负载肝细胞生长因子水凝胶对心肌梗死组织区域的作用

doi:10.12307/2023.547

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4802-4808.doi: 10.12307/2023.547

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负载肝细胞生长因子水凝胶对心肌梗死组织区域的作用

王南峰1，2，沈胜梅2，张佩生1，滕伟3

1郑州大学第五附属医院，河南省郑州市 450015；2河南大学附属南石医院，河南省南阳市 473000；3河南大学第一附属医院，河南省开封市 410200

收稿日期:2022-07-29 接受日期:2022-09-09 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-01
通讯作者: 张佩生，主任医师，郑州大学第五附属医院心内科二病区，河南省郑州市 450015
作者简介:王南峰，男，1988年生，河南省南阳市人，汉族，主要从事心血管病的相关诊疗研究。
基金资助:
河南省医学科技攻关计划(LHGJ20190506)，项目负责人：滕伟

Effects of hydrogels loaded with hepatocyte growth factor on myocardial infarction

Wang Nanfeng1, 2, Shen Shengmei2, Zhang Peisheng1, Teng Wei3

1The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450015, Henan Province, China; 2Nanshi Hospital of Nanyang, Nanyang 473000, Henan Province, China; 3The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 410200, Henan Province, China

Received:2022-07-29 Accepted:2022-09-09 Online:2023-10-28 Published:2023-04-01
Contact: Zhang Peisheng, Chief physician, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450015, Henan Province, China
About author:Wang Nanfeng, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450015, Henan Province, China; Nanshi Hospital of Nanyang, Nanyang 473000, Henan Province, China
Supported by:
The Medical Science and Technology Foundation of Henan Province, No. LHGJ20190506 (to TW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肝细胞生长因子：是一种间质细胞衍生的多功能细胞因子，在细胞分裂及运动、血管形成与组织损伤修复中发挥着重要作用。研究显示肝细胞生长因子还是一种心肌营养因子，也是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有非常强的促血管内皮细胞有丝分裂作用，可抑制细胞凋亡与组织重构，促进内皮损伤的修复。
心肌梗死：是心血管疾病中最常见且致死率最高的一种，心肌梗死后冠状动脉阻塞，缺血性损伤将导致心肌细胞发生凋亡，诱发负性左心室重构，此为机体心室代偿性修复与继发性改变的自然过程，该过程伴随心室容积、形态、大小等的改变，进而导致心脏功能与结构异常，最终将诱发心力衰竭。

背景：研究证实肝细胞生长因子可显著减轻糖尿病大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡、改善心功能，但是以往的研究多是静脉注射或是基因转染的给药方式，利用药物缓释系统给药的研究不多见。
目的：以水凝胶作为肝细胞生长因子的载体，有效注射至心肌梗死部位，观察其改善心功能的效果。
方法：制备甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶，检测该水凝胶对心肌细胞的相容性与体外生长因子释放特征。取3月龄雄性SD大鼠54只，结扎冠状动脉左前降分支复制心肌梗死模型，采用随机数字表法分3组处理：未治疗组于心肌梗死边缘分多点注射PBS，无生长因子水凝胶组于心肌梗死边缘分多点注射甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠水凝胶，载生长因子水凝胶组心肌梗死边缘分多点注射甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶，每组18只，于设定时间点进行相关检测。

结果与结论：①活死染色与CCK-8实验结果显示，甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶具有良好的细胞相容性，可促进心肌细胞的增殖与存活；甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶可持续释放肝细胞生长因子达42 d以上；②造模后第7，14，35天，与未治疗组、无生长因子水凝胶组比较，载生长因子水凝胶组大鼠舒张末期左室容积及收缩末期左室容积减小(P < 0.05)，左室射血分数、左室短轴缩短率增加(P < 0.05)；③造模后第35天的苏木精-伊红与Masson染色显示，与未治疗组相比，两治疗组大鼠心肌组织病理均有明显改善，其中以载生长因子水凝胶组改善更明显；④造模后第35天的Tunel染色与α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色显示，载生长因子水凝胶组大鼠的心肌细胞凋亡数量低于未治疗组、无生长因子水凝胶组(P < 0.05)，微血管密度大于未治疗组、无生长因子水凝胶组(P < 0.05)；⑤结果表明，将甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶注射于心肌梗死部位，可抑制心肌细胞凋亡及心肌纤维化、促进血管新生、延缓左心室重塑，达到改善心功能的目的。

https://orcid.org/0000-0003-0505-0368(王南峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 心肌梗死, 水凝胶, 肝细胞生长因子, 心功能, 心血管疾病, 药物缓释

Abstract: BACKGROUND: Hepatocyte growth factor (HGF) has been shown to reduce cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction in diabetic rats. Intravenous injection or gene transfection is common methods of drug delivery in many previous studies; however, a sustained release system was used in very few studies.
OBJECTIVE: To investigate the effects of intramyocardial injection of hydrogels loaded with HGF on myocardial infarction.
METHODS: The sodium glycerophosphate/chitosan/sodium alginate/HGF composite hydrogel was prepared, and the compatibility of the hydrogel with cardiomyocytes and the release characteristics of growth factors in vitro were detected. A total of 54 male Sprage-Dawley rats (3 months old) were used for the establishment of myocardial infarction models by ligating the left anterior descending branch of the coronary artery and equally and randomly divided into three groups: untreated (multi-point injection of PBS at the edge of myocardial infarction), hydrogel without HGF (multi-point injection of sodium glycerophosphate/chitosan/sodium alginate composite hydrogel at the edge of myocardial infarction), and hydrogel with HGF (multi-point injection of sodium glycerophosphate/chitosan/sodium alginate/HGF composite hydrogel at the edge of myocardial infarction) groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Live-dead cell staining and CCK-8 assay showed that sodium glycerophosphate/chitosan/sodium alginate/hepatocyte growth factor hydrogel had good cytocompatibility and promoted the proliferation and survival of cardiomyocytes and could sustainably release HGF for more than 42 days. (2) The left ventricular volume and left ventricular volume at the end of diastole were significantly decreased in the hydrogel with HGF groups (P < 0.05), while the left ventricular ejection fraction and left ventricular short-axis shortening rate were significantly increased (P < 0.05) compared with the other two groups at 7, 14, 35 days after surgery. (3) Hemotoxylin-eosin and Masson stainings showed that the myocardial histopathology of rats in both treatment groups was significantly improved compared with the untreated group, and the most obvious improvement was found in the hydrogel with HGF group at 35 days after surgery. (4) TUNEL staining and α-smooth muscle actin immunofluorescence staining showed that the number of cardiomyocyte apoptosis was significantly decreased, while microvessel density was significantly increased in the hydrogel with HGF group compared with the other groups (P < 0.05). (5) These findings exhibit that intramyocardial injection of sodium glycerophosphate/chitosan/sodium alginate/hepatocyte growth factor composite hydrogel can inhibit cardiomyocyte apoptosis and myocardial fibrosis, promote revascularization, and delay left ventricular remodeling, improving cardiac function.

Key words: myocardial infarction, hydrogel, hepatocyte growth factor, cardiac function, cardiovascular disease, sustained drug release

中图分类号:

王南峰, 沈胜梅, 张佩生, 滕伟. 负载肝细胞生长因子水凝胶对心肌梗死组织区域的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4802-4808.

Wang Nanfeng, Shen Shengmei, Zhang Peisheng, Teng Wei. Effects of hydrogels loaded with hepatocyte growth factor on myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4802-4808.

图/表（结果） 12

2.1 SD乳鼠心肌细胞的形态观察刚分离出来的心肌细胞呈球形(图1A)，培养24 h后大部分细胞贴壁，细胞形态逐渐呈梭形或多边形(图1B)，培养48 h后可见完全贴壁的细胞伸出伪足，细胞形态呈梭形或者不规则形(图1C)，培养72 h后可见细胞相互交织成网状，邻近细胞出现同步搏动，搏动次数为36-120次/min(图1D)。

2.2 水凝胶材料的细胞相容性扫描电镜下可见GP/CS/SA/HGF水凝胶具有均匀的多孔结构，孔洞之间相互连通，孔径100-300 μm，见图2。活死染色显示，两组水凝胶上的心肌细胞状态良好，大量发出绿色荧光的活细胞黏附在水凝胶表面，较少见发出红色荧光的死细胞，并且随着培养时间的延长，水凝胶表面的细胞数量增加，伸展良好，且连接成片，GP/CS/SA/HGF水凝胶上的细胞数量多于GP/CS/SA水凝胶上的细胞数量，见图3。CCK-8实验检测结果显示，随着培养时间的延长，两组水凝胶上的心肌细胞增殖吸光度值升高，同时GP/CS/SA/HGF水凝胶上的细胞吸光度值高于GP/CS/SA水凝胶，见图4。

2.3 水凝胶的体外生长因子释放肝细胞生长因子在水凝胶中的释放率见图5。由图可见，在前7 d内，水凝胶释放肝细胞生长因子的速率较快，第7天时累计释放率达到(46.32±4.95)%，此后水凝胶释肝细胞生长因子的速率开始减慢，至21 d后肝细胞生长因子释放基本保持稳定，42 d时水凝胶中肝细胞生长因子的累计释放率为(92.37±4.98)%。

2.4 各组大鼠心功能检测结果各组大鼠心功能检测结果见表1。造模后第14，35天，与未治疗组比较，无生长因子水凝胶组大鼠舒张末期左室容积及收缩末期左室容积减小(P < 0.05)，左室射血分数、左室短轴缩短率增加(P < 0.05)；造模后第7，14，35天，与无生长因子水凝胶组比较，载生长因子水凝胶组大鼠舒张末期左室容积及收缩末期左室容积减小(P < 0.05)，左室射血分数、左室短轴缩短率增加(P < 0.05)。

2.5 各组大鼠心肌组织学分析苏木精-伊红染色结果显示，未治疗组大鼠心肌组织纤维排列松散且不规则，心肌纤维间距增大，胞质肿胀，间质水肿并伴有明显充血与炎性细胞浸润(图6A)；无生长因子水凝胶组(图6B)、载生长因子水凝胶组(图6C)大鼠心肌组织纤维排列略松散，排列较未治疗组规则，心肌纤维间距缩小，间质较少见水肿与炎性细胞浸润，其中以载生长因子水凝胶组病理改变更明显。

Masson染色结果显示，未治疗组大鼠心肌梗死中心部位可见致密的纤维结缔组织，心肌纤维组织较少，梗死周边部位结缔组织与心肌纤维紧密相间分布，心室厚度减少(图7A)；无生长因子水凝胶组(图7B)、载生长因子水凝胶组(图7C)大鼠心肌梗死中心部位可见稀疏的纤维结缔组织及较多的心肌纤维组织，梗死周边部位结缔组织与心肌纤维稀疏相间，心室厚度增加，其中以载生长因子水凝胶组心室厚度最大。对于Masson染色，利用Image plus 6.0图像分析软件分析各组大鼠梗死心肌瘢痕长度比值与心室厚度，见表2。

2.6 各组大鼠心肌细胞凋亡观察未治疗组、无生长因子水凝胶组、载生长因子水凝胶组梗死周边部位的Tunel阳性细胞数分别为(80.36±19.41)，(52.09±15.66)，(35.18±12.78)个/视野，未治疗组梗死周边部位的Tunel阳性细胞数最多，载生长因子水凝胶组梗死周边部位的Tunel阳性细胞数最少，见图8，9，3组间Tunel阳性细胞数比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.7 各组大鼠心肌组织微血管密度观察 α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色显示，未治疗组大鼠心肌梗死中心部位较少见新生的血管，无生长因子水凝胶组、载生长因子水凝胶组大鼠心肌梗死中心部位可见大量的新生血管，见图8，9。未治疗组、无生长因子水凝胶组、载生长因子水凝胶组新生血管数量分别为(11.36±2.13)，(49.37±6.74)，(88.37±8.57)个/视野，3组间新生血管数量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。
2.8 复合水凝胶材料的生物相容性由体外细胞实验与体内动物实验可得，甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶具有良好的生物相容性。

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引言

2019年全球性疾病负担研究显示，心血管疾病是全球死亡率与疾病负担的主要原因，成为威胁人类健康的首要因素，全球每年因心血管疾病死亡的人数约有1 700万[1-2]。心肌梗死是心血管疾病中最常见且致死率最高的一种，心肌梗死后冠状动脉阻塞，缺血性损伤将导致心肌细胞发生凋亡，诱发负性左心室重构，此为机体心室代偿性修复与继发性改变的自然过程，该过程伴随心室容积、形态、大小等的改变，进而导致心脏功能与结构异常，最终将诱发心力衰竭[3-4]。因此，通过促进血管新生在已经阻塞或狭窄的动脉周围重建旁路循环来增加缺血区血供，成为一种备受关注的新的治疗策略。
为了恢复血液循环的重建，学者们已采用多种方法来促进缺血区的血管新生[5-7]。外源性促血管再生因子对新生血管的形成至关重要[8-9]，虽然临床前试验证明通过局部注射生长因子可显著增加梗死后心肌血液灌注、改善组织代谢、提高心功能，但是这些生长因子并未产生太多的临床效果，主要是因为外源性生长因子在靶组织中的半衰期太短，不能完全发挥生物学效应。药物缓释系统由具有直接作用的药理活性分子与可降解的生物高分子结合形成药物运输体系，通过直接注射或经过体循环达到病患部位，以实现药物的局部可持续释放，克服了以往传统给药方式的不足[10-13]。
肝细胞生长因子是一种间质细胞衍生的多功能细胞因子，在细胞分裂及运动、血管形成与组织损伤修复中发挥着重要作用。研究显示肝细胞生长因子还是一种心肌营养因子[14-15]，也是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有非常强的促血管内皮细胞有丝分裂作用，可抑制细胞凋亡与组织重构，促进内皮损伤的修复。ZHANG等[16]研究证实肝细胞生长因子可显著减轻糖尿病大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡、改善心功能。但是，以往的研究多是静脉注射或是基因转染的给药方式，利用药物缓释系统给药的研究不多见。此次实验以水凝胶作为肝细胞生长因子的载体，有效注射至心肌梗死部位，观察其改善心功能的效果，以期为心肌梗死的治疗提供实验室数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组动物观察实验，采用one-way ANOVA进行组间比较。
1.2 时间及地点实验于2021年5-10月在郑州大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂与设备壳聚糖购自北京泽平科技有限责任公司；甘油磷酸钠购自苏州启航生物科技有限公司；海藻酸钠购自广东光华科技股份有限公司；肝细胞生长因子购自上海泽叶生物科技有限公司；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；戊巴比妥钠购自上海思域化工科技有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培养基购自北京伊诺凯科技有限公司；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自上海曼博生物医药科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白抗体、荧光二抗购自北京博尔迈生物技术有限公司；小动物呼吸机购自北京友诚生物科技有限公司；小动物超声影像仪购自北京益仁恒业科技有限公司；激光共聚焦显微镜购自北京普瑞赛司仪器有限公司。
1.3.2 实验动物 1-3 d龄SD乳鼠1只，用于提取心肌细胞；3月龄雄性SD大鼠54只，清洁级，体质量(220.39±16.71) g，用于心肌梗死造模。以上动物均购自郑州大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK(豫)2020-0008。实验前饲养于郑州大学实验动物中心实验房内，环境温度22-25 ℃，12 h/12 h明暗周期，自由进食饮水。成年大鼠适应性喂养1周后进行正式实验。动物实验获得郑州大学实验动物中心伦理审批。
1.4 实验方法
1.4.1 提取大鼠心肌细胞取1-3 d龄SD乳鼠，异氟烷吸入麻醉后断颈处死，无菌下迅速收集心脏，去除心包膜组织，以PBS清洗以去除血液，用眼科剪刀将心脏组织剪碎，置入0.25%胰蛋白酶(4 ℃)消化过夜，然后置入0.1%Ⅱ型胶原酶，轻柔搅拌下消化30 min，利用成纤维细胞与心肌细胞贴壁时间的不同，将上述制备的细胞悬液在培养箱中静置2 h，吸取上清，因为心肌细胞的贴壁时间为3 h，此时收集的上清液为心肌细胞悬液。100 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀的细胞重悬于完全培养基(体积分数15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素的高糖DMEM培养基)中，吹打均匀后，以 1×109 L-1的细胞浓度接种于培养瓶内，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。
1.4.2 制备水凝胶[17] 称取3 g的壳聚糖，投入50 mL的醋酸溶液(0.1 mol/L)中，搅拌至壳聚糖完全溶解，配制60 mg/mL的壳聚糖溶液，过滤去除不溶物后静置，置于4 ℃冰箱保存；称取14 g的甘油磷酸钠，投入25 mL去离子水中，配制560 mg/mL的甘油磷酸钠溶液，过滤后置于4 ℃冰箱保存；称取0.4 g的海藻酸钠，投入50 mL去离子水中，配制20 mg/mL的海藻酸钠溶液，过滤后置于4 ℃冰箱保存；称取0.15 g的葡萄糖酸钙，投入25 mL去离子水中，配制6 mg/mL的海藻酸钠溶液，过滤后置于4 ℃冰箱保存。
在4 ℃下将壳聚糖溶液滴加至甘油磷酸钠溶液中，二者体积比为1∶1，边滴加边搅拌，直至最终pH值为7.20±0.02。将该混合溶液与海藻酸钠溶液按照1∶1的体积比混合，置于冰浴中反应30 min；注入直径为10 mm的试管中，置于37 ℃恒温水浴锅中，数分钟后形成交联的甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶(记为GP/CS/SA)。在复合水凝胶进行交联反应前加入肝细胞生长因子，使其质量浓度为1 µg/mL，随后置于37 ℃恒温水浴锅中交联反应，制备甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶(记为GP/CS/SA/HGF)。
1.4.3 水凝胶材料的细胞相容性将心肌细胞悬液分别种植于经紫外线照射后的GP/CS/SA与GP/CS/SA/HGF水凝胶上，细胞接种密度为3×104个。培养3，7 d后，以PBS清洗水凝胶3次，在37 ℃下用活死染色液染色避光孵育30 min，激光共聚焦显微镜下倒置荧光拍摄水凝胶上的细胞图像。每种水凝胶制备3个样品，每个样品随机选取6个位点记录细胞总数量与活细胞数量。培养3，7 d后，加入CCK-8试剂孵育2 h，在450 nm处检测吸光度值，每组水凝胶6复孔。
1.4.4 水凝胶的体外生长因子释放将GP/CS/SA/HGF水凝胶平铺于96孔板内，每孔100 µL，每孔加入150 µL的PBS，在37 ℃条件下置于摇床中振荡，振荡速率为75 r/min，设置相应的采样时间点，每孔吸取100 µL的PBS，离心后取上清液，检测吸光度值，计算生长因子累计释放率。每次取样后再充新鲜的100 µL PBS。
1.4.5 建立大鼠心肌梗死模型与实验分组干预取3月龄雄性SD大鼠54只，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，剔除左侧胸部毛发，将大鼠仰卧位固定于手术台上，消毒术区皮肤，使用镊子牵拉出大鼠舌头，将气管插管置入生门并与小动物呼吸机连接；连接心电图。定位左侧第四肋间，沿肋骨横向剪开皮肤，暴露左心耳与左心室，靠近左心耳下缘处用缝合线结扎冠状动脉左前降分支，观察到结扎区心脏表面变苍白、心电图ST段抬高，说明模型制备成功。
造模30 min后，将造模成功的54只大鼠采用随机数字表法分为3组，每组18只，未治疗组于心肌梗死边缘分多点注射PBS，总注射量为100 µL；无生长因子水凝胶组于心肌梗死边缘分多点注射GP/CS/SA水凝胶，总注射量为100 µL；载生长因子水凝胶组心肌梗死边缘分多点注射GP/CS/SA/HGF水凝胶，总注射量为100 µL。逐层缝合，关闭呼吸机。待大鼠自主呼吸稳定时，将其置于电热毯上保暖，直至大鼠苏醒。
1.4.6 心功能检测造模后第7，14，35天，麻醉后利用超声行动测试仪检测心功能参数，包括左室射血分数、左室短轴缩短率、舒张末期左室容积及收缩末期左室容积。均测量3个连续心动周期的平均值。
1.4.7 心肌组织学分析造模后第35天，心功能检测结束后，麻醉处死大鼠，取心肌梗死区及周围组织，置入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，修块后常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，组织切片机切片，片厚5 µm，进行苏木精-伊红染色与Masson染色，观察心肌病理损伤与纤维化程度。对于Masson染色，利用Image plus 6.0图像分析软件分析各组大鼠梗死心肌瘢痕长度比值与心室厚度。
1.4.8 心肌细胞凋亡观察将切片以PBS浸泡10 min，加入50 µL的Tunel反应混合液，37 ℃避光孵育60 min，以PBS清洗3次，晾干后将含DAPI的封固剂滴加到切片上，盖上玻片，封固后荧光显微镜下观察。
1.4.9 微血管密度观察将切片以PBS浸泡10 min，放入湿盒中以20%胎牛血清室温孵育30 min，弃血清，加入α-平滑肌肌动蛋白(1∶200)一抗4 ℃孵育过夜，取出湿盒，以PBS清洗3次，在湿盒中加入体积分数20%胎牛血清室温孵育15 min，弃血清，加入荧光二抗室温孵育60 min，取出切片，以PBS清洗3次，晾干后将含DAPI的封固剂滴到切片上，盖上玻片，封固后荧光显微镜下观察。
1.5 主要观察指标各组大鼠心功能、心肌组织学、心肌细胞凋亡与微血管密度观察结果。
1.6 统计学分析实验所得的数据结果全部通过SPSS(SPSS 20.0，SPSS Inc.，美国)软件进行数据分析，均以x±s表示。采用one-way ANOVA进行不同组之间的比较。检验标准设为 α=0.05，P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经郑州大学第五附属医院生物统计学专家审核。

讨论

水凝胶材料具有良好的组织相容性、可塑性及能人为操作的优点，为一种新型的生物医学可注射支架材料，可携载细胞、药物与细胞因子等对心肌梗死进行有的放矢的治疗[18-20]。用于制备水凝胶的材料分为天然高分子材料与合成高分子材料，天然高分子材料主要有壳聚糖、胶原、明胶、透明质酸盐、纤维蛋白与藻酸盐等，合成高分子材料主要有丙烯酸、聚乙烯醇、甲基丙烯酸羟乙酯与聚丙烯酸等。海藻酸钠是一种带有负电荷的天然多糖，具有良好的生物相容性且在二价离子作用下可形成水凝胶，该水凝胶是第一种进入临床试验治疗心肌梗死的材料[21-22]；但其单独应用存在以下不足：因亲水性过强不能与细胞发生相互作用，水凝胶中的Ca2+容易与环境中的单价离子发生离子交换，使得支架的强度不稳定。壳聚糖是一种带有负电荷的碱性多糖，有一定的疏水性与良好的组织相容性，通过加入多元醇或多元醛(如甘油磷酸钠溶液)可使其在体温下通过氢键等相互作用形成凝胶[23]，但其单独应用存在强度低、降解过快的问题。海藻酸钠与壳聚糖复合水凝胶可明显改善单一成分水凝胶的降解性能与力学强度，目前该复合水凝胶材料已被广泛应用于骨组织工程中[24-25]，将其应用于心肌组织工程方面的报道较少见。首先，此次实验检测了海藻酸钠与壳聚糖复合水凝胶对心肌细胞的生物相容性，活死染色与CCK-8检测结果显示，心肌细胞可在海藻酸钠与壳聚糖复合水凝胶良好地生长与黏附，证明该复合水凝胶的三维网络结构为心肌细胞生长提供了有利的微环境；生长因子水凝胶中的细细胞生长与活力更佳，分析原因可能为肝细胞生长因子为心肌细胞的生长与增殖提供了营养支持，进一步改善了心肌细胞生长的微环境，为将其应用于动物体内实验打下了基础。
GHOLAMI等[26]制备了负载促红细胞生成素的壳聚糖/海藻酸盐水凝胶，体外释药实验表明该水凝胶具有促红细胞生成素的缓释和控释特性，将其用于实验性脊髓损伤中取得了良好效果。此次实验结果显示，甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子复合水凝胶可持续释放肝细胞生长因子达42 d之久，再次证明海藻酸钠与壳聚糖复合水凝胶是细胞因子的良好载体。
在急性心肌梗死患者血液中可检测到肝细胞生长因子分泌增加，这可能是心肌损伤的结果。有研究证明，肝细胞生长因子是心肌梗死后自我修复所必需的，如果用中和抗体阻断内源性肝细胞生长因子的活性，心肌梗死面积扩大且心肌细胞死亡增加[27-28]。心肌梗死后将发生心肌坏死(心肌梗死后即开始)、心肌纤维化(心肌梗死后3-14 d)与心室慢性重构(心肌梗死14 d后)等一系列病理变化。研究证明，心肌梗死后注射水凝胶可通过增加心室壁厚度改善心功能[29]。心肌梗死后因缺血导致大量心肌细胞凋亡，而肝细胞生长因子具有抗细胞凋亡、增加细胞保护作用，在早期注射水凝胶可尽早地释放肝细胞生长因子促进心肌细胞的存活，减少心肌细胞的坏死，因此本实验选择在心肌梗死后30 min即注射水凝胶。此次实验中，相较于未进行治疗组，注射水凝胶两组心肌梗死大鼠的心功能逐渐改善，作者认为是注射的水凝胶增加了心肌厚度并分担机械应力，支持左心室壁，进而达到延缓左心室重塑的目的。对比两水凝胶组，载生长因子水凝胶组心功能改善作用更显著，作者认为是水凝胶作为肝细胞生长因子的载体延长其作用时间，同时又提供了较好的力学支持与细胞活性保护作用。另外，肝细胞生长因子还是一种强大的血管生长因子与抗纤维化因子，其在内皮细胞中的促有丝分裂作用强于血管内皮生长因子与成纤维细胞生长因子，并且可预防心肌梗死中的纤维化反应[30]。血管新生增多是提供心肌细胞能量与营养供给的保障，更是改善组织再生微环境的重要因素。肝细胞生长因子可通过激活MEK/Erk1，2、p38MAPK和PI3K/Akt途径保护心脏细胞免受氧化应激诱导的凋亡[31]。有研究显示，肝细胞生长因子的抗纤维化作用是通过抑制转化生长因子β的产生类介导的[32]。此次实验结果显示，在心肌梗死大鼠模型中，甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶可通过抑制心肌细胞凋亡、抑制纤维化、促进梗死区域血管新生来显著延缓心室重构，改善心功能。当肝细胞生长因子作用于心肌细胞后，一方面，由于缺血缺氧造成的持续的心肌细胞凋亡被抑制；另一方面，梗死区域的新生血管增多；再者，肝细胞生长因子发挥了强大的抗纤维化作用，该三方面协同削弱梗死后的心肌重塑过程，抑制瘢痕组织形成，从而改善梗死后的心功能。
综合以上实验结果，将甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶注射于心肌梗死部位后，可持续缓慢地释放肝细胞生长因子，进而抑制心肌细胞凋亡及心肌纤维化、促进血管新生，延缓左心室重塑，达到改善心功能的目的。实验仅从组织学水平观察了甘油磷酸钠/壳聚糖/海藻酸钠/肝细胞生长因子水凝胶对心肌梗死的治疗效果，未来应在心肌细胞基因水平进行干预研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载肝细胞生长因子水凝胶对心肌梗死组织区域的作用

Effects of hydrogels loaded with hepatocyte growth factor on myocardial infarction

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