载庆大霉素丝素蛋白作为半月板修复材料的安全性和抗菌性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3026

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (10): 1545-1549.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3026

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

载庆大霉素丝素蛋白作为半月板修复材料的安全性和抗菌性能

徐昌奎1，蒲小兵2，陆遥3，陈加荣4，潘磊1

1佛山市三水区人民医院脊柱关节外科，广东省佛山市 528000；2四川大学华西第四医院骨科，四川省成都市 610000；3南方医科大学珠江医院关节骨病外科，广东省广州市 510000；4南部战区总医院骨科，广东省广州市 510000

收稿日期:2020-03-14 修回日期:2020-03-19 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-04-08 发布日期:2020-12-18
通讯作者: 潘磊，博士，佛山市三水区人民医院脊柱关节外科，广东省佛山市 528000
作者简介:徐昌奎，男，1991年生，江西省赣州市人，汉族，2018年南方医科大学毕业，硕士，医师，主要从事关节外科及软骨组织工程方面的研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2014A030310147)，项目名称：磁力构建骨髓间充质干细胞板层状组织工程结构修复关节软骨缺损的实验研究

Safety and antibacterial properties of gentamicin-loaded silk fibroin in meniscus repair

Xu Changkui1, Pu Xiaobing2, Lu Yao3, Chen Jiarong4, Pan Lei1

1Department of Spine and Joint, Sanshui District People’s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics, West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; 3Department of Osteoarthritis, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 4Department of Orthopedics, General Hospital of Southern Theater Command, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Received:2020-03-14 Revised:2020-03-19 Accepted:2020-05-09 Online:2021-04-08 Published:2020-12-18
Contact: Pan Lei, MD, Department of Spine and Joint, Sanshui District People’s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong Province, China
About author:Xu Changkui, Master, Physician, Department of Spine and Joint, Sanshui District People’s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030310147

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
丝素蛋白：是蚕丝的主要成分，占蚕丝质量的70%-80%，是一种无生理活性的天然生物大分子，其来源广、成本低，相较其他天然高分子具有更好的细胞黏附和生长特性，以及更为可控的降解性能和可塑性，对组织无毒副作用，在组织工程、药物缓释等领域发挥出巨大的应用潜力。
半月板修复：半月板是位于股骨内、外侧髁与胫骨平台之间的纤维软骨结构，损伤类型主要有纵裂、径向裂、斜裂、水平裂、复合裂。由于半月板切除后对膝关节生物力学的影响，目前对损伤半月板进行缝合固定已成为治疗半月板损伤的共识。

背景：丝素蛋白材料具有良好的生物相容性、力学性能及可生物降解等优点，但在临床中其作为一种缝线固定材料应用于半月板撕裂缝合修复未见报道。
目的：制备载庆大霉素的丝素蛋白材料，分析其生物相容性与抗菌性能。
方法：采用三元溶液溶解脱胶后的天然蚕茧，经过透析、冻干、再溶解、成型等处理制备丝素蛋白材料，将庆大霉素溶解于丝素蛋白溶液中制备载庆大霉素的丝素蛋白材料。将丝素蛋白材料、载庆大霉素的丝素蛋白材料分别与小鼠前成软骨细胞共培养，1，3，5 d后，采用MTT法检测细胞增殖；共培养24 h后，采用钙黄绿素染色检测材料的细胞毒性作用，流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况，扫描电镜观察细胞在材料表面的黏附情况。将丝素蛋白材料、载庆大霉素的丝素蛋白材料分别与抗凝血混合，采用溶血实验检测材料的溶血率。将丝素蛋白材料、载庆大霉素的丝素蛋白材料分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌共培养，进行细菌计数、扫描电镜观察与抑菌圈实验。
结果与结论：①两种材料对细胞的增殖、早期凋亡无明显影响；②两种材料无明显的细胞毒性；在两种材料表面黏附的细胞生长状态良好，排列紧密，细胞形态舒展；③两种材料具有良好的血液相容性，未引起溶血反应；④载庆大霉素的丝素蛋白材料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有明显的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更明显；⑤结果表明，载庆大霉素丝素蛋白材料具有良好的生物相容性和抗菌性。

https://orcid.org/0000-0002-2144-8547 (徐昌奎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 丝素蛋白, 半月板, 生物相容性, 抗菌性, 半月板修复

Abstract: BACKGROUND: Silk fibroin material has good biocompatibility, excellent mechanical properties, biodegradation and other advantages. However, it has not been used as a kind of suture fixation material in the repair of meniscus tear.
OBJECTIVE: To prepare gentamicin loaded silk fibroin material and analyze its biocompatibility and antibacterial properties.
METHODS: After dissolving the degummed natural silkworm cocoon with ternary solution, the silk fibroin material was prepared by dialysis, freeze-drying, redissolution and molding, and gentamicin was dissolved in silk fibroin solution to prepare gentamicin loaded silk fibroin material. Silk fibroin material and gentamicin loaded silk fibroin material were co-cultured with mouse pre chondroblasts respectively. After 1, 3, and 5 days, cell proliferation was detected by MTT assay. After 24 hours of co-culture, the cytotoxic effect of the material was detected by calcein staining. The early apoptosis of cells was detected by flow cytometry. The adhesion of cells on the surface of the material was observed by scanning electron microscope. Silk fibroin material and gentamicin loaded silk fibroin material were mixed with anticoagulant separately. The hemolysis rate of the material was detected by hemolysis experiment. The silk fibroin material and gentamicin loaded silk fibroin material were co-cultured with S.aureus and E.coli respectively. The bacterial count, scanning electron microscope observation and bacteriostatic circle experiment were carried out.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The two materials had no significant effect on cell proliferation and early apoptosis. (2) There was no obvious cytotoxicity between the two materials, and the cells adhered on the surfaces of the two materials grew well, arranged tightly, and the morphology of the cells expanded. (3) The two materials had good blood compatibility and did not cause hemolytic reaction. (4) Gentamicin loaded silk fibroin material had obvious inhibition on S.aureus and E.coli, and the inhibition on S.aureus was more obvious. (5) The results showed that the gentamicin loaded silk fibroin material has good biocompatibility and antibacterial property.

Key words: bone, material, silk fibroin, meniscus, biocompatibility, antibacterial property, meniscus repair

中图分类号:

徐昌奎, 蒲小兵, 陆遥, 陈加荣, 潘磊. 载庆大霉素丝素蛋白作为半月板修复材料的安全性和抗菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1545-1549.

Xu Changkui, Pu Xiaobing, Lu Yao, Chen Jiarong, Pan Lei. Safety and antibacterial properties of gentamicin-loaded silk fibroin in meniscus repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(10): 1545-1549.

图/表（结果） 7

2.1 两种材料对细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，丝素蛋白组、载庆大霉素丝素蛋白组细胞具有良好的增殖能力，与对照组细胞相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.2 两种材料对细胞死活的影响细胞钙黄绿素染色显示，丝素蛋白组、载庆大霉素丝素蛋白组和对照组结果一致，细胞生长状态良好(绿色荧光)，细胞形态正常，铺展良好，仅有极少死细胞 (红色荧光)，见图2。

2.3 两种材料对细胞早期凋亡的影响细胞早期凋亡检测显示，丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白组和对照组细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P=0.7，0.4)，见图3，结果显示丝素蛋白材料无明显细胞毒性，对细胞早期凋亡没有影响。

2.4 两种材料的血液相容性材料溶血实验所示，阳性对照组造成明显血细胞溶解，丝素蛋白组(溶血率为0.08%)、载庆大霉素丝素蛋白组(溶血率为0.04%)与阴性对照组结果一致，均未引起明显溶血反应，见图4，说明丝素蛋白材料具有良好的血液相容性。

2.5 两种材料对细胞黏附的影响扫描电镜显示细胞均良好地黏附在丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白材料表面，细胞排列紧密，细胞形态舒展，见图5，表明丝素蛋白材料有利于细胞的黏附。

2.6 两种材料的抗菌性能细菌计数实验显示，载庆大霉素丝素蛋白材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用，见图6。抑菌圈实验显示，载庆大霉素丝素蛋白材料对金黄色葡萄球菌的抑制作用大于对大肠杆菌的抑制作用，见图6。扫描电镜结果同样表明了载庆大霉素丝素蛋白材料优异的抗菌效果，见图7。

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引言

半月板损伤是膝关节运动损伤的常见病，平均每年发生率为0.66‰，以青少年为主[1]。半月板对维持膝关节功能具有重要作用，包括承受负荷、震荡吸收、关节稳定、关节润滑、本体感觉及关节软骨的营养作用[2]。半月板损伤会破坏膝关节的稳定性，加速关节软骨的磨损，最终导致膝关节骨性关节炎的发生，严重可致关节畸形[3]。传统的半月板损伤治疗主要是半月板部分或全部切除，而目前的循证医学证据显示该治疗会加剧膝关节的退变[4]。基于半月板在膝关节运动中的重要功能，针对半月板损伤临床中多主张采用尽可能保留半月板结构的治疗方式[5]，目前治疗方式包括关节镜下半月板缝合修复、半月板组织工程修复及半月板移植重建治疗，其中微创半月板缝合修复是首选的治疗手段。运用可吸收材料行半月板修复的可吸收半月板螺钉技术(CLEARfix 技术)、可吸收半月板箭技术(Meniscus-Arrow技术)在临床应用上已取得确切疗效[6-7]。然而，外科手术中及术后感染的发生是临床中较为常见的问题，尤其是骨科内植物术后感染依然是目前研究的热点，对于目前临床中半月板损伤修复的治疗，研究一种同时具备良好生物力学、可降解及抗感染的半月板缝合固定材料具有重要意义。
丝素蛋白作为一种天然蛋白质来源广、成本低，与其他生物医用材料相比(如胶原蛋白、聚乳酸等)更有利于细胞的黏附和生长[8-9]，具有更为可控的降解性能和可塑性[10]，对组织无毒副作用，具有良好的生物相容性、物理机械性能、合适的降解速度，易于再生加工成多种形态，是近年来生物医用材料领域的重点研究对象之一，作为一种潜在生物医学材料在骨组织工程中得到了国内外广泛的关注[11-12]，但其作为一种缝线固定材料应用于半月板撕裂的缝合修复未见报道[13-14]。课题组采用改良的丝素蛋白提取方法，同时在制备过程中负载适量的庆大霉素，制备出具有良好的力学特性、降解性能及抗菌性的丝素蛋白骨科可吸收内固定材料[15]。实验基于该种新型载庆大霉素丝素蛋白骨科可吸收内固定材料，研究其与前成软骨细胞ATDC5细胞的生物相容性及其抗菌效果，探讨其在半月板修复应用中的潜力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年2至8月在广州军区广州总医院骨科实验室(全军热区创伤救治与组织修复重点实验室、广东省骨科矫形技术及植入材料重点实验室)完成。
1.3 材料小鼠前成软骨细胞ATDC5(RIKEN细胞库，日本)；DMEM/F12培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；MTT试剂(Amresco 公司，美国)；细胞凋亡试剂盒(Annexin V，7-AAD；Millipore，Billerica，MA，USA)；钙黄绿素染色剂(Sigma，美国)；酶标仪(Thermo，美国)；细胞流式仪(Guava EasyCyte 5HT，Millipore，美国)；荧光显微镜(OLYMPUS/BX51，日本)；扫描电镜(S-3000N，Hitachi，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 载庆大霉素丝素蛋白材料的制备按照课题组前期研究中方法制备丝素蛋白材料[15]。采用三元溶液溶解体系及六氟异丙醇等溶剂对脱胶后的蚕茧(山东省蚕业研究所)进行溶解后共混载药，其中庆大霉素含量为16 mg/g，再用甲醇溶液处理后干燥成型，切割为0.1 cm×0.5 cm的圆形片状，高温高压灭菌后密封干燥保存。
1.4.2 MTT法检测细胞增殖将细胞浓度为2×107 L-1的小鼠前成软骨细胞ATDC5悬液分3组培养，两实验组分别加入丝素蛋白材料与载庆大霉素丝素蛋白材料，以单纯培养的细胞为对照。培养1，3，5 d后以MTT及DMSO处理，于酶标仪490 nm波长处检测吸光度值。
1.4.3 钙黄绿素染色观察细胞死活情况将细胞浓度为2×107 L-1的小鼠前成软骨细胞ATDC5悬液分3组培养，两实验组分别加入丝素蛋白材料与载庆大霉素丝素蛋白材料，以单纯培养的细胞为对照。培养24 h后用钙黄绿素/PI染色剂处理，荧光显微镜下拍照观察细胞染色情况。
1.4.4 流式细胞仪检测细胞早期凋亡将细胞浓度为2×107 L-1的小鼠前成软骨细胞ATDC5悬液分3组培养，两实验组分别加入丝素蛋白材料与载庆大霉素丝素蛋白材料，以单纯培养的细胞为对照。培养24 h后用细胞凋亡试剂盒染料处理，上流式细胞仪检测，最后用仪器配备软件分析细胞早期凋亡状态。
1.4.5 溶血实验取健康志愿者抗凝血，分装于各管内，每管0.2 mL，分别加入丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白材料、PBS(阴性对照组)、超纯水(阳性对照组)，混匀后在37 ℃水浴锅中放置60 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液，于酶标仪545 nm波长处测吸光度值，实验重复3次，取平均值，计算溶血率。溶血率=(样品吸光度值-阴性对照吸光度值)/(阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值)×100%，溶血率≤5%符合医用植入材料要求。
1.4.6 电镜扫描观察细胞附着将灭菌处理后的丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白材料分别与细胞浓度2×108 L-1的ATDC5细胞共培养24 h，经固定、脱水、烘干、固定处理后，扫描电镜下观察细胞在材料上的黏附情况。
1.4.7 细菌计数和抑菌圈实验将灭菌后的丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白材料分别加入浓度为1×106 CFU/mL菌液[金黄色葡萄球菌(S.aureus，广东省微生物研究所)和大肠杆菌(E.coli，广东省微生物研究所)]，于37 ℃恒温箱内培养24 h，一部分材料稀释后涂板，继续培养24 h后行细菌计数；另一部分材料经过冲洗、固定、脱水、烘干及固定后，置于扫描电镜下观察材料表面细菌形态和增殖情况。
蘸取适量浓度为2×107 CFU/mL菌液，均匀涂在60 mm固体培养基上，然后将丝素蛋白材料、载庆大霉素丝素蛋白材料分别放于培养基平板中，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，对比两组材料周围抑菌圈的大小。
1.5 主要观察指标载庆大霉素丝素蛋白材料的细胞相容性与抗菌性。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件分析数据，数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，丝素蛋白在生物材料和组织工程领域得到了广泛的关注和研究。在骨组织修复中，丝素蛋白因具有良好的生物学特性可为骨缺损区提供有效的结构支撑，促进缺损区域骨的修复与重建[16-19]，然而丝素蛋白在骨内固定方面的研究特别是用于半月板修复材料的研究中却鲜有报道。课题组采用改良的丝素蛋白提取方法制备出具有可靠的力学强度、降解性能及热耐受性的丝素蛋白骨科可吸收内固定材料[15]，为丝素蛋白应用于半月板修复及内固定打下了基础。
半月板是由胶原(Ⅰ型胶原90%-95%)、纤维软骨、蛋白多糖、弹性蛋白和水组成的纤维软骨结构。根据半月板的生理结构，实验将前成软骨细胞ATDC5细胞和新型丝素蛋白材料共培养，体外采用MTT法评估材料对细胞增殖情况的影响，同时进行钙黄绿素染色及流式细胞凋亡实验观察材料的细胞毒性作用，通过电镜观察细胞在新型丝素蛋白材料表面贴附生长情况，实验结果显示该新型丝素蛋白材料对软骨细胞的增殖无明显影响，且不会破坏红细胞引起溶血。MIN等[20-21]研究发现，再生丝素蛋白纳米纤维可以有效促进角质化细胞及上皮细胞的增殖，对皮肤创伤修复有一定效果。TAMADA[22]研究显示硫酸化丝素蛋白可应用于人工血管的开发上。ZHANG等[23]构建的丝蛋白基导管支架具有稳定的尺寸性、良好的力学性能和生物相容性，适合神经类种子细胞的黏附生长[24]，可用于神经组织工程。此次实验结果与以往研究结果一致，该新型丝素蛋白材料在软骨细胞环境中具有良好的细胞相容性和血液相容性，具有作为半月板修复内固定材料的潜力。
此外，内植物相关感染一直是骨科手术严重并发症之一，骨科内固定术后一旦发生感染，轻则延长疗程、增加医疗费用，重则导致严重的肢体功能障碍甚至截肢[25-26]。感染亦是关节镜手术常见的并发症，严重关节腔感染是灾难性的，往往导致手术失败[27]。目前感染治疗过程始终坚持彻底清创、消灭死腔、稳定骨折、改善血运、通畅引流及积极抗感染的原则，因此研究具有抗菌功能的修复材料具有重要意义。丝素蛋白应用于载药系统成为近几年研究热点之一[28-30]，通过以丝素纤维作为介质对纤维内部结构的调控实现药物的缓释或控释，从而降低毒副作用[31]。课题组在前期研究中通过共混形式载入庆大霉素，通过测试抗生素抗菌效果和抗菌持久性，确定了庆大霉素和丝素蛋白的最佳抗菌浓度比值为16 mg/g[32]。然而以往的研究中，材料抗菌实验多使用标准菌株，如金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923[33-34]。此次实验使用临床致病大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行研究更具有临床意义，结果显示载庆大霉素丝素蛋白具有良好的抗菌效果，其抗菌率达100%，扫描电镜观察及抑菌圈实验进一步证实了载庆大霉素丝素蛋白出色的抑菌作用。该新型丝素蛋白材料在制备过程中通过载入适量的抗生素，药物经过丝素蛋白分解或纤维孔道的扩散实现缓释，以达到降低丝素蛋白内固定物植入感染的发生，说明该材料可降低关节腔感染发生的概率。
综上所述，通过改良制备工艺制备的载庆大霉素丝素蛋白材料具有良好的生物相容性，与此同时具有良好的抗菌效果，该新型丝素蛋白材料在半月板损伤修复中的应用具有光明的前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载庆大霉素丝素蛋白作为半月板修复材料的安全性和抗菌性能

Safety and antibacterial properties of gentamicin-loaded silk fibroin in meniscus repair

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