聚丙烯酰胺改良甲基丙烯酰化明胶接枝钛合金支架的促成骨性能

doi:10.12307/2024.563

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3472-3477.doi: 10.12307/2024.563

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

聚丙烯酰胺改良甲基丙烯酰化明胶接枝钛合金支架的促成骨性能

褚福超1，王振鑫1，张大振1，袁峰2

1徐州医科大学，江苏省徐州市 221004；2徐州医科大学附属医院骨科，骨组织再生与数字医学重点实验室，江苏省徐州市 221006

收稿日期:2023-10-11 接受日期:2023-11-27 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 袁峰，主任医师，教授，博士生导师，徐州医科大学附属医院骨科，骨组织再生与数字医学重点实验室，江苏省徐州市 221006
作者简介:褚福超，男，1998年生，山东省枣庄市人，汉族，徐州医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科临床与基础研究。
基金资助:
江苏省卫生健康委科研重点项目(ZD2022064)，项目负责人：袁峰；江苏省社会发展--临床前沿技术项目(BE2022708)，项目负责人：袁峰

Osteogenic properties of polyacrylamide-modified gelatin methacryloyl grafted titanium alloy scaffold

Chu Fuchao1, Wang Zhenxin1, Zhang Dazhen1, Yuan Feng2

1Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Key Laboratory of Bone Tissue Regeneration and Digital Medicine, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China

Received:2023-10-11 Accepted:2023-11-27 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Yuan Feng, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Key Laboratory of Bone Tissue Regeneration and Digital Medicine, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China
About author:Chu Fuchao, Master candidate, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
Supported by:
Key Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Commission, No. ZD2022064 (to YF); Jiangsu Provincial Social Development-Clinical Frontier Technology Project, No. BE2022708 (to YF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲基丙烯酰化明胶：甲基丙烯酰基修饰到明胶上得到的一种新型光化学交联水凝胶，因保留了明胶分子链中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸片段和基质金属蛋白酶的靶基序，因而保留了明胶促进细胞黏附与组织重塑的特性，在骨组织工程中得到广泛应用。
复合水凝胶：一般由两种或两种以上的水凝胶交联而成，两种水凝胶具有不同的力学性能和化学特性。依据不同应用场景需求，通过各种交联方法形成新型水凝胶，以此来改良原有水凝胶的机械强度和理化性质。

背景：钛及其合金因出色的生物相容性、耐腐蚀性、力学性能被广泛应用于骨科内植物中，但其本身拥有生物惰性不能为成骨细胞提供良好的生长环境，较难形成良好的骨整合。

目的：在钛合金支架表面构建甲基丙烯酰化明胶和聚丙烯酰胺复合水凝胶材料，分析其体外促成骨能力。
方法：将甲基丙烯酰化明胶与丙烯酰胺混合，加入交联剂与催化剂合成甲基丙烯酰化明胶-聚丙烯酰胺(Gelma-PAAM)水凝胶。将经亲和硅烷表面改性后的钛合金支架分别与甲基丙烯酰化明胶(Gelma)水凝胶、Gelma-PAAM水凝胶混合，完成负载(分别记为Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM)，比较支架表面两种水凝胶的溶胀比、降解率，通过扫描电镜观察水凝胶与钛合金的结合状态。将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于单纯钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架中，检测细胞增殖、黏附及成骨分化能力。

结果与结论：①与Gelma水凝胶相比，Gelma-PAAM复合水凝胶具有更高的溶胀比与更低的降解率；②扫描电镜下可见两种水凝胶表面为蜂窝状结构，与多孔钛合金支架结合后呈膜样包裹于支架表面并充斥孔隙，其中Gelma-PAAM复合水凝胶包裹支架得更充分；③CCK-8检测与活-死荧光染色显示，与Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM支架共培养后的骨髓间充质干细胞增殖良好并保持较高的活性；成骨诱导培养后，单纯钛合金支架组细胞碱性磷酸酶活性、钙沉积量与成骨基因表达量最低，Ti-Gelma-PAAM组细胞碱性磷酸酶活性、钙沉积量与成骨基因表达量最高；④鬼笔环肽骨架染色显示，单纯钛合金支架组、Ti-Gelma组细胞稀疏、伸展不够充分，Ti-Gelma-PAAM组细胞伸展充分、肌动蛋白丝致密；⑤结果表明，Gelma-PAAM水凝胶具有良好的生物相容性与促成骨能力，较Gelma水凝胶更适宜用于钛合金金属表面的促成骨改性。

https://orcid.org/0000-0002-0148-7266(褚福超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 水凝胶, 钛合金表面改性, 甲基丙烯酰化明胶, 聚丙烯酰胺, 成骨, 骨缺损

Abstract: BACKGROUND: Titanium and its alloys are widely used in orthopedic implants due to their excellent biocompatibility, corrosion resistance, and mechanical properties. However, it has biological inertia itself, cannot provide a good growth environment for osteoblasts, and it is difficult to form good osseointegration.
OBJECTIVE: To construct a composite hydrogel material of gelatin methacryloyl and polyacrylamide on the surface of titanium alloy scaffold, and analyze its osteogenic ability in vitro.
METHODS: Gelatin methacryloyl was mixed with acrylamide. Crosslinking agent and catalyst were added to synthesize gelatin methacryloyl and acrylamide (Gelma-PAAM) composite hydrogel. The titanium alloy scaffold modified by affinity silane was mixed with the Gelma hydrogel and Gelma-PAAM composite hydrogel to complete the loading (recorded as Ti-Gelma and Ti-Gelma-PAAM, respectively). The swelling ratio and degradation rate of the two hydrogels on the surface of the scaffold were compared. The bonding state between hydrogels and titanium alloy was observed by scanning electron microscope. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated into Ti, Ti-Gelma and Ti-Gelma-PAAM scaffolds, separately. Cell proliferation, adhesion, and osteogenic differentiation were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with Gelma hydrogel, Gelma-PAAM hydrogel had higher swelling rate and lower degradation rate. (2) Scanning electron microscope showed that the surface of the two kinds of hydrogels was honeycomb structure. After being combined with porous titanium alloy scaffold, the film was wrapped on the surface of scaffold and filled with pores. Among them, the Gelma-PAAM composite hydrogel coated the scaffold more fully. (3) CCK-8 assay and live/dead fluorescence staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells proliferated well after coculture with Ti-Gelma and Ti-Gelma-PAAM scaffolds and maintained high activity. After osteogenic induction culture, alkaline phosphatase activity, calcium deposition, and osteogenic gene expression of cells of titanium alloy scaffold group were the lowest, and alkaline phosphatase activity, calcium deposition, and osteogenic gene expression of cells of Ti-Gelma-PAAM scaffold group were the highest. (4) Phalloidin cytoskeletal staining exhibited that the cells of pure titanium alloy scaffold group and Ti-Gelma scaffold group were sparse and insufficiently extended, while the cells of Ti-Gelatin-PAAM group had the most adequate stretching and the densest filamentous actin. (5) The results show that Gelma-PAAM hydrogel has good biocompatibility and osteogenic ability, and is more suitable for osteogenic modification on the surface of titanium alloy than Gelma hydrogel.

Key words: hydrogel, titanium alloy surface modification, gelatin methacryloyl, polyacrylamide, osteogenesis, bone defect

中图分类号:

褚福超, 王振鑫, 张大振, 袁峰. 聚丙烯酰胺改良甲基丙烯酰化明胶接枝钛合金支架的促成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3472-3477.

Chu Fuchao, Wang Zhenxin, Zhang Dazhen, Yuan Feng. Osteogenic properties of polyacrylamide-modified gelatin methacryloyl grafted titanium alloy scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3472-3477.

图/表（结果） 8

2.1 两种水凝胶的降解及溶胀性能 Gelma-PAAM水凝胶的降解速度明显优于Gelma，21 d时仍留存42%，两组水凝胶各时间的降解率比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1A；在溶胀动力学方面，Gelma-PAAM水凝胶1 h的溶胀比值为6.9，明显优于Gelma的5.2(P < 0.05)，见图1B，表明Gelma-PAAM水凝胶拥有更好的溶胀性能。

2.2 两种水凝胶与支架结合后的稳定性扫描电镜下可见Gelma与Gelma-PAAM水凝胶均为蜂窝样结构(图2A，B)，这种结构为细胞聚集与生长提供三维空间；钛合金支架与水凝胶结合后的表面更为光滑，可见水凝胶层包裹于支架表面，并且相较于Gelma水凝胶，Gelma-PAAM水凝胶包裹支架更为充分(图2C-F)，通过此种方式改良支架表面的亲和性。水凝胶充斥支架孔隙，这有利于细胞在孔隙中生长，从而加快组织在支架孔隙中的填充速度。

2.3 钛合金支架表面的细胞黏附扫描电镜下可见单纯钛合金表面较为光滑，未见黏附细胞；Ti-Gelma组支架表面可见残留水凝胶涂层，但未见完整细胞形态；Ti-Gelma-PAAM组支架表面可见较为完整的细胞结构，丝状伪足伸展充分，见图3。

2.4 细胞与钛合金支架共培养后的细胞增殖 CCK-8检测显示随着时间的延长，各组细胞吸光度值显著增加。在相同时间点下，各组间细胞吸光度值相比无明显差别，见图4。证明Gelma与Gelma-PAAM水凝胶具有良好的生物相容性，无明显细胞毒性，细胞可在其表面正常增殖。

2.5 细胞与钛合金支架共培养后的细胞活性活-死染色显示各组细胞状态均生长良好，未见明显死亡细胞，各组均保持较高的细胞存活率，见图5，这证明了Gelma与Gelma-PAAM水凝胶材料的低毒性。

2.6 细胞与钛合金支架共培养后的细胞成骨分化成骨诱 14 d后的碱性磷酸酶染色显示，与单纯钛合金支架组相比，Ti-Gelma组、Ti-Gelma-PAAM组细胞碱性磷酸酶活性更强，其中Ti-Gelma-PAAM组细胞碱性磷酸酶活性最高，见图6A。成骨诱导21 d后的茜素红染色显示，单纯钛合金支架组支架仅有少量钙盐沉积，Ti-Gelma组支架钙沉积明显增加，且有结节形成趋势；Ti-Gelma-PAAM组支架钙盐沉积最为明显，有团块状结节形成，见图6B。各组支架的细胞碱性磷酸酶染色与茜素红染色定量分析结果，见图6C，D。

实时荧光定量PCR检测成骨相关基因表达：Ti-Gelma-PAAM组细胞的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Runx2、骨桥蛋白mRNA表达量均高于单纯钛合金支架组、Ti-Gelma组(P < 0.05)，见图7。

2.7 细胞与钛合金支架共培养后的细胞骨架观察鬼笔环肽染色显示单纯钛合金支架组与Ti-Gelma组细胞稀疏、伸展不够充分，Ti-Gelma-PAAM组细胞伸展充分，肌动蛋白丝致密，见图8。

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引言

钛及其合金因出色的生物相容性、耐腐蚀性、力学性能成为骨科应用最广泛的内植物材料[1-4]，但其本身拥有生物惰性不能为成骨细胞提供良好的生长环境，难以形成良好的骨整合[5-10]，因此为加速骨修复过程，对钛植入体表面进行功能化涂层修饰成为改良钛合金金属内植物生物惰性的重要手段。目前人们已经开发了许多表面改性方法来改善钛合金植入物的促成骨能力,例如将水凝胶、钙基材料、金属元素等材料结合于钛合金表面赋予其优异的骨诱导性，令支架与宿主骨之间形成良好的骨性结合[11-13]。
甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl，Gelma)由明胶改性而来，合成过程中明胶的羟基、氨基被取代，得到不稳定的碳碳双键，但明胶分子链上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸片段和基质金属蛋白酶的靶基序得到保留，因而保留了明胶促进细胞黏附、组织重塑的特性，并且具有良好的生物相容性和可降解性[14-17]；同时，甲基丙烯酸酐基团引入的光交联特性使之可以更好地维持结构形态。丙烯酰胺单体具有良好的水溶性，可经过交联剂迅速转化为聚丙烯酰胺[poly(acrylamide)，PAAM]水凝胶。PAAM不仅具有良好的力学性能，其在分子链上含有丰富的酰胺官能团，具有亲水性与较高的溶胀能力，有益于细胞的迁移、生长和分化[18-20]。
实验利用Gelma利于成骨细胞黏附的特性及PAAM稳定性强的特性，将两种水凝胶结合并对材料进行了系列表征和体外细胞实验，验证了复合材料优异的生物相容性和促成骨能力，证明了复合水凝胶在钛合金表面的黏附更为稳定，更能满足促成骨细胞的生长需求，成功改良了钛合金表面的金属惰性，为骨组织工程促成骨技术提供一种新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料合成与细胞学体外实验，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年1-7月在徐州医科大学公共实验室、骨组织再生与数字医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 支架与细胞钛合金支架(Ti-6Al-4V)由徐州医科大学公共实验室提供；大鼠骨髓间充质干细胞(中科院上海细胞库)。
1.3.2 主要试剂 Gelma(Engineering For Life公司，中国)；丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、三聚膦酸钠、四甲基乙二胺(麦克林，中国)；MEM-α培养基、胎牛血清、胰酶(普诺赛，中国)；地塞米松、α-抗坏血酸、β-甘油膦酸、氯化十六烷基吡啶(Sigema，美国)；CCK-8 试剂盒(同仁，日本)；Calcein-AM/PI染色剂、茜素红染色剂、碱性磷酸酶试剂、多聚甲醛(索莱宝，中国)；碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒(碧云天，中国)；鬼笔环肽、Triton X-100 (Vicmed，中国)；亲和硅烷(生工，中国)； TRIeasy RNA提取试剂(Thermo，美国)；反转录试剂盒、SYBR Green RealMasterMix(MCE，美国)。
1.3.3 主要仪器超净工作台、细胞培养箱 (Thermo Fisher，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)；扫描电镜(FEI，捷克)；真空冷冻干燥机(金实，中国)；精密电子分析天平 (上海天平仪器厂)；磁力加热搅拌仪 (IKA，德国)；ProFlex PCR仪(Life，美国)；PCR 反应仪(Eppendorf，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 材料合成将钛合金支架依次用无水乙醇、丙酮、氧等离子机器清洗后，浸入亲和硅烷中24 h后取出备用。将Gelma(质量分数20%)、丙烯酰胺(质量分数10%)加入10 mL去离子水中混合，然后加入亚甲基双丙烯酰胺(质量分数0.04%)、三聚膦酸钠(质量分数0.01%)、过硫酸铵(质量分数0.09%)、四甲基乙二胺(质量分数0.025%)，50 ℃反应1 h，得到Gelma-PAAM水凝胶。同理制备单纯的Gelma水凝胶。将钛合金支架分别浸入Gelma、Gelma-PAAM水凝胶中12 h，取出后用去离子水缓慢冲洗2次，得到的支架分别记为Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM。
1.4.2 材料表征实验
降解率：将Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM支架分别浸入5 mL PBS中，每3 d换液并取出支架，冻干称质量，计算水凝胶降解率。测量3次，取平均值。降解率(%)=(m0-mt)/m0×100%，其中m0为初始水凝胶的质量，mt为各时间点水凝胶的质量。
溶胀比：取一定质量(m0)的Gelma、Gelma-PAAM水凝胶，于室温下浸泡于5 mL PBS中。在不同的时间点将水凝胶取出，擦去多余的水后称质量(mt)。水凝胶溶胀比(%)=(mt-m0)/m0×100%。
水凝胶的稳定性：将钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架分别放入-40 ℃冰箱预冷冻30 min，放入冻干机冻干后喷金，置于扫描电镜5 kV下拍摄。
1.4.3 细胞培养及成骨诱导培养液配置将大鼠骨髓间充质干细胞接种于细胞培养瓶，添加含体积分数10%血清、1%青霉素和1%链霉素的MEM-α培养基(完全培养基)，置于细胞培养箱中(37 ℃，体积分数5%CO2)培养，两三天换液1次。倒置显微镜下观察细胞融合近80%时传代，取前5代细胞进行实验。
将地塞米松(10 nmol/L)、α-抗坏血酸(50 μg/mL)、β-甘油膦酸(10 mmol/L)加入MEM-α完全培养基中，配置成骨诱导培养液。
1.4.4 支架表面细胞黏附观察将单纯钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架分别置于24孔板底部，然后接种大鼠骨髓间充质干细胞悬液，细胞密度为5×104/孔，每组设置3个复孔。培养5 d后，去除培养基，用PBS清洗2次，无水乙醇、叔丁醇梯度脱水，放入冻干机冻干，喷金后置于扫描电镜下观察。
1.4.5 细胞与钛合金支架共培养后的细胞增殖检测将钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架分别置于96孔细胞培养板底部，然后接种大鼠骨髓间充质干细胞悬液，细胞密度1×103/孔，每组设置3个复孔，隔天换液。培养1，4，7 d后，每孔加10 μL CCK-8溶液孵育30 min，酶标仪下检测吸光度值。
1.4.6 细胞与钛合金支架共培养后的细胞活性检测将单纯钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架分别置于24孔细胞培养板底部，然后接种大鼠骨髓间充质干细胞悬液，细胞密度1×10⁵/孔，每组设置3个复孔。培养3 d后，去除培养基，用Assay Buffer浸洗 2 min，依照说明书配置合适浓度的活-死细胞染色A、B液避光孵育30 min时间，用 PBS冲洗3遍，置于荧光显微镜下观察。
1.4.7 细胞与钛合金支架共培养后的成骨分化能力检测
碱性磷酸酶染色：将钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架分别置于6孔板底部，然后接种大鼠骨髓间充质干细胞，细胞密度2×10⁵/孔，加入2 mL成骨诱导培养液，每2 d换液1次。培养14 d后，去除培养基，加入2 mL 40 g/L多聚甲醛固定15 min，洗净后加孵育液孵育20 min，甲基绿染色5 min，然后置于显微镜下观察。同时，严格按照碱性磷酸酶检测试剂盒说明书操作，利用细胞裂解液提取细胞成分，将上清液与试剂盒中工作液混合，并使用 BCA 蛋白检测试剂盒测量上清液中的蛋白质浓度。
茜素红染色：如碱性磷酸酶分组处理21 d后，去除培养基，加入2 mL 40 g/L多聚甲醛溶液室温固定30 min，洗净后加入2 mL茜素红染液室温染色10 min，用PBS清洗，置于显微镜下观察。同时，弃净上清，加入10%氯化十六烷基吡啶溶解钙结节，使用紫外分光光度计波长562 nm处测样本吸光度值。

实时荧光定量PCR检测成骨基因表达：如碱性磷酸酶分组处理7 d后，按说明书加入TRIeasy裂解液、氯仿等提取细胞总RNA，再利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，最后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Runx2和骨桥蛋白的mRNA表达。反应条件：95 ℃，5 min 热启动 DNA 聚合酶，95 ℃，15 s变性，60 ℃，30 s退火/延伸，共循环40次。引物序列见表1。

1.4.8 细胞与钛合金支架共培养后的细胞骨架观察将大鼠骨髓间充质干细胞以2×10⁵/孔的密度铺入共聚焦皿中，加入约2 mL完全培养基，分别与单纯钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架共培养。共培养5 d后，先用40 g/L多聚甲醛冰上固定15 min，然后用0.5%TritonX-100透化10 min，洗净后按照说明书配置适宜浓度鬼笔环肽染液染色20 min，置于荧光显微镜下观察。将图片导入image j软件计算细胞伸展荧光面积。
1.5 主要观察指标 Gelma、Gelma-PAAM水凝胶的溶胀比与降解率；钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架的微观形貌，以及对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化与细胞骨架的影响。
1.6 统计学分析实验中的数据用 SPSS 25软件进行处理，数据用x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验，P < 0.05 为差异有显著性意义。该文统计学方法已经由徐州医科大学统计学专家审核。

讨论

钛合金具有优异的力学性能及良好的生物相容性、耐腐蚀性、抗疲劳性好等优点，是骨科应用最广泛的种植材料之一，然而钛合金种植体仍然面临着材料表面缺乏骨诱导性、骨整合率低等临床问题，因此如何改良钛合金的生物特性来优化其生物功能，保证植入物的理想性能是至关重要的[21-24]。作为钛种植体与生物环境相互作用的唯一场所，通过表面修饰促进骨整合已被广泛研究。其中水凝胶涂层能够均匀地包裹于钛种植体表面，构建了一种特殊的生物涂层“缓冲区”，利用水凝胶优良的细胞亲和性在种植初期引导细胞浸润，促进种植体与宿主之间的生物黏附，加速成骨进程[25-26]；另一方面，水凝胶包衣的存在可利于负载药物、生物活性分子等，并为其控释提供可能[27-29]。但是，常规的物理方法修饰金属表面无法形成稳定的结合，在植入过程中涂层容易从钛上脱落，导致表面改性失败。为了解决这一问题，利用化学锚定技术将水凝胶涂层固定在基材上提高其附着力和稳定性，已成为一种可行的方法[30-31]。
单一的Gelma存在力学性能及稳定性不足的缺点，难以满足实际应用的需求，为了提升明胶水凝胶的力学性能及其稳定性，研究者们尝试多种方法，包括引入物理或化学交联、双网络、大分子微球和纳米复合网络等对水凝胶结构进行改性增强。双网络水凝胶由2个相互渗透大分子网络交联而成，即刚性和柔性网络，两种网络具有不同的力学性能和化学特性，目前双网络水凝胶策略已被广泛用于提高水凝胶的机械强度和理化性质[32-35]。正是由于PAAM作为第二网络柔性相，其参与所形成的复合水凝胶网络能够表现出优异的力学性能[36-37]，因此实验以Gelma为主体，通过结合具有良好柔性性能的聚丙烯酰胺制备出兼具良好促成骨和力学性能的复合水凝胶。
此次实验水凝胶降解检测结果显示，Gelma-PAAM水凝胶相较于Gelma的稳定性更强，能更长时间附着于支架上。扫描电镜观察可以看到Gelma-PAAM水凝胶将支架表面包裹良好，支架孔隙中也被水凝胶所填充，这可为细胞长入提供良好的条件[38]。骨髓间充质干细胞是被用于评估成骨能力最为常用的细胞。实验中细胞黏附实验、CCK-8和细胞活-死染色实验结果表明，Gelma-PAAM水凝胶对骨髓间充质干细胞无明显的毒性，且细胞生长状态良好。在体外实验中，碱性磷酸酶、茜素红染色是评价成骨能力的重要指标[39]，其表达强度一定程度上反映了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力[40]。此次实验针对这2项指标进行评估，验证不同分组下的骨髓间充质干细胞成骨分化的差异，结果表明Ti-Gelma-PAAM组细胞碱性磷酸酶染色阳性程度最高，强于Ti-Gelma组和单纯钛合金支架组；茜素红染色显示，Ti-Gelma-PAAM组钙盐沉积数量均明显大于其他两组，并且实时荧光定量PCR检测显示该组细胞内相关成骨基因mRNA表达水平最高。以上这些结果均表明，将Gelma-PAAM复合水凝胶接枝于钛合金支架上具有更强的稳定性，且能够更好地发挥促骨髓间充质干细胞成骨分化作用。
综上所述，实验构建了一种适宜改良钛合金金属表面成骨惰性的复合水凝胶材料，该复合水凝胶材料具有良好的生物相容性、稳定性和优异的促成骨能力，为改良钛合金内植物表面成骨惰性提供一个新的思路。当然实验目前还存在着一些不足，例如还需要进一步验证复合水凝胶在体内的成骨能力，其促成骨作用的具体机制还需要深入的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

聚丙烯酰胺改良甲基丙烯酰化明胶接枝钛合金支架的促成骨性能

Osteogenic properties of polyacrylamide-modified gelatin methacryloyl grafted titanium alloy scaffold

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