负载表没食子儿茶素没食子酸酯硅酸钙微球的制备及抗菌性能评价

doi:10.12307/2023.553

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4769-4775.doi: 10.12307/2023.553

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负载表没食子儿茶素没食子酸酯硅酸钙微球的制备及抗菌性能评价

范好美1，2，3，肖东琴2，匙峰4，罗栩伟2，魏剑林3，庄化迪3，刘晋珲5，赵菊花1，3

1西南医科大学临床医学院，四川省泸州市 646000；2川北医学院第二临床学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000；3南充市中心医院皮肤科，四川省南充市 637000；4西华师范大学组织修复材料工程技术协同创新中心，四川省南充市 637000；5 西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2022-08-05 接受日期:2022-10-14 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-01
通讯作者: 肖东琴，博士，副研究员，川北医学院第二临床学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000 刘晋珲，工程师，西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，四川省泸州市 646000 赵菊花，博士，主任医师，西南医科大学临床医学院，四川省泸州市 646000；南充市中心医院皮肤科，四川省南充市 637000
作者简介:范好美，女，1998年生，四川省绵阳市人，西南医科大学在读硕士，主要从事损容性皮肤疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82002289)，项目负责人：肖东琴；四川省科技厅应用基础研究项目 (2022NSFSC0685)，项目负责人：肖东琴；四川省科技厅应用基础研究项目(2022NSFSC0609)，项目负责人：罗栩伟；四川省医学科研课题计划项目(S20012)，项目负责人：肖东琴；南充市校合作项目(20SXQT0335)，项目负责人：肖东琴；南充市校合作项目(18SXHZ03590)，项目负责人：赵菊花；四川省卫生健康委员会医学科技项目(21PJ196)，项目负责人：罗栩伟；四川省卫生健康委员会医学科技项目(21PJ197)，项目负责人：赵菊花；泸州市科学技术和人才工作局泸州市重点研发科技计划项目(2018-GYF-10) ，项目负责人：刘晋珲；四川省中医药管理局中医药专项课题(2020LC0149)，项目负责人：赵菊花

Preparation of calcium silicate microspheres loaded with epigallocatechin gallate and investigation on its antibacterial performance

Fan Haomei1, 2, 3, Xiao Dongqin2, Shi Feng4, Luo Xuwei2, Wei Jianlin3, Zhuang Huadi3, Liu Jinhui5, Zhao Juhua1, 3

1School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Tissue Engineering and Stem Cell Research Institute of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 3Department of Dermatology of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 4Collaborative Innovation Center for Tissue Repair Material Engineering Technology, China West Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 5Department of Orthopedics and Arthrology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Province Orthopaedic Implantation Device Development and Application Technology Engineering Laboratory, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2022-08-05 Accepted:2022-10-14 Online:2023-10-28 Published:2023-04-01
Contact: Xiao Dongqin, PhD, Associate researcher, Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Tissue Engineering and Stem Cell Research Institute of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Liu Jinhui, Engineer, Department of Orthopedics and Arthrology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Province Orthopaedic Implantation Device Development and Application Technology Engineering Laboratory, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Zhao Juhua, PhD, Chief physician, School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Dermatology of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Fan Haomei, Master candidate, School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Tissue Engineering and Stem Cell Research Institute of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Department of Dermatology of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82002289 (to XDQ); Sichuan Provincial Department of Science and Technology Applied Basic Research Project, No. 2022NSFSC0685 (to XDQ), No. 2022NSFSC0609 (to LXW); Sichuan Provincial Medical Research Project Program, No. S20012 (to XDQ); Nanchong City School Cooperation, No. 20SXQT0335 (to XDQ), No. 18SXHZ03590 (to ZJH); Medical Science and Technology Project of Sichuan Provincial Health Commission, No. 21PJ196 (to LXW), No. 21PJ197 (to ZJH); Luzhou City Key Research & Development Technology Plan Project of Luzhou City Science and Technology and Talent Work Bureau, No. 2018-GYF-10 (to LJH); Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Special Project on Traditional Chinese Medicine, No. 2020LC0149 (to ZJH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

表没食子儿茶素没食子酸酯：是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素，具有抑菌、抗氧化、防辐射、抗衰老、降血脂、降血糖等多种生理活性。表没食子儿茶素没食子酸酯作为一种广谱、强效、低毒的抗菌药已被世界上许多国家的学者所公认。
硅酸钙微球：硅酸钙是一类无机化合物，由Ca、Si和O元素组成。硅酸钙微球因其具有良好的生物相容性、生物活性、生物降解性、高比表面积而被广泛应用于药物携载、骨组织再生、伤口愈合等组织再生领域。

背景：茶多酚的主要活性成分为表没食子儿茶素没食子酸酯，其具有抗氧化、抗菌、抗凋亡、抗炎等多种生物学功能。为实现表没食子儿茶素没食子酸酯的可控释放、提高其生物利用度，开发具有生物活性的茶多酚载体是亟待解决的难题。
目的：制备高效负载表没食子儿茶素没食子酸酯的微球，同时加测其抗菌性能及生物相容性。
方法：采用化学沉淀法分别制备硅酸钙微球与二氧化硅微球，利用X射线光电子能谱、透射电镜、场发射扫描电子显微镜、比表面积分析仪、激光粒度分析仪对微球的性能进行表征。将两种微球分别浸泡于表没食子儿茶素没食子酸酯溶液中，制备负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球与二氧化硅微球(分别记为CSM-EGCG、SM-EGCG)，检测微球的载药量及包封率，以及体外表没食子儿茶素没食子酸酯的释放情况。将未载药的硅酸钙微球、二氧化硅微球及CSM-EGCG、SM-EGCG分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌共培养，检测抑菌率。将上述4种微球分别与人皮肤成纤维细胞共培养，通过CCK-8法评估细胞活性。

结果与结论：①表征实验结果显示，硅酸钙微球和二氧化硅微球均为介孔微球，分散性好，硅酸钙微球的比表面积、总孔体积、平均孔径均大于二氧化硅微球；②CSM-EGCG的包封率为(72.0±0.5)%，载药量为(58.4±0.4)%；SM-EGCG的包封率为(41.6±0.7)%，载药量为(45.0±1.3)%；CSM-EGCG微球较SM-EGCG微球具有更好的药物携载能力，且体外释药时间可持续19 d以上，累计释放量达到(88.1±3.0)%；③二氧化硅微球无抗菌能力，硅酸钙微球、SM-EGCG、CSM-EGCG对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为(28.0±4.2)%，(63.9±1.0)%，(95.6±0.5)%，对大肠杆菌的抑菌率分别为(27.5±7.0)%，(51.9±1.4)%，(93.4±1.0)%；④CCK-8检测显示，硅酸钙微球及CSM-EGCG具有良好的细胞相容性，具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的能力；⑤结果表明，负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球具有良好的抗菌性及细胞相容性。

https://orcid.org/0000-0002-9994-2473(范好美)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 硅酸钙, 茶多酚, 缓释, 抗菌性, 表没食子儿茶素没食子酸酯, 生物相容性

Abstract: BACKGROUND: The main active component of tea polyphenols is epigallocatechin gallate, which has various biological functions such as antioxidation, antibacteria, anti-apoptosis, and anti-inflammation. To realize the controllable release of tea polyphenols and improve their bioavailability, it is urgent to develop bioactive carriers for tea polyphenols.
OBJECTIVE: To prepare microspheres loaded with high-efficiency epigallocatechin gallate, and measure its antibacterial performance and biocompatibility.
METHODS: Calcium silicate microspheres were prepared by chemical precipitation method. X-ray photoelectron spectroscopy, transmission electron microscopy, field emission scanning electron microscopy, surface area measurement and laser particle size analyzer were used to characterize the performance of the microspheres. The two kinds of microspheres were immersed in epigallocatechin gallate solution respectively to prepare calcium silicate microspheres and silica microspheres loaded with epigallocatechin gallate (named as CSM-EGCG and SM-EGCG, respectively). The drug loading rate and encapsulation rate of the microspheres, as well as the release of epigallocatechin gallate in vitro were detected. The unloaded calcium silicate microspheres, silica microspheres, CSM-EGCG and SM-EGCG were co-cultured with Staphylococcus aureus and Escherichia coli, respectively, to detect the antibacterial capacity. The above four kinds of microspheres were co-cultured with human skin fibroblasts respectively, and the cell viability was evaluated by CCK-8 assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The characterization experiment results showed that the prepared calcium silicate spheres and silica spheres were mesoporous microspheres, and the specific surface area, total pore volume and average pore size of calcium silicate spheres were larger than those of silica spheres. (2) The encapsulation rate and drug loading rate of CSM-EGCG were (72.0±0.5)% and (58.4±0.4)%, respectively. The encapsulation rate and drug loading rate of SM-EGCG were (41.6±0.7)% and (45.0±1.3)%, respectively. CSM-EGCG microspheres had better drug loading capacity than SM-EGCG microspheres, and the drug release time in vitro lasted for more than 19 days, and the cumulative release reached (88.1±3.0)%. (3) Silica microspheres had no antibacterial activity. The antibacterial rates of calcium silicate microspheres, SM-EGCG, and CSM-EGCG against Staphylococcus aureus were (28.0±4.2)%, (63.9±1.0)%, and (95.6±0.5)%, respectively. The antibacterial rates against Escherichia coli were (27.5±7.0)%, (51.9±1.4)%, and (93.4±1.0)%, respectively. (4) CCK-8 assay results showed that the calcium silicate spheres and CSM-EGCG had good cell biocompatibility and showed enhanced proliferation of human skin fibroblasts. (5) These results verified that the epigallocatechin gallate-loaded calcium silicate spheres have good antibacterial activity and cytocompatibility.

Key words: calcium silicate, tea polyphenols, sustained release, antibacterial property, epigallocatechin gallate, biocompatibility

中图分类号:

范好美, 肖东琴, 匙峰, 罗栩伟, 魏剑林, 庄化迪, 刘晋珲, 赵菊花. 负载表没食子儿茶素没食子酸酯硅酸钙微球的制备及抗菌性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4769-4775.

Fan Haomei, Xiao Dongqin, Shi Feng, Luo Xuwei, Wei Jianlin, Zhuang Huadi, Liu Jinhui, Zhao Juhua. Preparation of calcium silicate microspheres loaded with epigallocatechin gallate and investigation on its antibacterial performance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4769-4775.

图/表（结果） 11

2.1 各组微球表征结果 X射线光电子能谱检测结果显示，所制备的二氧化硅微球及硅酸钙微球在533 eV处均检测到O峰(O1s)，103 eV处均检测到Si峰(Si2p)，此外，硅酸钙微球还在348 eV处检测到Ca峰(Ca2p)，见图1，表明所制备的二氧化硅微球的主要成分为二氧化硅，半定量结果显示，Si、O元素含量分别为29.67%，64.91%；硅酸钙微球的主要成分为硅酸钙，含有Si、O、Ca元素，含量分别为18.76%，61.02%，6.92%，见表1。

从透射电镜图片可以看出，二氧化硅及硅酸钙微球粉体形貌均主要为类球形，颗粒分散性好，电子衍射均未见明显衍射环，表明微球结晶度低，为无定形微球，见图2。图3为二氧化硅微球及硅酸钙微球的扫描电镜及粒径分布图，二氧化硅微球的粒径为140-300 nm，硅酸钙微球的粒径大为160-340 nm。

如表2所示，用激光粒度分析仪测定的二氧化硅微球及硅酸钙微球的水力直径(Dh)分别为296.43，324.05 nm，比扫描电镜图片中所测微球的粒径略大，这是由于纳米粒子表面含有大量的硅羟基，亲水的纳米粒子在水溶液中处于粘连和高度溶胀的状态；分散系数PDI分别为0.27，0.22，表明纳米粒子具有良好的分散性。二氧化硅微球的Zeta电位值为-11.60 mV，硅酸钙微球的Zeta电位值为13.80 mV，这表明硅酸钙微球表面含带正电荷的钙离子。

此外，对制备的样品进行比表面积分析。从N2吸附-脱附曲线(图4A、C)以及BJH孔径分布(图4B、D)结果可以看出，吸附和脱附等温线不重合，且存在明显的滞后环。因此，吸附-脱附等温线为典型的Ⅳ型等温线，表明产物具有介孔结构。BJH孔径分布结果表明，产物具有较好的孔径结构，这些孔径大多是介孔(孔径小于10 nm)。表3显示所制备硅酸钙微球的比表面积、总孔体积、平均孔径均大于二氧化硅微球。

2.2 微球对表没食子儿茶素没食子酸酯的包封率及载药量通过化学分析发现，CSM-ECGG的包封率为(72.0±0.5)%，载药量为(58.4±0.4)%；SM-ECGG的包封率为(41.6±0.7)%，载药量为(45.0±1.3)%，见图5，表明硅酸钙微球比二氧化硅微球具有更高的药物携载能力(P < 0.001)。

2.3 载药微球的药物释放由图6可见，CSM-EGCG中的钙离子在前1 d释放快速，累计释放率达到(20.6±1.3)%，后缓慢释放，19 d时累计释放率达到(35.2±1.2)%；对于表没食子儿茶素没食子酸酯，SM-EGCG、CSM-EGCG均在前1 d具有突释现象，累计释放率分别达到(76.1±2.7)%，(63.4±3.6)%，1 d后药物释放均较为平缓，至19 d时累计释放率分别为(98.8±3.7)%，(88.1±3.0)%，表明CSM-EGCG比SM-EGCG药物释放更加缓慢，有利于药物的控制释放。

2.4 各组微球的抗菌性能各组样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌能力如图7所示。与对照组相比，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与二氧化硅微球接触培养12 h后菌落数量未见明显变化，与硅酸钙微球、SM-EGCG、CSM-EGCG接触培养12 h后菌落数量出现一定程度下降，其中CSM-EGCG组金黄色葡萄球菌和大肠杆菌数量明显减少。硅酸钙微球、SM-EGCG、CSM-EGCG对金黄色葡萄球菌抑菌率分别为(28.0±4.2)%，(63.9±1.0)%，(95.6±0.5)%，对大肠杆菌的抑菌率分别为(27.5±7.0)%，(51.9±1.4)%，(93.4±1.0)%。抗菌结果表明，二氧化硅微球不具有抗菌性能，硅酸钙微球具有一定的抗菌性能，表没食子儿茶素没食子酸酯的加入则可以显著提高二氧化硅微球、硅酸钙微球的抗菌性能。

2.5 各组微球的细胞生物相容性 CCK-8检测结果显示，培养第1天，与空白对照组相比，各微球组人皮肤成纤维细胞增殖能力无明显变化(P > 0.05)；培养第4天，与空白对照组相比，CSM-EGCG组细胞增殖速率提高(P < 0.05)，其余各组之间无明显差异(P > 0.05)；培养第7天，与二氧化硅微球组相比，硅酸钙微球组细胞增殖速率提高(P < 0.01)，表明与二氧化硅微球相比，硅酸钙微球具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的能力；与对应的未载药空白微球相比，SM-EGCG与CSM-EGCG表现出更高的细胞增殖速率(P < 0.001)，表明表没食子儿茶素没食子酸酯的加入可显著提高微球促细胞增殖能力，见图8。

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引言

茶多酚是茶叶中多羟基酚类物质的总称，因其高效的抗氧化及清除自由基功能，被广泛应用于食品、日化及医药卫生领域。此外，茶多酚在抗凋亡、抗菌消炎及抑制癌细胞生长方面起着重要作用[1-2]。茶多酚以儿茶素为主，占总量的65%-80%，包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表儿茶素，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯含量最高，约占80%。茶多酚作为天然的抗氧化剂，不仅具有免疫调节作用，还具有广谱而强效的抗菌功能，能抑制多种致病菌[3-4]。葡萄球菌属容易引发皮肤软组织感染，产生败血症等，尤其以金黄色葡萄球菌毒力最强。金黄色葡萄球菌成为最常见的医院感染病原菌，尤其是在骨科器械相关感染中其占据首要位置[5]。研究证明茶多酚能有效抑制金黄色葡萄球菌，对于其产生的α-毒素具有显著的抵抗作用[6]。此外，茶多酚还能抑制消化链球菌、肠炎球菌、血炎球菌等[7]。含表没食子儿茶素没食子酸酯/磷脂复合物的纳米囊原位凝胶，作为一种有效的抗龋齿制剂对变形链球菌具有很强的抗菌活性，可以降低其产酸和牙齿表面的附着力[8]。
为实现表没食子儿茶素没食子酸酯的可控释放、提高其生物利用度，各种生物材料被用作表没食子儿茶素没食子酸酯的载体，如蛋白质、多糖、脂质和无机材料。二氧化硅微球具有良好的生物相容性、化学稳定性以及高比表面积等优点，被广泛应用于药物递送等生物医学领域[9-11]。但是，二氧化硅微球表面仅有硅羟基，将其用于载药往往需要在表面引入官能化基团，进而改善其药物携载功能[12]。然而有机物的引入过程复杂且可能引入有毒物质，因此针对表没食子儿茶素没食子酸酯的负载，探索更为简单、绿色的方法提高其携载能力对表没食子儿茶素没食子酸酯在生物医学领域的应用具有重要意义。
基于表没食子儿茶素没食子酸酯分子结构中含有大量的酚羟基，可与多种金属离子(如钙、铜及铁等)发生络合作用[13]，此次实验拟在二氧化硅合成过程中引入钙离子，制备硅酸钙微球，考察其对表没食子儿茶素没食子酸酯的携载、控释能力，并对其体外抗菌性能及细胞相容性进行评价。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备及表征，体外抗菌实验，体外细胞学实验，组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年1月至2022年5月在南充市中心医院组织与工程干细胞研究所实验室完成。
1.3 材料原硅酸四乙酯、溴化十六烷基三甲铵、硝酸钙四水合物、氨水、表没食子儿茶素没食子酸酯(美国Sigma公司)；高糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；CCK-8 试剂盒(上海基屹生物科技有限公司)；金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 25923)、大肠杆菌(E. coli，ATCC 25922)(川北医学院赠送)；人皮肤成纤维细胞(美国赛业生物科技有限公司)；数显恒温多头磁力搅拌器(上海皓庄仪器有限公司，HJ-6A)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，ME104E)；X射线光电子能谱分析仪(美国默赛飞公司，Nexsa)；电感耦合等离子体质谱仪(美国PerkinElmer公司，Nex10N 350X)；紫外分光光度计(日本Hitachi 公司，UV2700i)；BET比表面积及孔径分析仪(北京贝士德仪器公司，BSD-PS)；场发射透射电镜(日本-JEOL-JEM 2100 F)；场发射扫描电镜(德国-蔡司-ZEISS sigma500)；激光粒度分析仪(美国PSS公司，NiCOMP 380 Z3000 Plus)。
1.4 实验方法
1.4.1 负载表没食子儿茶素没食子酸酯微球的制备
微球的制备：称取1.36 g十六烷基三甲基溴化铵溶于400 mL去离子水中，加入28%氨水16 mL，逐滴加入6.4 mL硅酸四乙酯，搅拌30 min后，加入2.25 g硝酸钙四水合物，室温600 r/min搅拌24 h，合成硅酸钙。此外，设不加入硝酸钙，采用相同方法合成二氧化硅。将制得的两种样品收集至离心管中，去离子水洗涤至上清液pH值为中性。无水乙醇洗涤3次后40 ℃干燥过夜，650 ℃煅烧3 h(加热速度为2 ℃/min)，分别得到硅酸钙微球与二氧化硅微球。
表没食子儿茶素没食子酸酯的负载：将10 mg表没食子儿茶素没食子酸酯溶于5 mL去离子水中，分别加入5 mg二氧化硅微球及硅酸钙微球，37 ℃下避光搅拌过夜；8 000 r/min离心15 min，去上清液，加入5 mL去离子水洗涤2次，再次离心去上清液，最后冷冻干燥72 h，获得负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球(记为CSM-EGCG)及二氧化硅微球(记为SM-EGCG)。
1.4.2 样品性能表征采用X射线光电子能谱测定样品化学组成；采用比表面积及孔容分析仪测定样品比表面积和Barrett-Joyner-Halenda(BJH)孔径分布，比表面积按照 Barrett-Emmett-Teller方法计算得到；采用场发射透射电镜和场发射扫描电镜对样品尺寸、结构进行表征；采用激光粒度分析仪测定样品粒径分布及Zeta电位值。
1.4.3 样品包封率及载药量测定
采用酒石酸亚铁法测定表没食子儿茶素没食子酸酯含量：茶叶中的多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，用紫外分光光度计在540 nm处测其吸光度值，根据建立的表没食子儿茶素没食子酸酯标准曲线计算样品中表没食子儿茶素没食子酸酯含量。称取硫酸亚铁0.1 g和酒石酸钾钠0.5 g，用去离子水溶解并定容至100 mL，配置得到酒石酸亚铁溶液。
表没食子儿茶素没食子酸酯标准曲线绘制：用电子分析天平准确称取表没食子儿茶素没食子酸酯5，10，15，20，25，30 mg(准确至0.000 1 g)，分别置于10 mL的容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度，此时，表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的理论质量浓度为0.5，1，1.5，2，2.5，3.0 mg/mL。用移液枪分别取1 mL上述不同质量浓度的茶多酚水溶液于25 mL的容量瓶中，并分别向这5个容量瓶中加入4 mL去离子水和5 mL酒石酸亚铁溶液，混匀，用pH=7.5的PBS定容至刻度。以空白试剂作参比，用紫外分光光度计分别测它们在540 nm波长处的吸光度值。然后以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制表没食子儿茶素没食子酸酯标准曲线。
包封率及载药量测定：按照1.4.1表没食子儿茶素没食子酸酯的负载所述方法收集上清液，分别取1 mL上清液转入50 mL容量瓶中，并加入4 mL去离子水和5 mL酒石酸亚铁溶液，混匀后用pH=7.5的PBS定容至50 mL。采用紫外分光光度计测其在540 nm波长处吸光度值。
根据标准曲线方程计算出相应的浓度C，并根据公式计算出上清液中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量 m=C×10。
包封率=(10-m)/10×100%
载药量=(10-m)/[(10-m)+5]×100%
1.4.4 样品表没食子儿茶素没食子酸酯、钙离子的释放测定称取10 mg CSM-EGCG和10 mg SM-EGCG分别分散于3 mL PBS中，置于37 ℃摇床，在设定时间点8 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液用于表没食子儿茶素没食子酸酯浓度测定，并补入1 mL新鲜PBS。通过上述酒石酸亚铁法测定表没食子儿茶素没食子酸酯浓度。通过电感耦合等离子体质谱仪测定溶液中钙离子浓度，绘制表没食子儿茶素没食子酸酯、钙离子释放曲线。
1.4.5 样品抗菌性能评价取未载药的硅酸钙微球、二氧化硅微球及CSM-EGCG、SM-EGCG，配置质量浓度为1 mg/mL的样品悬浊液，均匀分散，吸取100 μL装入96孔板并保持在 37 ℃。然后将金黄色葡萄球菌(S.aureus)及大肠杆菌(E.coli)菌悬液(10 μL，106 CFU/mL)分别加入孔板中，置于37 ℃恒温摇床中孵育12 h。以100 μL PBS 培养的菌群为对照。此后，取50 μL 共培养后的菌悬液，将其接种在营养琼脂板上并培养12 h，平板上的菌落数用ImageJ 软件计数。每组3个平行样，实验重复3次，结果拍照记录。
1.4.6 样品细胞生物学性能评价采用CCK-8 法测定样品(未载药的硅酸钙微球、二氧化硅微球及CSM-EGCG、SM-EGCG)对体外细胞增殖的影响。分别称取适量样品平铺于培养皿中，置于紫外光下过夜灭菌。将人皮肤成纤维细胞接种于含有完全培养基(含体积分数10%胎牛血清+1%双抗的高糖DMEM培养基)的96孔细胞培养板内，细胞密度为1×104细胞/孔，每孔培养基终体积为100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2环境下培养 24 h。待细胞长到80%左右，在细胞孔中加入相同质量的灭菌样品，每个样品设5个平行样，同时设置无样品的空白对照组。分别于1，4，7 d时，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养箱内孵育，2 h 后在酶标仪上450 nm 波长处检测吸光度值。
1.5 主要观察指标负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球及二氧化硅微球的载药量、包封率，药物释放、抗菌能力及细胞生物学性能。
1.6 统计学分析实验中所有数据分析均设置3个平行样，实验数据以x±s表示，采用SPSS 23.0软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用T检验，P < 0.05则认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

茶多酚的主要活性成分为表没食子儿茶素没食子酸酯，其具有抗氧化、抗菌、抗凋亡、抗炎等多种生物学功能[14]。然而，茶多酚溶解度低，不耐酸碱，在生理环境中稳定性较差，在达到病灶部位前易被分解，从而限制了其生物活性的发挥[15]。因此，人们通过开发载体将表没食子儿茶素没食子酸酯包裹于载体内部或吸附于载体表面，以达到延缓释放并提高其生物利用度的目的。此次实验所制备硅酸钙微球载体直径为160-340 nm，比表面积高达389.831 8 m2/g，对表没食子儿茶素没食子酸酯的包封率高达(72.0±0.5)%，释放19 d时表没食子儿茶素没食子酸酯释放率为(88.1±3.0)%，表明制备的硅酸钙微球具有良好的药物负载能力及控释能力。同时，携载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出良好的抗菌性，其抑菌率分别达到(95.6±0.5)%和(93.4±1.0)%。此外，负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球能促进人皮肤成纤维细胞的增殖，表明微球无细胞毒性。
不同的载体材料对表没食子儿茶素没食子酸酯的负载率及生物利用率不同。目前，常用于携载表没食子儿茶素没食子酸酯的生物材料包括脂质体、蛋白质、壳聚糖及无机载体等。脂质体、蛋白质及壳聚糖等有机物载体在制备及应用过程中易受环境因素影响结构发生变化，导致载药稳定性变差[16-17]。而无机载体(如二氧化硅微球、金纳米粒子)因制备简单、结构稳定而得到广泛研究[18-19]，但其表面往往需要利用有机官能团进行功能化修饰才能发挥良好的载药功能。此次实验在二氧化硅制备过程中引入钙离子制备硅酸钙介孔微球，相比于二氧化硅微球，硅酸钙微球的比表面积更高(389.8 m2/g vs. 211.3 m2/g)，介孔总体积更大(0.9 mL/g vs. 0.5 mL/g)。在影响载药能力的众多因素中，除比表面积及介孔结构外，载体材料表面的化学性质也起着重要作用。茶多酚中的邻苯三酚/邻苯二酚基团能与多种金属阳离子(例如Mg2+、Ca2+、Al3+和Fe3+)发生螯合以形成不同的多酚金属配位络合物[13]。当酚羟基脱质子化时其产生具有高电荷密度的氧中心，使多酚成为金属阳离子络合的良好配体。因此，硅酸钙材料表面的钙离子能通过络合作用、氢键及静电作用等与多酚中所含-COOH或-OH基团结合，从而有效增强材料对茶多酚的吸附能力。此次实验利用所制备硅酸钙微球携载表没食子儿茶素没食子酸酯时，其包封率可达(72.0±0.5)%，载药量可达(58.4±0.4)%，相比于二氧化硅微球的包封率(41.6±0.7)%、载药量(45.0±1.3)%，硅酸钙微球表现出更好的药物携载能力(P < 0.001)，这可能归因于其高比表面积及表面钙离子的共同作用。
接着，对表没食子儿茶素没食子酸酯的释放情况进行研究后发现，SM-EGCG与CSM-EGCG在释放第1天均有突释现象，SM-EGCG的表没食子儿茶素没食子酸酯累计释放率为(76.1±2.7)%，CSM-EGCG的表没食子儿茶素没食子酸酯累计释放率为(63.4±3.6)%，这可能是吸附于介孔表面的表没食子儿茶素没食子酸酯扩散释放到溶液中所致，与ZHANG等[20]的报道结果类似；CSM-EGCG表面的表没食子儿茶素没食子酸酯突释较SM-EGCG慢，可能是其表面钙离子与多酚的络合作用延缓了表没食子儿茶素没食子酸酯的释放。随着时间延长到4 d时，SM-EGCG的表没食子儿茶素没食子酸酯累计释放率为(92.3±2.7)%，CSM-EGCG的表没食子儿茶素没食子酸酯累计释放率为(70.3±2.4)%；当时间延长到19 d时，CSM-EGCG的表没食子儿茶素没食子酸酯累计释放率为(88.1±3.0)%，这表明相比于二氧化硅微球表面的快速释放，硅酸钙微球有利于延缓表没食子儿茶素没食子酸酯的释放，实现药物的长期缓释。
临床上由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等引发的感染治疗仍是医学领域面临的重大挑战。为了预防术后感染，临床往往采用全身使用抗生素防止细菌定植及感染的发生，但抗生素长期使用产生的耐药问题可能危及整个社会。因此，探索抗生素的替代物实现局部抗菌成为研究的热点。前期，作者将铜离子负载在钛植入体表面，发现高浓度的铜离子对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均表现出良好的抗菌功能[21]，但同时高浓度的铜离子对细胞也表现出了毒性作用。此次细菌实验结果表明，微球携载表没食子儿茶素没食子酸酯后有利于增强二氧化硅及硅酸钙微球的抗菌效率，这可能是由于表没食子儿茶素没食子酸酯的突释使表没食子儿茶素没食子酸酯达到了抑菌浓度，尤其是CSM-EGCG对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均表现出良好的抗菌作用(> 93%)，这可能归因于硅酸钙微球能高效负载茶多酚；表没食子儿茶素没食子酸酯对细菌的抑制作用呈剂量相关性，且CSM-EGCG在杀灭细菌的同时无明显细胞毒性。REN等[22]的研究表明，茶多酚掺合的超高分子量聚乙烯对人脂肪来源干细胞没有生物毒性，并且可以有效减少细菌在体内引起的炎症。因此，相比于金属离子抗菌引发的细胞毒性，茶多酚具有良好的细胞相容性。此外，茶多酚作为天然的抗菌剂还能避免产生细菌耐药问题。目前针对茶多酚的抗菌机制提出了如下几种途径[23]：破坏菌体的细胞膜结构，阻碍菌体蛋白质的合成与表达，干扰菌体 DNA 的正常功能。临床上，手术植入后6 h是植入体感染发生的关键期，在此期间进入人体的病原体处于静止状态，这成为杀死植入体周围病原体的关键时机[24]。因此，表没食子儿茶素没食子酸酯在微球表面的突释有利于在短期内杀灭细菌，阻碍其近一步生长，随后表没食子儿茶素没食子酸酯缓慢释放，虽然浓度无法杀菌，但有望起到调节细胞功能(如增殖、抑炎等)的作用[25-26]。此外，与二氧化硅微球相比，硅酸钙微球表现出一定的抗菌性能，这可能与硅酸钙会导致周围环境碱化有关[27]。研究证实茶多酚在弱碱环境中的抑菌活性强于中性环境[28]。因此，作者推测负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球表现出更强的抗菌能力与高比面积、与钙离子和表没食子儿茶素没食子酸酯的络合作用以及表没食子儿茶素没食子酸酯在弱碱环境中的抗菌性增强相关。
材料与细胞之间是否具有良好的生物相容性是评价载药微球性能的重要指标。此次实验中，CSM-EGCG的主要成分硅酸钙、表没食子儿茶素没食子酸酯已被广泛用于组织工程再生修复研究，其安全性已得到证实[29-30]。将各组微球样品与人皮肤成纤维细胞共培养，与空白对照组相比，各微球组第1天细胞增殖无明显变化，表明所制备样品无细胞毒性；随着时间延长到第7天时，与二氧化硅微球组相比，硅酸钙微球组的细胞增殖速率更高，表明硅酸钙微球更能促进细胞增殖。研究表明，硅酸钙不仅具有促进骨骼和牙齿等硬组织再生的功能[31]，还可以通过调节干细胞及组织特异性细胞，如成纤维细胞、皮肤表皮细胞等，促进皮肤等软组织再生[32]。此外，在第4天时，CSM-EGCG细胞增殖速率较其他各组明显增高(P < 0.05)；在第7天时，SM-EGCG与二氧化硅微球相比、CSM-EGCG与硅酸钙微球相比均表现出更高的细胞增殖速率(P < 0.001)，表明表没食子儿茶素没食子酸酯的加入可显著提高微球促细胞增殖能力，这与LEE等[33]的研究结果一致。因此，硅酸钙与表没食子儿茶素没食子酸酯均具有良好的生物相容性，有望共同促进组织修复。
综上所述，此次实验所制备的负载表没食子儿茶素没食子酸酯的硅酸钙微球载药量大，具有延缓药物释放的特性，同时具有较强的抗菌性能、良好的生物相容性以及促进人皮肤成纤维细胞增殖的能力。鉴于此，下一步拟将所制备的CSM-ECGG与水凝胶等生物材料复合，用于骨组织修复及伤口愈合等组织再生领域。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载表没食子儿茶素没食子酸酯硅酸钙微球的制备及抗菌性能评价

Preparation of calcium silicate microspheres loaded with epigallocatechin gallate and investigation on its antibacterial performance

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