活性屏等离子表面改性技术制备纳米银涂层不锈钢的体外抗菌性能

doi:10.12307/2024.486

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3464-3471.doi: 10.12307/2024.486

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活性屏等离子表面改性技术制备纳米银涂层不锈钢的体外抗菌性能

王兆飞1，何国云1，田方灿2，李广峰1，曹中华1，刘祥飞1

1上海中冶医院骨科，通用技术环球医疗，上海市 200941；2宣威市第二人民医院骨科，云南省宣威市 655099

收稿日期:2023-08-02 接受日期:2023-09-28 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 刘祥飞，副主任医师，上海中冶医院骨科，通用技术环球医疗，上海市 200941
作者简介:王兆飞，男，1992年生，安徽省亳州市人，汉族，哈尔滨医科大学在读博士，主治医师，主要从事骨与软组织感染、慢性创面修复的临床与基础研究。
基金资助:
上海市宝山区科学技术委员会科技创新专项资金(20-E-38)，项目负责人：王兆飞；上海市宝山区卫生健康委优青(育才)计划项目(BSWSYC-2023-15)，项目负责人：王兆飞；上海市宝山区科学技术委员会科技创新专项资金(2023-E-27)，项目参与人：王兆飞

Antibacterial properties of silver nanoparticle-coated stainless steel prepared via active screen plasma surface modification in vitro

Wang Zhaofei1, He Guoyun1, Tian Fangcan2, Li Guangfeng1, Cao Zhonghua1, Liu Xiangfei1

1Department of Orthopedic Surgery, Shanghai ZhongYe Hospital, Genertec Universal Medical Group, Shanghai 200941, China; 2Department of Orthopedic Surgery, Xuanwei Second People’s Hospital, Xuanwei 655099, Yunnan Province, China

Received:2023-08-02 Accepted:2023-09-28 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Liu Xiangfei, Associate chief physician, Department of Orthopedic Surgery, Shanghai ZhongYe Hospital, Genertec Universal Medical Group, Shanghai 200941, China
About author:Wang Zhaofei, Doctoral candidate, Attending physician, Department of Orthopedic Surgery, Shanghai ZhongYe Hospital, Genertec Universal Medical Group, Shanghai 200941, China
Supported by:
Science and Technology Commission of Baoshan District of Shanghai, No. 20-E-38 and 2023-E-27 (to WZF); Baoshan District Health Commission Excellent Youth (Yucai) Program, No. BSWSYC-2023-15 (to WZF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

活性屏等离子体技术：由英国伯明翰大学冶金与材料学院表面工程教授董汉山首次提出，通过高压离子场轰击多孔纯银活性屏，将银离子“埋入”不锈钢基质深层形成具有抗菌能力的银离子涂层材料；此外，由于银离子是“包覆”在不锈钢基质材料中，与不锈钢基质紧密结合，其抗菌能力“持久不衰”。
低温渗碳工艺：通过低温渗碳在不锈钢表面得到的S相，进一步显著提高了不锈钢的耐磨性、耐腐蚀性、硬度、耐疲劳性，在医学、生物等领域有广泛的应用前景。

背景：既往利用活性屏等离子技术制备的银涂层大都不涉及纳米领域，形成的银涂层为“薄膜样”，被覆基质表层且表面银颗粒分布不均，其长效抗菌能力受到挑战。

目的：采用活性屏等离子体表面改性(ASPSM)技术制备可“埋入”不锈钢(SS)基质内部的纳米银涂层，观察其抗菌能力。
方法：以不锈钢为基体，采用ASPSM技术制备纳米银涂层，其中通过调整轰击时间(1，2，4 h)制备3组涂层样品，分别记为1 h-Ag-ASPSM@SS、2 h-Ag-ASPSM@SS和4 h-Ag-ASPSM@SS，通过抑菌环实验、革兰染色分析3组涂层的抗菌能力。以不锈钢为基体，制备庆大霉素联合万古霉素抗生素涂层样品，记为ACNs。将不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs分别插入金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌悬液中，采用涂布平板法分析样品长效(84 d)抗菌能力。将骨髓间充质干细胞分别与不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs共培养，进行CCK-8、活死染色与细胞上清乳酸脱氢酶活性检测。取连续暴露于金黄色葡萄球菌悬液12周后的不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs，采用滚平板法评估材料表面残留活菌量，采用万古霉素药敏纸片法评估材料表面残留活菌耐药性。

结果与结论：①随着轰击时间的延长，样品表面纳米银的直径与含量逐渐增加，其中2 h-Ag-ASPSM@SS在形成了均匀球形纳米颗粒的情况下表面银含量较高。②抑菌环实验、革兰染色显示，相较于1 h-Ag-ASPSM@SS、4 h-Ag-ASPSM@SS，2 h-Ag-ASPSM@SS对金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌有更好的抑制效果。与两种细菌共培养42，84 d后，2 h-Ag-ASPSM@SS组洗脱液涂布平板上的活菌数量显著少于不锈钢组、ACNs组；与金黄色葡萄球菌共培养84 d后、与铜绿假单胞菌共培养42 d后，ACNs组洗脱液涂布平板上的活菌数量多于不锈钢组。③CCK-8、活死染色与细胞上清乳酸脱氢酶活性检测显示，2 h-Ag-ASPSM@SS无明显的细胞毒性，ACNs具有明显的细胞毒性。④与金黄色葡萄球菌共培养12周后，2 h-Ag-ASPSM@SS组表面残留活菌量少于不锈钢组，ACNs组表面残留活菌量多于不锈钢组；与不锈钢组比较，ACNs组表面残留活菌株对万古霉素的敏感性显著下降(P < 0.001)，2 h-Ag-ASPSM@SS组表面残留活菌株对万古霉素的敏感性无明显变化(P > 0.05)。⑤结果表明，ASPSM技术制备的纳米银涂层提高了不锈钢表面纳米银含量的沉积效率，并且具有持久的抗菌特性、良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 活性屏等离子, 纳米银颗粒, 不锈钢, 抗生素骨水泥, 抗菌性, 耐药性, 植入物相关性感染

Abstract: BACKGROUND: Most of the silver coating materials prepared using active screen plasma technology in the past do not involve the nanotechnology field. The formed silver coating is in a “thin film” form, which is coated on the surface of the substrate, and the distribution of silver particles on the surface is uneven. Its long-term antibacterial ability is challenged.
OBJECTIVE: To prepare nano silver coatings capable of being “buried” within stainless steel (SS) substrates using active screen plasma surface modification (ASPSM) and to observe antibacterial activity.
METHODS: The nano-silver coating was prepared by ASPSM technique on stainless steel substrate. Three groups of coating samples were prepared by adjusting the bombardment time (1, 2, and 4 hours), which were denoted as 1 h-Ag-ASPSM@SS, 2 h-Ag-ASPSM@SS and 4 h-Ag-ASPSM@SS, respectively. The antibacterial activity of the coatings was analyzed by antibacterial ring test and Gram staining. The antibiotic coating samples of gentamicin combined with vancomycin were prepared by using stainless steel as substrate and were recorded as ACNs. Stainless steel, 2 h-Ag-ASPSM@SS, and ACNs were inserted into Staphylococcus aureus or Pseudomonas aeruginosa suspension, respectively. The long-acting (84 days) antibacterial activity of the samples was analyzed by coating plate method. Bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with stainless steel, 2 h-Ag-ASPSM@SS, and ACNs, respectively. CCK-8 assay, dead/alive staining, and lactate dehydrogenase activity of cell supernatant were detected. Stainless steel, 2 h-Ag-ASPSM@SS, and ACNs were taken after continuous exposure to Staphylococcus aureus suspension for 12 weeks. The amount of residual viable bacteria on the surface of the material was evaluated by spread plate method. Vancomycin drug sensitive disk method was used to evaluate the resistance of residual live bacteria on the surface of materials.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With increasing bombardment time, the diameter of nano silver on the sample surface and the silver content in the coating gradually increased. Among them, the 2 h-Ag-ASPSM@SS exhibited the highest surface silver content while forming uniformly spherical nanoparticles. (2) Antibacterial ring test and Gram staining results demonstrated that compared with 1 h-Ag-ASPSM@SS and 4 h-Ag-ASPSM@SS, the 2 h-Ag-ASPSM@SS exhibited better inhibitory effect on Staphylococcus aureus and pseudomonas aeruginosa. After co-culturing with bacteria for 42 and 84 days, the number of viable bacteria on the spread plate method was significantly lower in the 2 h-Ag-ASPSM@SS group compared to the stainless steel and ACNs groups. After co-culturing with Staphylococcus aureus for 84 days and Pseudomonas aeruginosa for 42 days, the number of viable bacteria on the surface of the eluate from the ACNs group was higher than that of the stainless steel group. (3) CCK-8 assay, live/dead staining and lactate dehydrogenase activity of cell supernatant displayed that 2 h-Ag-ASPSM@SS did not have obvious cytotoxicity. ACNs showed obvious cytotoxicity. (4) After co-culture with Staphylococcus aureus for 12 weeks, the residual viable bacteria on the surface of 2 h-Ag-ASPSM@SS group was less than that of stainless steel group, and the residual viable bacteria on the surface of the ACNs group was more than that of stainless steel group. Compared with the stainless steel group, the sensitivity to vancomycin was significantly decreased in the ACNs group (P < 0.001), and there was no significant change in sensitivity to vancomycin in 2 h-Ag-ASPSM@SS group (P > 0.05). (5) The above results indicate that the silver nanoparticle coated stainless steel greatly improves the deposition efficiency of silver nanoparticles on the stainless steel surface and has long-lasting antibacterial properties and good cell compatibility.

Key words: active screen plasma, silver nanoparticle, stainless steel, antibiotic bone cement, antimicrobial property, drug resistance, implant-related infection

中图分类号:

王兆飞, 何国云, 田方灿, 李广峰, 曹中华, 刘祥飞. 活性屏等离子表面改性技术制备纳米银涂层不锈钢的体外抗菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3464-3471.

Wang Zhaofei, He Guoyun, Tian Fangcan, Li Guangfeng, Cao Zhonghua, Liu Xiangfei. Antibacterial properties of silver nanoparticle-coated stainless steel prepared via active screen plasma surface modification in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3464-3471.

图/表（结果） 6

2.1 各组Ag-ASPSM@SS的表征结果扫描电镜下观察3组样品的表面形貌，见图2A。在1 h-Ag-ASPSM@SS和2 h-Ag-ASPSM@SS样品中，纳米银颗粒几乎是球形的，颗粒分散良好；在4 h-Ag-ASPSM@SS样品中，纳米银颗粒聚集形成了一个链状的岛状和层状结构，大小不一，呈弥散分布。从X射线能谱图来看，随着攻击时间的延长Ag-ASPSM@SS表面的银含量增加，1 h-Ag-ASPSM@SS、2 h-Ag-ASPSM@SS、4 h-Ag-ASPSM@SS分别约含有8.90%，32.98%与49.28%的银，组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2B。在1 h-Ag-ASPSM@SS样品中大多数纳米银颗粒的直径约为60 nm，然而随着Ag-ASPSM轰击时间增加到2，4 h，纳米银颗粒的直径逐渐增大到约80 nm和400 nm，组间比较差异有显著性意义(P < 0.001)，见图2C。
样品内部的腐蚀区域是不锈钢基体，样品边缘的白色光亮部分是渗碳层，腐蚀金相检测显示，1 h-Ag-ASPSM@SS和2 h-Ag-ASPSM@SS样品的平均渗碳厚度分别为5 μm和6 μm，4 h-Ag-ASPSM@SS样品的渗碳层的平均厚度为6 μm，与2 h轰击的样品接近，见图2D。
X射线衍射分析显示，除不锈钢外，3组Ag-ASPSM@SS样品基本上都没有杂乱的峰，这些峰主要在2θ范围内，即38.11°(111)，44.28°(200)，64.43°(220)，77.47°(311)和81.54°(222)。结果还显示随着轰击时间的增加，银涂层的厚度增加，不锈钢衍射峰强度开始下降。然而随着沉积时间的增加，银涂层的(111)取向趋于减弱，取向系数从66.5%下降到40.0%，其他取向(200)(220)(311)和(222)的取向系数逐渐提高，有上升趋势，见图2E。

2.2 各组Ag-ASPSM@SS体外抗菌能力与杀菌性能
抗菌能力：对于金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株与铜绿假单胞菌ATCC27853菌株，材料A5(空白对照不锈钢)没有显示出明显的抑菌环；对于金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株，材料A1、A2、A3和A4的抑菌环直径分别为(6.70±0.02)，(7.73±0.12)，(7.54±0.01)，(17.56±0.76) mm，材料组间比较差异有显著性意义(P <0.05，P < 0.000 1)；对于铜绿假单胞菌ATCC27853菌株，材料A1、A2、A3和A4的抑菌环直径分别为(6.25±0.02)，(7.76±0.03)，(7.26±0.02)，(17.24±1.70) mm，材料组间比较差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.000 1)，见图3A-C。
综合来看，材料A2(2 h-Ag-ASPSM@SS)对金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853呈现出更好的抑制效果，比万古霉素和多黏菌素药敏纸片的效果略差。
杀菌性能：将各组样品浸入金黄色葡萄球菌悬液中，观察细菌悬浮液底部的絮状物质沉积程度，可见A2组底部有明显的絮状物沉积，这代表了死亡细菌的沉积；A4组底部有明亮和清晰的物质，表明A2组材料在24 h内具有更好的有效杀菌效果；此外，革兰染色结果与上述现象一致，见图3D，E。

2.3 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs的体外长效抗菌能力比较图4展示了各组样品与细菌培养后特定时间点的涂布平板计数结果。在所有的时间节点(1，7，21，42，84 d)，2 h-Ag-ASPSM@SS样品表面的金黄色葡萄球菌数量明显低于无涂层不锈钢组，表明2 h-Ag-ASPSM@SS样品对抑制金黄色葡萄球菌的定植有长期效果，其在84 d后仍能够显著减少金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的黏附。意外的是，培养84 d后，ACNs样品表面黏附的细菌菌落数量明显多于无涂层不锈钢。涂布平板计数定量分析结果显示，2 h-Ag-ASPSM@SS在1，7，21，42和84 d对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为100%，98.29%，88.81%，80.87%和71.39%；ACNs在1，7，21，42和84 d对金黄色葡萄球菌的抑菌率的抑菌率为100%，99.18%，50.47%，24.16%和-21.13%。与2 h-Ag-ASPSM@SS相比，ACNs呈现出强大的初始杀菌效果，然而随着时间的推移，ACNs的抑菌能力明显下降，甚至促进了细菌的黏附。

扫描电镜观察结果同样验证了上述情况，可以观察到随着培养时间放入延长，3组材料表面黏附细菌数量逐渐增加，2 h-Ag-ASPSM@SS组表面各时间点黏附细菌落数明显少于无涂层不锈钢组，在84 d时ACNs组表面黏附的菌落数量甚至超过了无涂层不锈钢组，见图5。

2.4 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs的体外细胞相容性如图6A所示，与无涂层不锈钢组比较，2 h-Ag-ASPSM@SS组培养24，72 h的细胞活力无明显变化(P > 0.05)，ACNs组培养24，72 h的细胞活力降低(P < 0.001)。Calcein-AM/PI双重染色显示，与无涂层不锈钢组比较，2 h-Ag-ASPSM@SS组培养24，72 h的活细胞、死细胞数量无明显变化，ACNs组培养24，72 h的活细胞数量减少、死细胞数量增加，见图6B。如图6C所示，与无涂层不锈钢组比较，2 h-Ag-ASPSM@SS组培养24，72 h的细胞上清液内乳酸脱氢酶活性无明显变 (P > 0.05)，ACNs组培养24，72 h的细胞上清液内乳酸脱氢酶活性升高(P < 0.001)。

2.5 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs表面残留活菌及耐药性比较培养6，12周后的哥伦比亚血平板上滚动培养结果显示，与无涂层不锈钢组比较，2 h-Ag-ASPSM@SS组表面黏附的残留活菌量减少；ACNs组培养12周后的表面黏附的残留活菌量多于无涂层不锈钢组，经分离、纯化和培养后，与无涂层不锈钢组比较，ACNs组表面残留活菌株对万古霉素的敏感性显著下降(P < 0.001)，2 h-Ag-ASPSM@SS组无明显变化(P > 0.05)，见图7。

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引言

与植入物相关的感染仍然是现代创伤骨科手术的主要并发症，由于这些植入物材料本身并不具有天然的抗感染能力，即使采用规范严苛的治疗方案，严重开放性骨折的感染风险仍高于30%[1-2]。黏附在植入物表面的细菌会形成生物膜，而机体的免疫细胞及抗生素难以有效杀伤生物膜内部细菌，一旦细菌黏附在植入物上，诱发感染所需的菌落浓度将降低10万倍以上[3]。基于该原因，尽管经过了长时间的抗菌药物治疗，感染仍难以彻底消除；此外，长期应用抗生素将面临全身毒副作用、细菌耐药性等问题[4-5]。因此，有效控制植入物表面细菌的黏附及生物膜形成是彻底根治植入物相关性感染的决定因素[6]。
银(Ag)自古以来便作为一种广谱而安全的杀菌剂，纳米化银在抗感染方面更是具有独特的疗效，小尺寸赋予了纳米银颗粒极高的反应活性，纳米颗粒的巨大比表面积极大增加了与细菌的接触面积，使细菌产生大量活性氧自由基，导致细菌细胞内多种关键酶的失活[7-9]。目前制备纳米银涂层材料多采用硝酸银沉淀技术、电化学还原镀银以及其他利用生物材料合成纳米银等[10-12]，这些方法在形成纳米银颗粒的前提下，材料表面镀银十分稀疏且极易从材料表层脱落，表面银含量仅约2%，难以达到局部长效释放高浓度银离子的目的[9]。为解决涂层材料表面银颗粒极易脱落的问题，英国伯明翰大学学者发明了“活性屏等离子体技术”，将被涂层的材料放置在网筛衬里(由金属银单质材料构成)形成的低压室内，在目标物体和衬里之间施加一个高压电势，从而在腔室内形成一种等离子体，当等离子体在高压电场作用下撞击目标物体途中穿过网筛时，网筛的银成分将在离子场的“轰击”下埋入不锈钢内部，显著提高材料表面银的黏附性、延长材料表面的抗菌作用时间[13-14]。但该工艺常常形成粗糙的“薄膜样”银单质涂层，而非均匀分布的“纳米颗粒”涂层。课题组通过改进“活性屏等离子技术”，利用多孔双层杯状纯银网筛(活性屏)在不锈钢表层形成了均匀一致的纳米银颗粒涂层。此次实验利用活性屏等离子表面改性(active screen plasma surface modification，ASPSM)技术制备纳米银颗粒涂层不锈钢，进行体外抗细菌黏附与生物膜形成、杀菌性能、细胞毒性、诱导细菌耐药性等方面的研究，并与当前临床广泛使用的抗生素骨水泥涂层不锈钢髓内针(antibiotic bone cement nails，ACNs)对比，探究该工艺制备纳米银涂层材料的长效抗菌能力及生物安全性，以期尝试开发出具备强大的长效抗菌能力的纳米银颗粒涂层材料。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备表征及体外抗菌能力、细胞毒性实验，组间比较进行t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)或非参数Kruskal-Wallis H检验。
1.2 时间及地点实验于2021年5月至2022年7月在上海交通大学医学院附属第九人民医院北院动物中心、上海甲干动物研究所、上海交通大学材料科学与工程学院完成。
1.3 材料涂层材料及银活性屏网筛均由上海交通大学材料科学与工程学院提供，材料基体为316L不锈钢，Ag-ASPSM涂层材料分别被制备成直径6 mm的圆片状与长度30 mm、直径2 mm的棒状，各组材料均经过25 Gy γ射线充分照射灭菌；克氏针(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)；标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853(上海市第九人民医院检验科)；人骨髓间充质干细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；MH培养平板、哥伦比亚血平板(上海科玛嘉微生物技术有限公司)；含EDTA的胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco，美国)；Calcein-AM/PI活/死细胞双重染色试剂盒(Beyotime，中国)；聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(Heraeus，德国)；盐酸万古霉素(VIANEX S.A，希腊)；硫酸庆大霉素(四川大冢制药有限公司)；扫描电镜(TESCAN，捷克)；2.5%中性戊二醛固定液(上海鼎国生物科技有限公司)；D500 X射线衍射仪(Siemens，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 Ag-ASPSM涂层材料的制备与表征分析

涂层材料的制备：为了在实验中确定最佳的银活性屏网筛轰击条件，以直径为6 mm、厚度1 mm的圆形不锈钢以及长度30 mm、直径2 mm的柱状不锈钢为基体，使用180X和400X砂纸进行表面打磨，在高频超声下使用乙醇、丙酮和去离子水清洗，以除去表面的污渍和氧化膜，用作进一步表面涂层纳米银。靶材为99.9%的多孔双层杯状纯银网筛，直径8 cm，其双层形式能使等离子体轰击靶材时将更多银离子击出聚结在样品上，得到更加致密且均匀的纳米银涂层。将样品分成2组：一组是以时间为参数的溅射工艺变量(1，2，4 h)，另一组是以H2、CH4和Ar混合气体为参数的工艺变量。真空提取直到腔室中的气压达到1.33 Pa的真空度。经过初步筛选，确定H2∶Ar∶CH4的气体流量比为300∶50∶5，压力恒定为400 Pa。将样品置于Ag-ASPSM轰击环境中1，2 或4 h，得到的材料分别命名为1 h-Ag-ASPSM@SS、2 h-Ag-ASPSM@SS和4 h-Ag-ASPSM@SS(图1)。此后，进一步在低温(400 ℃)环境下对工作腔室通入CH4气体，气体渗碳处理5 h以加强材料表面颗粒与不锈钢基质结合力，更好地保护材料免受腐蚀[15]。

涂层材料的表征：采用扫描电镜分析3种涂层样品表面纳米银颗粒的大小、形状、分布等局部微观结构。利用电子束与涂层表面作用时产生的特征X射线，配合扫描电镜来获取X射线能谱图，图中谱峰代表样品中存在的元素组成及含量。为了较准确地观测渗碳层厚度，实验对纳米银涂层样品的截面进行了腐蚀处理，由于渗碳层和不锈钢基体间有较为明显的界限，可以使用500倍光学显微镜观察和测量渗碳层厚度。为了有效分析涂层表面晶体结构组成，用X射线衍射仪，以5 (°)/min扫描速度、步长是0.02°、扫描范围为20°-100°对不同轰击时间参数样品进行扫描。
1.4.2 ACNs的制备参考既往临床病例报道的文献[16]，将2.0 g庆大霉素和2.0 g万古霉素加入到40 g聚甲基丙烯酸甲酯粉末中，在彻底混合并研磨成更细的颗粒后，使用二氧化碳低温等离子体灭菌系统对化合物灭菌。将上述混合抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯中加入单体液(通常多于单批次骨水泥所需的量，用于补偿大量抗生素)，然后倒入20 mL注射器中，低温下保存，以便于在较长时间内保持液体形式。直径2.0 mm的硅胶管预先在2%戊二醛溶液中灭菌。使用直径0.8 mm克氏针金属丝作为内部支撑芯材，以赋予骨水泥涂层结构强度，克氏针表面用砂轮进行表面粗糙化处理，以增大抗生素骨水泥对克氏针表面的黏附力。在骨水泥完全凝固之前，将液态抗生素骨水泥注射到硅胶管中，继而将上述0.8 mm克氏针插入到硅胶管中。待骨水泥彻底凝固以后，用手术刀片切开硅胶管并切割成长度约30 mm、直径2 mm的柱状。
1.4.3 金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的培养根据当前植入物相关性感染的微生物学特征，针对骨科植入物相关性感染的致病菌多为金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌[9]，因此实验采用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)。挑取两菌种单个菌落，分别置于装有10 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的50 mL离心管中，摇动并恒温培养(1 000 r/min，37 ℃，体积分数5.5%CO2+体积分数21%O2环境)。培养12 h后，将1 mL细菌溶液在1.5 mL离心管中5 000×g离心5 min，用PBS清洗上清液，将底部细菌吹打混匀，根据麦氏比浊法确定此时的细菌悬液浓度，将细菌浓度调整为1×106 CFU/mL并分装于安瓿瓶中备用。
1.4.4 Ag-ASPSM@SS样品的抗菌能力与杀菌性能
抗菌能力：①实验菌株的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为1×106 CFU/mL实验菌悬液(金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌)，在营养琼脂培养基平板(MH平板)表面均匀涂抹3次。每涂抹1次平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5 min。②样片贴放：每个平板贴放5片圆形实验样片，在抗金黄色葡萄球菌抑菌环实验中，样品分别对应编号为A1(4 h-Ag-ASPSM@SS)、A2(2 h-Ag-ASPSM@SS)、A3(1 h-Ag-ASPSM@SS)、A4(阳性对照万古霉素药敏纸片)、A5(阴性对照不锈钢圆片)；在抗铜绿假单胞菌抑菌环实验中，样品分别对应编号为A1(4 h-Ag-ASPSM@SS)、A2(2 h-Ag-ASPSM@SS)、A3(1 h-Ag-ASPSM@SS)、A4(阳性对照多黏菌素B药敏纸片)、A5(阴性对照不锈钢圆片)。用无菌镊子取样片贴放于MH平板表面，各样片中心之间相距25 mm以上，与平板的周缘相距15 mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片使其紧贴于平板表面，盖好平皿，置37 ℃温箱培养16-18 h，用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。实验重复3次。
杀菌性能：在37 ℃下，将不锈钢、1 h-Ag-ASPSM@SS、2 h-Ag-ASPSM@SS、4 h-Ag-ASPSM@SS分别浸泡于金黄色葡萄球菌悬液中，细菌浓度为1×106 CFU/mL。浸泡24 h后，观察安瓿瓶中菌悬液浑浊度，超声振荡收集各组细菌，对洗脱液进行革兰染色。
1.4.5 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs的体外长效抗菌能力对比将灭菌的不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs分别插入含有3 mL金黄色葡萄球菌(ATCC25923)或铜绿假单胞菌(ATCC27853)悬液的安瓿瓶中，细菌浓度为1×106 CFU/mL，每组设置3个重复，在37 ℃下静置培养，每三四天换液1次。于设定的时间点(1，7，21，42，84 d)转移到含有细菌悬浮液的新鲜安瓿瓶中，采用涂布平板法定量评估样品的长效体外抗菌性能。抑菌率=(不锈钢组活细菌数-实验样品组活细菌数)/不锈钢组活细菌数×100%。此外，静态培养不同时间的样品用无菌PBS清洗3次，然后固定在2.5%中性戊二醛溶液中，梯度乙醇中脱水，置于扫描电镜下拍照，定性评估抗细菌生物膜性能。
1.4.6 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs的细胞相容性
CCK-8实验与细胞活死染色：将不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs分别放于24孔板内，随后均匀接种人骨髓间充质干细胞悬液，细胞密度2×104/孔，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养24，72 h，使用CCK-8法在450 nm处检测吸光度值，计算细胞活力；使用Calcein-AM/PI双重染色试剂盒观察细胞在材料表面的黏附和存活，荧光显微镜下使用(490±10) nm 激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)及死细胞(红色荧光)，使用545 nm的发射滤片观察死细胞。
乳酸脱氢酶活性测定：乳酸脱氢酶是机体能量代谢中的一种重要酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，乳酸脱氢酶即被释放到细胞外。上述各组材料与人骨髓间充质干细胞共培养24，72 h后，检测细胞上清液中乳酸脱氢酶活性，判断细胞受损程度。
1.4.7 2 h-Ag-ASPSM@SS与ACNs表面残留活菌耐药性评估将灭菌的不锈钢、2 h-Ag-ASPSM@SS、ACNs分别插入含有3 mL金黄色葡萄球菌(ATCC25923)悬液的安瓿瓶中，细菌浓度为1×106 CFU/mL，每组设置3个重复，在37 ℃下静置培养，每三四天换液1次。培养6，12周后，将3组样品在哥伦比亚血平板上滚动培养，评估材料表面黏附的残留活菌量；培养12周后，对3组血平板上生长出来的细菌进行分离纯化培养，采用万古霉素Kirby-Bauer(K-B)药敏纸片法对样品表面黏附的活菌进行万古霉素敏感性评估。
1.5 主要观察指标 Ag-ASPSM@SS的表征分析、体外杀菌性能及抗菌性能、体外细胞相容性及细菌耐药性评估结果。
1.6 统计学分析使用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，符合正态分布的变量使用t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)，否则使用非参数Kruskal-Wallis H检验，P < 0.05为差异有显著性意义。采用GraphPad Prism 9.5软件对条形图及柱状图作图。该文统计学方法已经上海中冶医院生物统计学专家审核。

讨论

植入物相关性感染往往需要反复多次手术和移除植入物，显著延长了住院时间、增加了医疗费用。由于当前临床广泛使用的植入物自身不具备抗菌能力，黏附在植入物表面的细菌存在生物膜的“保护”，全身静脉使用抗生素难以有效杀伤局部定植菌[6]，此外抗生素的长期使用将加重细菌耐药性的产生[17]。使用抗生素骨水泥的两阶段翻修手术目前已经成为治疗植入物相关性感染的标准方案[18-21]，第一阶段手术彻底清创取出植入物，放置抗生素骨水泥间置器填充死腔；待骨水泥内部抗生素释放完成，进行第二阶段手术，取出间置器，重新安放植入物。研究表明，针对当前植入物相关性感染的微生物学特征，氨基糖甙类(庆大霉素)和糖肽类(万古霉素)混合能够提供最大的协同效应[18，22-23]，然而其有效洗脱时效可能只有4-6周[21-22]。此外，抗生素骨水泥的广泛使用与细菌耐药性的增强有关，这可能是由于随着时间的延长从骨水泥中洗脱出来的抗生素水平低于有效杀菌浓度，长期低浓度的抗生素诱导了耐药菌株的产生[24-25]。
相比之下，纳米银颗粒优越的抗菌特性及抑制生物膜形成的能力得到了证实，纳米银颗粒甚至具有抑制多重细菌混合感染的能力[26]。纳米银颗粒可以通过与富含磷的DNA或与电子传输链上含硫代谢酶相互作用来阻碍细菌的能量生成和复制，其还可以通过直接接触或间接产生活性氧自由基来穿透细菌细胞膜，这种多功能的抑菌机制表现出广泛的抗菌能力，使细菌难以产生抗性[27]。研究发现当细菌接触到纳米银颗粒后，不仅它们本身被杀死，而且还会变成“细菌僵尸”，继续屠杀它们的同类，也就是说这些已经死亡的“细菌僵尸”体内存储了大量纳米银颗粒，这些储存在死菌中的纳米银颗粒可以在细菌死亡裂解后渗出到周边环境中，继续杀死周围的活细菌并制造更多“细菌僵尸”，从而赢得植入物“表面竞争”的胜利[28]。传统纳米银涂层生物材料具有银涂层分布稀疏、含量极低、颗粒极易脱落的缺点，因此长效抑菌能力有限。
此次实验利用ASPSM技术，使得纳米银颗粒在高压离子场的加速下“轰击”埋入不锈钢内部，提高材料表面纳米银颗粒的结合力；之后对材料进行低温渗碳处理，以期进一步提高材料表面的耐磨、耐腐蚀性[15，29]。扫描电镜表征结果显示，在保证颗粒1-100 nm纳米级的前提下不锈钢表面纳米银颗粒致密，银含量可达30%以上。此外扫描电镜与X射线衍射结果表明，2 h-Ag-ASPSM@SS材料表面的纳米银颗粒具有极高的“球形度”，进一步提高了材料与细菌的接触面积。
实验系统地探讨了“双层多孔双层杯状纯银网筛”活性屏在不同轰击时间下制备的Ag-ASPSM@S的抗菌活性，在2 h-Ag-ASPSM@SS中观察到了最高抗菌活性，可以解释如下：①纳米银颗粒的大小和剂量影响抗菌效果，CAO等[30]报道一定范围内较小的纳米银抗菌活性不如较大的纳米银。此次实验中1 h-Ag-ASPSM@SS、2 h-Ag-ASPSM@SS和4 h-Ag-ASPSM@SS的纳米银直径分别为60，80和200-400 nm。②此外，扫描电镜、X射线衍射能谱、X射线衍射测试结果表明，2 h-Ag-ASPSM@SS具有更大的密度和更厚的纳米银涂层，有助于提高抗菌性能。综合来看，这些结果表明2 h-Ag-ASPSM@SS与细菌有最好的相互作用。
实验将材料与铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌共培养，系统地评估了2 h-Ag-ASPSM@SS和ACNs的抗菌活性(特别是抗生物膜形成)。此外，实验在体外系统比较了ACNs与2 h-Ag-ASPSM@SS的长效抗菌能力，发现2 h-Ag-ASPSM@SS可以显著抑制细菌的黏附和增殖达84 d，然而ACNs在42 d时已经表现出较差的抗细菌黏附和生物膜形成的特性，与预期相反，与细菌共同培养84 d后，ACNs将更有利于细菌的定植。这可能是由于ACNs具有更高的粗糙度和多孔性特征，有助于细菌的附着；同时，细菌的抵抗力也可能在这一现象中起重要作用，由于ACNs组抗生素长期的洗脱率有限，使得黏附在ACNs上的细菌长期处于低浓度刺激下，诱导了细菌耐药性的产生。在实验结束时，3组材料表面黏附的残留活菌对万古霉素敏感性的定量检测结果验证了这一猜想，ACNs表面残留的活菌株对万古霉素的敏感性显著下降，其具体机制还需要进行更深入细致的研究。
理想的植入材料不仅应具有良好的抗菌活性，还应该具有良好的生物相容性。此次实验根据活死染色、细胞活力和乳酸脱氢酶活性测试结果，发现2 h-Ag-ASPSM@SS样品无明显的细胞毒性，而ACNs具有明显的细胞毒性。目前的理论认为，纳米银颗粒的细胞毒性是纳米银颗粒溶解和随后银离子释放的结果，同时也取决于浓度、时间、颗粒大小等[31-32]，因此调节材料表面银的持续释放是纳米银材料临床应用必须解决的一个难题。既往研究已注意到纳米银颗粒大小对细胞毒性和基因毒性效应的重要性，较小的纳米银颗粒比大的纳米银颗粒更容易进入细胞，这可能是造成较高毒性效应的原因[33]。令人惊讶的是，在回顾文献时发现纳米银颗粒的毒性并不总是取决于尺寸，在一定范围内较大的纳米银颗粒(80 nm)细胞毒性效应更小[34-35]。巧合的是，此次实验中2 h-Ag-ASPSM@SS的纳米银颗粒尺寸大约是80 nm。此外， Ag-ASPSM@SS材料细胞相容性的增强与纳米银颗粒在离子场的“轰击”下埋入不锈钢内部有关，也可能与渗碳工艺有关(耐磨的碳化层与不锈钢牢固结合，这进一步提高了纳米银颗粒与材料的黏附性)。相较于游离的纳米银颗粒而言，固定化纳米银颗粒的细胞毒性要小得多[36]。因此，2 h-Ag-ASPSM@SS可提升纳米银颗粒的表面附着力和控制银离子的缓慢释放、降低材料的细胞毒性，但具体机制仍需要进一步探索。
综上所述，实验采用ASPSM技术显著提高了不锈钢表面纳米银含量的沉积效率，并且没有增加材料的细胞毒性；2 h-Ag-ASPSM@SS在体外具有强大的抗细菌黏附和抗生物膜形成的特性，在12周时间里显示出持久稳定的抗菌特性、更低的细菌耐药性挑战，这意味着未来可以探索相关产品的制备，用于单阶段翻修手术治疗植入物相关性感染，以期替代两阶段翻修的方法。进一步的动物体内实验需要开展，以探究其在生物体内治疗植入物相关性感染的能力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

活性屏等离子表面改性技术制备纳米银涂层不锈钢的体外抗菌性能

Antibacterial properties of silver nanoparticle-coated stainless steel prepared via active screen plasma surface modification in vitro

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