描电镜、X射线能谱分析证实，浸涂处理后溶胶渗入磷酸钙涂层并通过烧结转化成MgO，并且可通过改变溶胶浓度和浸涂次数来控制MgO负载量。当负载MgO过多时，复合涂层烧结后会出现裂纹，因此只能在一定限度内装载MgO。划痕实验结果显示引入MgO对临界载荷无显著影响，并且数值与SUIUKI等[35]报道的电沉积磷酸钙涂层接近。此次实验中MgO浸渗未能提高涂层临界载荷的原因尚不清楚，但可能与MgO和CaP之间的结合能力有关，需进一步研究。目前用溶胶渗透CaP涂层增进其功能的研究较少。除MgO外，其他材料也可通过溶胶浸渗改变CaP涂层的物理、化学特征，赋予其新生物学功能。近期研究发现纳米颗粒对细菌生存有重要影响，如DONG等[36]和LIU等[37]报道纳米Mg(OH)2颗粒通过被细菌内吞等机制杀死细菌。此次实验制备的复合涂层中，MgO能否直接或通过水解成纳米Mg(OH)2颗粒被细菌摄入后杀死细菌需要进一步研究。此外，实验中MgO颗粒< 500 nm，而大量研究报道植入材料微纳米尺度形貌特征可以上调细胞的黏附、增殖和分化[38]。HICKEY等[39]报道向羟基磷灰石/聚乳酸复合材料中添加纳米MgO颗粒显著提高了表面接种的成骨细胞的黏附、增殖，但MgO与磷酸钙陶瓷或涂层复合对其生物学性能的影响目前尚无报道，仍需系统研究。
X射线衍射结果显示，涂层经过650 ℃处理后磷酸八钙的衍射峰消失，这是因为磷酸八钙的热力学不稳定，在高温下脱去结晶水转化成羟基磷灰石。BARNES等[40]也报道磷酸八钙在300 ℃以上转化成羟基磷灰石。
体外24，48 h抗菌实验结果显示，CaP-MgO复合涂层具有良好的抗菌性能，这有利于在植入手术后初始阶段(24 h内)杀死黏附于涂层表面的细菌，避免其形成生物膜。CAI等[41]认为MgO的主要抗菌机制包括产生活性氧及MgO与细菌之间直接接触。此次实验中MgO-CaP复合涂层的抗菌机制尚不清楚，需进一步系统研究。
体外抗菌实验结果显示，MgO-CaP复合涂层的抗菌率为87%-98%。HE等[42]研究发现8 mg/mL纳米MgO颗粒在4 h内完全灭活108-109 CFU/mL大肠杆菌和沙门氏菌，其材料抗菌性能优于此次实验中的复合涂层材料，这提示MgO-CaP复合涂层的抗菌性能可能仍有提升余地。但是，机体内多种酶等物质对活性氧具有清除作用，因此复合涂层在体内的抗菌能力仍需进一步研究。
按G/T 16886.5-2017标准，细胞存活率≥0.70视为无细胞毒性。此次实验中复合涂层在前3 d具有细胞毒性(存活率0.46-0.63)，但其毒性随时间明显下降，从第5天开始复合涂层无细胞毒性。复合涂层的初期细胞毒性可能与MgO产生的活性氧有关；此外，MgO降解造成pH值升高，也可能会影响细胞生长[43]；而5 d后细胞毒性下降可能与MgO随着换液在培养基中的含量减少有关。骨折后软骨骨痂形成时间通常在两三周[44]，因此前3 d细胞毒性对新骨形成预期无负面影响。LIANG等[45]的研究发现，当镁-钛合金中镁含量较高时(≥2.5%)在体外会有细胞毒性。而WANG等[46]在兔胫骨骨折模型中植入镁含量为97%的镁合金钢板和螺钉，发现镁合金组骨折愈合优于纯钛组。这两项研究提示镁的体外细胞毒性不影响体内成骨。
目前对MgO生物相容性的研究相对较少。POURDANESH等[47]制备了聚乙烯/磷酸三钙/羟基磷灰石/MgO复合材料，将其植入兔颅骨2个月后发现炎症细胞明显减少，骨-材料界面有可观察到的成骨细胞和新骨。JANNING等[48]将Mg(OH)2植入兔股骨髁，4周后观察到其附近骨体积高于对照组(未填充的手术缺损)，6周后与对照组接近。当前大量研究表明，镁合金在骨组织内具有生物相容性，而镁合金的腐蚀产物为Mg(OH)2，提示Mg(OH)2具有安全性。WITTE等[49]将4种不同镁合金植入豚鼠股骨，6-18周后发现镁棒周围的矿物质附着率提高，骨量增加。这些研究均提示MgO-CaP复合涂层具有良好的生物相容性。
此次实验利用溶胶凝胶法将MgO与电沉积CaP涂层复合，体外实验表明该涂层具有良好的抗菌性和生物相容性。实验所述涂层制备方法简单易行，有较好的临床应用前景，但复合涂层在体外存在初期细胞毒性，并且其抗菌机制及体内抗菌性能尚不明确，需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

溶胶浸渗结合电沉积制备氧化镁-磷酸钙复合抗菌涂层

Antibacterial magnesium oxide-calcium phosphate composite coating prepared by combining electrodeposition and sol-gel impregnation

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