聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜载铜涂层的制备及抗菌和细胞性能评价

doi:10.12307/2022.855

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (27): 4272-4278.doi: 10.12307/2022.855

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聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜载铜涂层的制备及抗菌和细胞性能评价

董西玲，惠敏，曹飞，林鹏，周晗，王乐，张晓明，刘童斌

滨州医学院附属医院口腔修复科，山东省滨州市 256600

收稿日期:2021-02-10 接受日期:2021-04-15 出版日期:2022-09-28 发布日期:2022-03-11
通讯作者: 张晓明，硕士，主任医师，硕士生导师，滨州医学院附属医院口腔修复科，山东省滨州市 256603 刘童斌，硕士，滨州医学院附属医院口腔修复科，山东省滨州市 256603
作者简介:董西玲，女，1992 年生，山东省临沂市人，汉族，滨州医学院在读硕士，主要从事口腔修复学研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(2016WS0121)，项目参与人：林鹏、刘童斌；滨州医学院科技计划项目(BY2017KJ05)，项目负责人：刘童斌

Preparation of copper loaded coating on polydopamine-modified polycaprolactone electrospun membrane and antibacterial and cellular properties evaluation

Dong Xiling, Hui Min, Cao Fei, Lin Peng, Zhou Han, Wang Le, Zhang Xiaoming, Liu Tongbin

Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, Shandong Province, China

Received:2021-02-10 Accepted:2021-04-15 Online:2022-09-28 Published:2022-03-11
Contact: Zhang Xiaoming, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, Shandong Province, China Liu Tongbin, Master, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, Shandong Province, China
About author:Dong Xiling, Master candidate, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Medical and Health Science and Technology Development Plan Project, No. 2016WS0121 (to LP, LTB); Binzhou Medical College Science and Technology Plan Project, No. BY2017KJ05 (to LTB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
聚多巴胺：多巴是贻贝类生物分泌的黏附蛋白的重要成分。多巴的衍生物——多巴胺，具有与其相似的结构和性质，在弱碱性环境中发生氧化自聚和形成聚多巴胺，表面功能化的聚多巴胺涂层具有优异的黏附能力和生物相容性，被广泛应用于生物医学领域的表面改性。
引导骨组织再生技术：是指利用膜的物理屏障作用将繁殖快的结缔组织、上皮组织与生长缓慢的骨组织分隔开，创造一个有利于细胞迁移分化、增殖的空间，从而达到骨组织再生的效果。

背景：在口腔领域，引导骨组织再生膜被广泛用于口腔种植、牙周、颌面外科领域，用于快速有效的实现组织再生，但如何防止植入物周围感染一直是亟待解决的难题。
目的：制备聚己内酯静电纺丝纤维，并通过聚多巴胺对其进行表面改性并黏附铜离子，以制备具有抗菌成骨双重功效的引导骨组织再生膜。
方法：分别制备聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜(铜离子浓度分别为0.01，0.1，1 mol/L)聚己内酯电纺膜。将MC3T3-E1细胞分别接种于上述电纺膜上，通过CCK-8实验检测细胞增殖；将变形链球菌分别与上述电纺膜共培养，检测各组抑菌率。通过CCK-8与抑菌率实验结果确定合适的载铜浓度，用于后续实验。检测聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜的体外缓释性能。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜上，通过活/死细胞染色分析细胞活性，碱性磷酸酶染色评价细胞早期成骨分化；将变形链球菌与上述3种电纺膜共培养，活/死细菌染色评价电纺膜抗菌活性。
结果与结论：①CCK-8实验结果显示，载铜(0.01，0.1 mol/L)电纺膜可促进MC3T3-E1细胞的增殖，载铜1 mol/L电纺膜抑制MC3T3-E1细胞的增殖；载铜电纺膜的抑菌率高于聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜，并且载铜0.1 mol/L电纺膜的抑菌率高于载铜0.01 mol/L电纺膜；结合上述实验结果选择载铜0.1 mol/L电纺膜进行后续研究；②载铜电纺膜体外第28天释放的铜离子浓度约为5.26 mg/L(82.8 μmol/L)，处于无细胞毒性且有效抗菌浓度范围内(10-4-10-5 mol/L)；③活/死染色显示，载铜电纺膜具有良好的细胞相容性与抗菌性；④碱性磷酸酶染色显示，聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜电纺膜的促成骨能力高于聚己内酯电纺膜；⑤结果表明，聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜具有良好的促成骨能力与抗菌性能。

https://orcid.org/0000-0002-2333-4260 (董西玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

关键词: 静电纺丝, 聚己内酯, 电纺膜, 聚多巴胺, 铜离子, 抗菌性, 安全性

Abstract: BACKGROUND: In the field of oral cavity, the guided bone tissue regeneration membrane is widely used in oral implant, periodontal and maxillofacial surgery to achieve rapid and effective tissue regeneration. However, how to prevent the infection around the implant has always been a problem to be solved.
OBJECTIVE: To prepare polycaprolactone electrospun fiber, and to modify its surface with polydopamine and adhere to copper ions, so as to prepare a guided bone tissue regeneration membrane with dual functions of antibacterium and osteogenesis.
METHODS: Polycaprolactone electrospun membrane, polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane and copper (0.01, 0.1, 1 mol/L) loaded polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane were prepared, separately. MC3T3-E1 cells were seeded on the electrospun membrane and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Streptococcus mutans was co-cultured with the electrospun membrane to detect the antibacterial rate. According to the results of CCK-8 assay and inhibition rate experiment, the suitable copper loading concentration was determined for subsequent experiments. The in vitro sustained release properties of copper loaded polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane were detected. MC3T3-E1 cells were seeded on the three kinds of electrospun membranes, separately. The cell viability was analyzed by live/dead cell staining and the early osteogenic differentiation was evaluated by alkaline phosphatase staining. Streptococcus mutans was co-cultured with three kinds of electrospun membranes and the antibacterial activity of electrospun membranes was evaluated by live/dead bacterial staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 results showed that copper (0.01, 0.1 mol/L) loaded polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane could promote the proliferation of MC3T3-E1 cells. Copper (1 mol/L) loaded electrospun membrane inhibited the proliferation of MC3T3-E1 cells. The antibacterial rate of copper loaded electrospun membrane was higher than that of polycaprolactone electrospun membrane and polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane. The antibacterial rate of copper (0.1 mol/L) loaded electrospun membrane was higher than that of copper (0.01 mol/L) loaded electrospun membrane. Based on the above experimental results, 0.1 mol/L copper loaded electrospun membrane was selected for further study. (2) The concentration of copper ion released from the electrospun membrane on the 28th day in vitro was about 5.26 mg/L (82.8 μmol/L), which was in the range of non-cytotoxic and effective antibacterial concentration (10 -4-10-5 mol/L). (3) The results of live/dead staining showed that the copper loaded electrospun membrane had good biocompatibility and antibacterial activity. (4) Alkaline phosphatase staining showed that the osteogenic ability of polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane and copper loaded electrospun membrane was higher than that of Polycaprolactone electrospun membrane. (5) The results showed that copper loaded polydopamine modified polycaprolactone electrospun membrane had good bone promoting and antibacterial properties.

Key words: electrospinning, polycaprolactone, electrospun membrane, polydopamine, copper ion, antibacterial property, safety

中图分类号:

董西玲, 惠敏, 曹飞, 林鹏, 周晗, 王乐, 张晓明, 刘童斌. 聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜载铜涂层的制备及抗菌和细胞性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4272-4278.

Dong Xiling, Hui Min, Cao Fei, Lin Peng, Zhou Han, Wang Le, Zhang Xiaoming, Liu Tongbin. Preparation of copper loaded coating on polydopamine-modified polycaprolactone electrospun membrane and antibacterial and cellular properties evaluation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(27): 4272-4278.

图/表（结果） 11

2.1 各组电纺膜的表面表征结果图1为制备好的3组电纺膜，经多巴胺、铜处理过的样品呈棕黑色。扫描电子显微镜分析表明，静电纺丝支架为直径较均匀、表面连续的纳米级细丝，无规则互相交织形成丝状的3D结构，其间有很多孔隙，如图2所示。

聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜的平均纳米纤维直径分别为(497±156) ，(559±106)，(628±166) nm。聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜纤维变粗，表面变粗糙，可见颗粒状沉积；同时很大程度上保持了原始的3D支架框架；聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜有更多的颗粒聚集，可能由于铜离子的共沉积。
能量色散X射线光谱结果，如图3所示，聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜表面的元素主要为C和O；聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜表面的元素中出现Cu，铜元素的占比为1.24%，提示铜元素可成功掺入静电纺丝膜表面。聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺丝膜经聚多巴胺修饰后C原子占比逐渐降低，可能因为聚己内酯电纺丝膜表面被聚多巴胺和铜离子覆盖。

2.2 聚多巴胺载铜修饰聚己内酯电纺膜的铜离子释放图4显示了在28 d的时间里聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜中铜离子的累积释放量，前12 d释放速度较快，第12-28天释放速度缓慢，总体呈现较为温和的释放曲线，缓释效果较好。第1天铜离子的质量浓度约为0.86 mg/L(13.5 μmol/L)，第8天约为3.28 mg/L(51.7 μmol/L)，第12天约为4.23 mg/L(66.6 μmol/L)，第28天约为5.26 mg/L(82.8 μmol/L)，处于无细胞毒性且有效抗菌的浓度范围内(10-4-10-5 mol/L)。

2.3 各组电纺膜的细胞生物学性能评价
2.3.1 细胞增殖 CCK-8分析结果，如图5所示。与空白对照组和聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰载铜(0.01 mol/L)聚己内酯电纺膜上培养第5，7天的细胞增殖速率更高(P < 0.05)，这可能是由于聚多巴胺涂层改性后静电纺丝膜的亲水性和生物相容性提高，增强细胞黏附增殖和Cu2+缓释浓度低所致；与聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰载铜(0.01 mol/L)聚己内酯电纺膜上培养第5，7天的细胞增殖能力提高(P < 0.05)，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上第1，3，7天的细胞增殖速率无明显变化(P > 0.05)；与对照组、聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰载铜(1 mol/L)聚己内酯电纺膜上培养第3，5，7天的细胞增殖速率降低(P < 0.05)，证明此铜离子浓度过高产生毒性作用，抑制了细胞增殖活力。

综上，铜离子浓度0.01，0.1 mol/L可用于后续研究，结合下文抑菌率检测的结果确定 0.1 mol/L为最适铜离子浓度，并通过其他检测进一步验证其可行性。各组细胞增殖比较的P值结果，见表1。

2.3.2 活/死细胞染色如图6所示。

与聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上无明显的死细胞增多，细胞形态正常，此结果与CCK-8检测相符，表明聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜未表现出明显的细胞毒性。
2.3.3 碱性磷酸酶染色通过碱性磷酸酶染色结果可以直观地观察和评价细胞早期成骨分化的效果，碱性磷酸酶染色后，蓝染(深蓝色或蓝紫色)的范围和深浅显示碱性磷酸酶活性高低。如图7所示，与聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上的蓝染范围和颜色深度均明显增高。

2.4 各组电纺膜的抗菌性评价结果图8为各组电纺膜与变形链球菌细菌共培养24 h后的细菌涂板照片，可见聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜上的细菌菌落数明显减少；根据抑菌率公式，计算可得聚多巴胺修饰载铜0.01，0.1 mol/L聚己内酯电纺膜对变形链球菌的抑菌率分别为49.42%和92.62%。

使用MycoLight?荧光法活/死细菌荧光成像试剂盒对活死细菌进行染色，活细菌为绿色，死细菌为红色。在图9中，接种变形链球菌24 h后，聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜上的活细菌较多，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上的大部分细菌死亡。

2.5 电纺膜的细胞生物相容性由CCK-8实验与活/死细胞染色结果可知，聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜具有良好的细胞生物相容性。

参考文献

[1] BOTTINO MC, THOMAS V, SCHMIDT G, et al. Recent advances in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration—A materials perspective. Dent Mater. 2012;28(7):703-721.
[2] 宋菊青.静电纺丝聚己内酯三维复合纳米纤维及其细胞生物学性能研究[D].广州:华南理工大学,2016.
[3] XUE J, WU T, DAI Y, et al. Electrospinning and Electrospun Nanofibers: Methods, Materials, and Applications. Chem Rev. 2019;119(8):5298-5415.
[4] DAELEMANS L, STEYAERT I, SCHOOLAERT E, et al. Nanostructured Hydrogels by Blend Electrospinning of Polycaprolactone/Gelatin Nanofibers. Nanomaterials. 2018;8(7):551.
[5] 李珍妮,邓字巍.仿贻贝黏附性多巴胺的研究与应用进展[J].高分子材料科学与工程,2015,31(1):185-190.
[6] CHEN X, WANG X, WANG S, et al. Mussel-inspired polydopamine-assisted bromelain immobilization onto electrospun fibrous membrane for potential application as wound dressing. Mat Sci Eng C-mater. 2020;110:110624.
[7] JIN A, WANG Y, LIN K, et al. Nanoparticles modified by polydopamine: Working as “drug” carriers. Bioact Mater. 2020;5(3):522-541.
[8] AGNIHOTRI R, GAUR S, ALBIN S. Nanometals in Dentistry: Applications and Toxicological Implications-a Systematic Review. Biol Trace Elem Res. 2020;197(1):70-88.
[9] FAN Y, PHAM MT, HUANG C. Development of Antimicrobial and Antifouling Universal Coating via Rapid Deposition of Polydopamine and Zwitterionization. Langmuir. 2018;35(5):1642-1651.
[10] CHANG T, ZHOU X, LIANG J. Synthesis and characterization of Ag-Cu alloy nanoparticles for antimicrobial applications: A polydopamine chemistry application. Mat Sci Eng C-mater. 2019;98:675-684.
[11] QIAN Y, ZHOU X, ZHANG F, et al. Triple PLGA/PCL scaffold modification including silver-impregnation, collagen-coating, and electrospinning significantly improve biocompatibility, antimicrobial, and osteogenic properties for oro-facial tissue regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(41):37381-37396.
[12] KAWEETEERAWAT C, CHANG CH, ROY KR, et al. Cu Nanoparticles Have Different Impacts in Escherichia coli and Lactobacillus brevis than Their Microsized and Ionic Analogues. ACS Nano. 2015;9(7):7215-7225.
[13] NING C, WANG X, LI L, et al. Concentration Ranges of Antibacterial Cations for Showing the Highest Antibacterial Efficacy but the Least Cytotoxicity against Mammalian Cells: Implications for a New Antibacterial Mechanism. Chem Res Toxicol. 2015;28(9):1815-1822.
[14] LI K, XIA C, QIAO Y, et al. Dose-response relationships between copper and its biocompatibility/antibacterial activities. J Trace Elem Med Biol. 2019;55:127-135.
[15] 王乐,惠敏,董西玲,等.缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架对细胞黏附增殖的影响[J].中国组织工程研究,2020,24(28):4492-4497.
[16] CHENG G, YIN C, TU H, et al. Controlled Co-delivery of Growth Factors through Layer-by-Layer Assembly of Core–Shell Nanofibers for Improving Bone Regeneration. ACS Nano. 2019;13(6):6372-6382.
[17] CHEN X, WANG X, WANG S, et al. Mussel-inspired polydopamine-assisted bromelain immobilization onto electrospun fibrous membrane for potential application as wound dressing. Mat Sci Eng C-mater. 2020;110:110624.
[18] 陈媛,刘延辉,张佩华.胆管支架静电纺覆膜工艺及性能[J].东华大学学报(自然科学版),2016,42(6):800-808.
[19] FENG B, TU H, YUAN H, et al. Acetic-Acid-Mediated Miscibility toward Electrospinning Homogeneous Composite Nanofibers of GT/PCL. Biomacromolecules. 2012;13(12):3917-3925.
[20] GRITSCH L, LOVELL C, GOLDMANN WH, et al. Fabrication and characterization of copper(II)-chitosan complexes as antibiotic-free antibacterial biomaterial. Carbohydr Polym. 2018;179:370-378.
[21] KASRAEI S, SAMI L, HENDI S, et al. Antibacterial properties of composite resins incorporating silver and zinc oxide nanoparticles on Streptococcus mutans and Lactobacillus. Restor Dent Endod. 2014; 39(2):109-114.
[22] RAMAZANZADEH B, JAHANBIN A, YAGHOUBI M, et al. Comparison of Antibacterial Effects of ZnO and CuO Nanoparticles Coated Brackets against Streptococcus Mutans. J Dent (Shiraz). 2015;16(3):200-205.
[23] ZHAO L, WANG H, HUO K, et al. Antibacterial nano-structured titania coating incorporated with silver nanoparticles. Biomaterials. 2011; 32(24):5706-5716.
[24] HEO DN, KO WK, LEE HR, et al. Titanium dental implants surface-immobilized with gold nanoparticles as osteoinductive agents for rapid osseointegration. J Colloid Interface Sci. 2016;469:129-137.
[25] KANIKIREDDY V, VARAPRASAD K, JAYARAMUDU T, et al. Carboxymethyl cellulose-based materials for infection control and wound healing: A review. Int J Biol Macromol. 2020;164:963-975.
[26] LIN CC, FU SJ. Osteogenesis of human adipose-derived stem cells on poly(dopamine)-coated electrospun poly(lactic acid) fiber mats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;58:254-263.
[27] HARDES J, AHRENS H, GEBERT C, et al. Lack of toxicological side-effects in silver-coated megaprostheses in humans. Biomaterials. 2007;28(18): 2869-2875.
[28] GIOVANNI M, YUE J, ZHANG L, et al. Pro-inflammatory responses of RAW264.7 macrophages when treated with ultralow concentrations of silver, titanium dioxide, and zinc oxide nanoparticles. J Hazard Mater. 2015;297:146-152.
[29] JIN A, WANG Y, LIN K, et al. Nanoparticles modified by polydopamine: Working as “drug” carriers. Bioact Mater. 2020;5(3):522-541.
[30] BURGHARDT I, LUTHEN F, PRINZ C, et al. A dual function of copper in designing regenerative implants. Biomaterials. 2015;44:36-44.
[31] GAO X, SONG J, JI P, et al. Polydopamine-Templated Hydroxyapatite Reinforced Polycaprolactone Composite Nanofibers with Enhanced Cytocompatibility and Osteogenesis for Bone Tissue Engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(5):3499-3515.
[32] 李伯超.生物医用聚多巴胺功能涂层及纳米微粒的研究[D].杭州:浙江大学,2018.
[33] KUSUMBE AP, RAMASAMY SK, ADAMS RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014; 507(7492):323-328.
[34] JIMÉNEZ-HOLGUÍN J, SÁNCHEZ-SALCEDO S, VALLET-REGÍ M, et al. Development and evaluation of copper-containing mesoporous bioactive glasses for bone defects therapy. Microporous Mesoporous Mater. 2020;308:110454.
[35] LIN R, DENG C, LI X, et al. Copper-incorporated bioactive glass-ceramics inducing anti-inflammatory phenotype and regeneration of cartilage/bone interface. Theranostics. 2019;9(21):6300-6313.
[36] MILAN PB, KHAMSEH S, ZARRINTAJ P, et al. Copper-enriched diamond-like carbon coatings promote regeneration at the bone-implant interface. Heliyon. 2020;6(4):e3798.
[37] LIN Z, CAO Y, ZOU J, et al. Improved osteogenesis and angiogenesis of a novel copper ions doped calcium phosphate cement. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;114:111032.

引言

在口腔领域，引导骨组织再生膜被广泛用于口腔种植、牙周、颌面外科领域，用于快速有效地实现组织再生[1]。引导骨组织再生技术是指利用膜的物理屏障作用将繁殖快的结缔组织、上皮组织与生长缓慢的骨组织分隔开，创造一个有利于细胞迁移分化、增殖的空间，从而达到骨组织再生的效果[1-2]。通过静电纺丝工艺制备的组织再生膜，具有模拟细胞外基质形貌、比表面积大、透气性好及可表面功能化等优点[3]。其中基于聚己内酯的电纺膜，因其优异的机械负荷能力和可降解性成为制备引导骨组织再生膜的首要选择，但聚己内酯电纺膜存在亲水性差和表面缺乏功能基团的缺点，导致其细胞亲和性、应答性较差[4]。
多巴(3，4-二羟基苯丙氨酸)是贻贝类生物分泌的黏附蛋白的重要成分，多巴中的邻苯二酚基团具有很强的螯合能力和还原能力，在碱性有氧条件下被氧化成醌后能与很多基团反应形成共价键，与基底材料(金属、聚四氟乙烯等)相互作用具有超强的黏附力[5]。多巴的衍生物——多巴胺具有与其相似的结构和性质，在弱碱性环境中发生氧化自聚和形成聚多巴胺而具有优异的黏附能力和亲水性，这种生物启发性涂层技术被广泛应用于生物医学领域的表面改性[6-7]。
口腔内存在种类繁多的微生物，如何防止植入物周围感染一直是亟待解决的难题。金属离子(银、铜、锌等)具有高效的杀菌性能和广谱抗菌性，在抗菌和防污等领域得到广泛应用[8-9]。聚多巴胺能够螯合金属离子，使金属离子在电纺丝材料表面沉积，通过此方法结合抗菌金属离子的操作简单、成本低[10]。QIAN等[11]通过使用贻贝启发的聚多巴胺涂层技术改性电纺丝支架，螯合并将银离子还原为纳米银，制备出具有成骨性和抗菌性的静电纺丝膜。但银成本高、毒性大，同样具有优异抗菌性能的铜离子，因其更低的毒性和更高的经济性引起人们的重视[9, 12]。NING等[13]关于抗菌金属离子研究指出，铜离子具有一定的抗菌活性，而没有细胞毒性的最佳浓度范围为10-4-10-5 mol/L。LI等[14]关于铜的生物相容性与抗菌活性间的剂量反应关系研究指出，铜有效抑制细菌生长的阈值浓度为37 μmol/L。
实验通过聚多巴胺改善聚己内酯电纺膜的表面性能，利用聚多巴胺结构中的活性基团对于金属离子的强黏附性黏附螯合铜离子，设置铜离子浓度梯度(0.01，0.1，1 mol/L)，探究具有优异抗菌性能和细胞生物学性能的聚己内酯电纺膜。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年7月至2021年1月在滨州医学院临床医学实验室完成。
1.3 材料小鼠颅骨前成骨细胞系MC3T3-E1(由山东大学口腔医学院科研实验室赠送)；聚己内酯 (Sigma，美国)；二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(天津市致远化学试剂有限公司)；多巴胺盐酸盐(Sigma，美国)；CCK-8试剂盒(MCE，上海基屹生物科技有限公司)；Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒(索莱宝，北京)；天平及pH仪(瑞士METTLER TOLEDO公司)；搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)；微量注射泵(深圳市通力维纳科技有限公司)；高压电源(大连鼎通科技发展有限公司)；超净工作台(美国Thermo Electron公司)，荧光显微镜(美国Beckman-Coulter公司)；变形链球菌UA159(吉林大学赠送)。
1.4 实验方法
1.4.1 聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜表面载铜涂层的制备
聚己内酯电纺膜的制备：经过查阅文献及前期的实验研究[15]，配置不同浓度和比例的溶液，最终确定将1 g聚己内酯溶于4 mL二氯甲烷和3 mL N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，搅拌至少8 h形成均匀混悬液，将混悬液移入注射器，选用6号针头，速度3 mL/h，电压25 kV，接收距离20 cm，接收器为轮轴接收器，收集所得静电纺丝膜的平均厚度约为0.15 mm(厚度用千分尺测量)，将所得电纺膜真空干燥。
聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜的制备：①盐酸多巴胺溶液的配制：秤取121 mg Tris溶于80 mL去离子水中，搅拌器辅助溶解后向其中滴加盐酸，调pH值至8.5(用pH仪精确测量)，定容至100 mL。将200 mg多巴胺盐酸盐加入该溶液中，搅拌均匀，配制出2 g/L的盐酸多巴胺Tris-Hcl缓冲液，该溶液现用现配。②将聚己内酯电纺膜浸泡在配制好的多巴胺溶液中，摇床培养4 h，之后用去离子水冲洗样品，去除未附着的聚多巴胺，真空干燥24 h。由于多巴胺自聚集作用可明显观察到样品的颜色变化，白色-浅棕色-棕黑色。
聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜的制备：将0.013 5，0.135，1.35 g 的CuCl2 粉末分别和10 mL去离子水混合得到浓度为 0.01，0.1，1 mol/L的CuCl2溶液。将聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜浸没于多巴胺和CuCl2混合溶液4 h，之后用去离子水冲洗，去除未结合的铜离子，真空干燥备用。
通过CCK-8检测及抑菌率检测确定最适铜离子浓度并用于后续实验，其中CCK-8检测设置空白对照、聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜聚己内酯(0.01，0.1，1 mol/L)共6组；其余检测设置聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜聚己内酯(即最适铜离子浓度组)共3组。所有操作过程都保证无菌，进行细胞接种前将电纺膜紫外线消毒杀菌。
1.4.2 样品表面表征将制备好的各组电纺膜裁剪成合适大小，使用扫描电子显微镜对电纺丝膜的表面形貌(表面结构、孔隙大小、纤维直径、纤维表面粗糙程度等)进行观察，扫描之前对支架表面进行喷金处理；使用Image J软件包测量评估平均纤维直径和分布。使用能量色散X射线光谱仪测定各组电纺膜表面的化学元素组成。
1.4.3 铜离子释放将2 cm×2 cm大小(约10 mg)的聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜浸泡于5 mL PBS中，将浸泡电纺膜的离心管放入37 ℃恒温培养箱中培养，浸泡1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，25，28 d，于预设时间收集 PBS并重新加入5 mL PBS。通过电感耦合等离子体质谱仪测定收集的PBS中铜离子的浓度，绘制铜离子释放曲线，每组3个样品。
1.4.4 样品的细胞生物学性能评价将聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜裁剪成与24孔板直径相匹配的15 mm的圆形，细胞接种前，将各组电纺膜置于紫外线灯下，正反面各照射2 h，用已高温高压消毒的直径15 mm的不锈钢圆环将静电纺丝支架固定在24孔板底部，用含1%双抗的完全培养基浸泡1 h，目的是消毒和浸泡湿润，彻底吸净培养液待用。MC3T3-E1细胞复苏后，于完全培养基中培养至对数生长期，然后接种于电纺膜上。
细胞增殖：将MC3T3-E1细胞以1×104/cm2的密度接种在已经消毒好的聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜(0.01，0.1，1 mol/L)聚己内酯电纺膜上，以细胞爬片作为空白对照组。待细胞培育到预定时间后(即1，3，5，7 d)吸去原培养基，PBS冲洗后每孔加入300 µL含10%CCK-8溶液的完全培养基，置于恒温培养箱培养2 h，吸出100 µL置于96孔板，通过酶标仪测量450 nm时的吸光度值，重复实验3次。
活/死细胞染色：将MC3T3-E1细胞以1×104/cm2的密度接种在聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上，12 h后取出24孔板，用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒进行活/死细胞染色，染色完毕封固后置于荧光显微镜下，观察支架上黏附细胞的活死情况。重复实验3次，每个样本均在上、下、左、右及中间5个位置综合观察情况，以保证得到较为可靠的数据。
碱性磷酸酶测定：将2×104个MC3T3-E1细胞接种于聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜上，1 d后细胞密度大约达到60%时换成骨分化诱导培养基，继续培养7 d后取出24孔板，用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒染色，置于倒置显微镜下观察染色情况，以评估细胞的早期成骨分化。重复实验3次，每个样本均在上、下、左、右、中5个位置综合观察情况，以保证得到较为可靠的数据。
1.4.5 样品的抗菌性评价
抑菌率：将直径15 mm的聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜(0.01，0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜在37 ℃下与1.5 mL的变形链球菌(106 CFU/mL)共培养。24 h后将样品逐个从细菌试管中取出，放置在1 mL的0.85%生理盐水中，漩涡振荡器振荡3 min后逐级稀释，吸取100 µL细菌悬液于LB固体培养基，细菌涂布器划板(每个稀释倍数设置3个平行对照组)，将培养基放入培养箱中37 ℃培养24 h后，对每组样品的活菌数目进行计数，重复实验3次。按照以下公式计算其抑菌率。抑菌率(%)=(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数×100%。
活/死细菌染色：于24孔板中，将聚己内酯、聚多巴胺修饰聚己内酯、聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜在37 ℃下与1 mL的变形链球菌(106 CFU/mL)共培养。24 h后将样品逐个从培养皿中取出，用PBS轻轻漂洗，使用MycoLight™荧光法活/死细菌荧光成像试剂盒，按照试剂盒说明书染色，置于荧光显微镜下观察。通过MycoLight™荧光法活/死细菌荧光成像试剂盒染色来区分活/死细菌，以评估不同材料表面的抗菌活性。
1.5 主要观察指标聚多巴胺修饰聚己内酯静电纺丝表面载铜涂层的安全性与抗菌性。
1.6 统计学分析计量资料表示为x±s。所有数据资料以Graph Pad Prism统计软件包进行处理，数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05时差异有显著性意义。

讨论

组织工程的三大要素是支架材料、生长因子和种子细胞。骨组织工程的支架/膜仿生细胞外基质的结构和功能，起到结构支撑的作用，并为种子细胞及骨组织的再生提供模板[16]。静电纺丝微纳米纤维支架具有独特的孔径结构和良好的空隙贯穿性，有利于营养物质、氧气的充分流动及伤口液体的渗出；具有可降解特性，从而避免了手术二次取出的弊端；具有类似于天然细胞外基质的随机取向的纤维结构，其中的3D纤维空间可容纳细胞；这些优点对于成功的硬组织再生至关重要[17-18]。扫描电子显微镜结果表明，实验成功制备了聚己内酯电纺膜、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜与聚多巴胺修饰载铜聚己内酯电纺膜，平均纳米纤维直径分别为(497± 156)，(559±106)，(628±166) nm。聚多巴胺、铜离子修饰后聚己内酯纤维变粗，表面变粗糙，但每组的电纺丝直径差异较大。FENG等[19]的研究向聚己内酯静电纺丝混合溶液中引入少量乙酸，获得的纳米纤维更光滑、电纺丝粗细更均匀。在以后的研究中可以进一步研究改善静电纺丝的均一性，并探讨电纺丝直径均匀与否对细胞生物学性能的影响。
目前，细菌耐药性问题深受人民的重视，口腔是一个复杂的有菌环境，急需开发一种可以有效抑制、杀死细菌并有效避免细菌耐药性的非抗生素抗菌新策略[20]。抗菌金属离子(Ag+、Zn2+和Cu2+)及其化合物、纳米颗粒，由于具有良好的抗菌活性在口腔领域已经有众多相关研究，抗菌金属可以应用在牙齿充填材料中以增强其抗菌和机械性能[21]；可以涂覆于正畸托槽表面，抑制菌斑生物膜形成、产生防龋效果[22]；可以添加到聚甲基丙烯酸甲酯中或涂在牙科植入物的表面上，改善其抗菌和机械性能，并促进了牙种植体周围的骨整合和软组织愈合[23-24]。对于引导骨再生手术中的伤口愈合而言，伤口敷料材料起着至关重要的作用，通过对纳米纤维伤口敷料进行表面功能化或掺入抗菌剂(抗生素、纳米颗粒和天然产品)，可以赋予材料杀菌活性[25]。此次实验通过引入聚多巴胺涂层改善聚己内酯静电纺丝膜的亲水性、生物相容性，并黏附螯合铜离子赋予材料抗菌性，能量色散X射线光谱结果显示该电纺膜表面元素中出现Cu，铜元素被成功掺入静电纺丝膜表面。CCK-8检测结果显示，聚多巴胺改性后的材料无明显细胞毒性，并且可以促进细胞增殖活力，这与聚多巴胺增强静电纺丝膜的表面粗糙度和可湿性有关[26]；与聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜相比，聚多巴胺修饰载铜
(0.01 mol/L)聚己内酯电纺膜组第5，7天的细胞增殖能力提高(P < 0.05)，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜组第1，3，7天时的细胞增殖速率无明显变化(P > 0.05)；与空白对照组、聚己内酯电纺膜组、聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜组相比，聚多巴胺修饰载铜(1 mol/L)聚己内酯电纺膜组的A值一直偏低，第3，5，7天的细胞增殖速率显著更低(P < 0.05)，证明此铜离子浓度过高产生毒性作用，抑制了细胞增殖活力。因此，聚多巴胺修饰载铜(0.01，0.1 mol/L)聚己内酯可用于后续抑菌率的检测。
变形链球菌是口腔中的常见细菌之一。有研究指出，最佳抗菌金属离子浓度需要抗菌率超过90%，细胞增殖率超过80%[13, 27-28]。此次实验关于材料抗菌性能评价的部分，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜组变形链球菌的抑菌率为92.62%，结合CCK-8检测结果，确定聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜为最适铜离子浓度组。活死细菌和活死细胞染色结果进一步证明，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜组具有良好的抗菌活性，并且无明显的细胞毒性。此外有报道指出，聚多巴胺具有一定的抗菌性能[29]。此次实验中，聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜组并未观察到明显的抗菌效果。抗菌金属离子从静电纺丝膜释放出来时，控制释放动力学应遵循最佳抗菌效果，并且最小化对哺乳动物细胞的毒性的原则。实验中铜离子释放结果显示在28 d的时间里，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜组电纺丝膜第12天释放的铜离子质量浓度约为4.23 mg/L(66.6 μmol/L)，第28天的铜离子质量浓度约为5.26 mg/L(82.8 μmol/L)，处于无细胞毒性且有效抗菌的浓度范围内(10-4-10-5 mol/L)[13-14, 30]。此次实验中铜离子的释放结果，进一步验证了聚多巴胺改性载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜应用的可行性，其局部输送系统稳定，可以有效地将铜离子释放到目标区域，而没有超过最大毒性浓度。
有研究报道，聚多巴胺改性后的材料不仅可以促进细胞增殖，还可以促进细胞成骨分化[31-32]。此次实验中，成骨细胞碱性磷酸酶染色结果与之前的结论一致，聚多巴胺改性后材料的蓝染范围更大、颜色更深。有研究指出，铜离子不仅具有良好的抗菌性，还具有促进血管生成和促进骨骼形成的潜力；血管生成能力的提高可以进一步对骨骼代谢产生积极影响[33-37]。此次实验碱性磷酸酶染色结果显示，聚多巴胺修饰载铜(0.1 mol/L)聚己内酯电纺膜组染色范围较大且染色较深，成骨分化效果比聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜组更好，但实验并未设置载铜聚己内酯电纺膜的单独对照组，并不能确定促进骨生成的效果是由于聚多巴胺、铜离子或者两者的协同作用，因此应进一步完善实验做更深层次的探讨。关于铜离子促进血管生成的能力此次实验并未涉及，铜离子促进血管生成及促进骨生成的机制仍有待进一步研究。
关于静电纺丝及其表面改性后的材料，尽管迄今为止已经取得了进展，但仍需要对这些类型的材料进行进一步的改进。预计在不久的将来，将抗菌剂/抗菌成分装载到纳米装置中会开辟新的治疗途径。此外，关于铜离子抗菌且安全(对哺乳动物细胞和组织无损害)的浓度范围尚无一致的数据，将其负载于电纺丝膜或其他支架材料的安全且有效抗菌的最佳剂量的体内外实验仍需进一步研究。
综上所述，聚多巴胺修饰载铜聚己内酯静电纺纤维膜有望成为新一代骨组织工程支架材料，用于修复骨缺损，该材料在骨组织再生应用中具有广阔的前景。这种非抗生素策略与静电纺丝支架的结合为设计和制备功能性引导骨组织再生膜提供了一种新的发展方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

聚多巴胺修饰聚己内酯电纺膜载铜涂层的制备及抗菌和细胞性能评价

Preparation of copper loaded coating on polydopamine-modified polycaprolactone electrospun membrane and antibacterial and cellular properties evaluation

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[1]	靖金鹏, 张玥, 刘效敏, 刘壹. 活血类中药注射剂预防骨科术后深静脉血栓形成的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1467-1476.
[2]	高仓健, 杨振, 刘舒云, 李浩, 付力伟, 赵天元, 陈威, 廖志垚, 李品学, 眭翔, 郭全义. 静电纺丝技术在肩袖损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 637-642.
[3]	谭国忠, 涂欣冉, 郭黎洋, 钟嘉琳, 张阳, 江千舟. 3D打印明胶/海藻酸钠/58S生物玻璃骨缺损修复支架的生物安全性评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 521-527.
[4]	胡秋羽, 杨龙, 杨勇, 宋沈超. 聚己二酸丁二醇酯-对苯二甲酸丁二醇酯/Ⅰ型胶原取向纤维促进前交叉韧带断裂后腱-骨愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4314-4319.
[5]	徐冉, 陈星羽, 李志强. 羟基磷灰石复合支架负载抗菌性药物：药物与支架的相互作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4411-4416.
[6]	王钰莹, 余丽梅. 制备人羊膜间充质干细胞制剂与质量控制过程中关键问题的思考[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4016-4021.
[7]	许馨之, 张悦, 金颖, 金春香. 一种新型安全近红外发光纳米粒的制备及成像实验 [J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3450-3454.
[8]	刘亮, 胡高铨, 韦昭, 陈琳, 洪枫. 细菌纳米纤维素/聚多巴胺复合管作为小口径人工血管的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3535-3542.
[9]	郭洋妍, 喻正文, 张剑. 镁合金生物材料动物体内实验的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3556-3565.
[10]	卢海平, 郎雪梅, 张程, 剧松立, 张怡, 王信. 聚己内酯改良生物屏障膜在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3580-3585.
[11]	郭苏童, 郭宇, 王凌, 李雅欣, 丁育健, 高静锋, 徐海涛, 任天皓, 冯德宏. 铜离子在骨组织工程中的应用：生物相容性、抗菌性、血管生成活性及成骨活性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3410-3414.
[12]	冯乐, 邱鹏, 刘敏, 周会. 壳聚糖改性聚醚醚酮表征及对MC3T3-E1细胞黏附、增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3351-3356.
[13]	单政铭, 陶述春, 胡春梅, 张治元, 丁一楠, 何梦铖, 唐秋莎. 人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 3036-3042.
[14]	刘家利, 索海瑞, 杨翰, 王玲, 徐铭恩. 填充结构对3D打印聚己内酯支架力学性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2492-2497.
[15]	董志恒, 高艳, 刘贞, 韩晓谦. 构建淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜及体外促成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1510-1514.