镀膜工艺结合3D打印制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征及成骨能力

doi:10.12307/2023.176

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (16): 2480-2487.doi: 10.12307/2023.176

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

镀膜工艺结合3D打印制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征及成骨能力

薛鹏1，杜斌1，刘锌1，孙光权1，程童飞2 ，陈浩1，何帅1

1南京中医药大学附属医院，江苏省南京市 210029；2南京理工大学化工学院，江苏省南京市 210094

收稿日期:2022-04-07 接受日期:2022-05-24 出版日期:2023-06-08 发布日期:2022-11-10
通讯作者: 杜斌，博士，教授，主任中医师，博士生导师，南京中医药大学附属医院，江苏省南京市 210029
作者简介:薛鹏，男，1992年生，江苏省张家港市人，汉族，南京中医药大学附属医院·江苏省中医院在读博士，主要从事中医骨伤科学工作。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82074471)，项目负责人：杜斌；江苏省卫生健康委科研项目(NK2019027)，项目负责人：杜斌；江苏省研究生实践创新计划项目(SJCX22_0769)，项目负责人：薛鹏

Characterization and osteogenic ability of Mg-F membrane/icariin membrane/beta-tricalcium phosphate scaffolds fabricated by coating process combined with 3D printing

Xue Peng1, Du Bin1, Liu Xin1, Sun Guangquan1, Cheng Tongfei2, Chen Hao1, He Shuai1

1Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; 2Institute of Chemical Industry, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, Jiangsu Province, China

Received:2022-04-07 Accepted:2022-05-24 Online:2023-06-08 Published:2022-11-10
Contact: Du Bin, MD, Professor, Chief TCM physician, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Xue Peng, Doctoral candidate, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82074471 (to DB); Jiangsu Provincial Health and Health Commission Scientific Research Project, No. NK2019027 (to DB); Jiangsu Province Postgraduate Practice Innovation Program, No. SJCX22_0769 (to XP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨组织工程支架：常用于骨修复，采用磷酸钙水泥、羟基磷灰石、磷酸三钙等为原料制备，可负载生长因子、细胞、蛋白等生物活性物质，具有良好的生物相容性。
膜缓释系统：是近年骨组织工程领域一种具有很大应用潜力的缓释系统，能实现药物的持续释放，延长药物治疗时间窗。

背景：修饰生长因子的骨组织工程支架在骨修复材料中具有广阔的应用前景，但生长因子释放过快导致复合支架仅能在早期促进骨修复，镀膜工艺为解决该问题提供了新思路。
目的：制备Mg-F膜/淫羊藿素/β-磷酸三钙支架，表征该支架的生物学特性。
方法：应用3D打印技术制备β-磷酸三钙支架，通过低能电子束沉积技术制备淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，再通过脉冲激光沉积技术制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，检测支架的微观结构、孔隙直径、孔隙率、丝径、抗压强度及元素组成，并分析淫羊藿素的结合力和缓释性能。将兔骨髓间充质干细胞分别与β-磷酸三钙支架、淫羊藿素/β-磷酸三钙支架与Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架浸提液共培养，利用CCK8法检测细胞增殖；将兔骨髓间充质干细胞分别与上述3种支架共培养，加入成骨诱导培养基，利用茜素红染色观察成骨分化能力。
结果与结论：①扫描电镜下可见，β-磷酸三钙支架结构较为规则，孔隙连通率好；淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架表面有较为致密的淫羊藿素膜覆盖原微观孔隙；Mg-F膜在淫羊藿素膜表面沉积，留下较为粗糙、疏松的表面，存在微观孔隙；3种支架的孔隙直径、孔隙率、丝径、抗压强度比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；②Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的淫羊藿素结合力优于淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架(P < 0.05)，且淫羊藿素缓释更持久；③CCK8检测结果显示，3种支架浸提液不影响骨髓间充质干细胞的生长；茜素红染色显示，成骨诱导21 d时，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架组和淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架架组钙结节数及钙结节成熟度优于β-磷酸三钙支架组；④结果表明，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架具有良好的细胞相容性、促成骨能力、药物结合力及缓释性能。
https://orcid.org/0000-0001-6569-4865(薛鹏)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 脉冲激光沉积, 低能电子束沉积, 缓释膜, β-磷酸三钙, 骨组织工程支架, 淫羊藿素

Abstract: BACKGROUND: Bone tissue engineering scaffolds with modified growth factors have promising applications in bone repair materials, but the rapid release of growth factors leads to composite scaffolds that can promote bone repair only at an early stage, and the coating process provides a new idea to solve this problem.
OBJECTIVE: To prepare Mg-F membrane/icaritin/β-tricalcium phosphate scaffold to characterize the biological properties of the new scaffold.
METHODS: The β-tricalcium phosphate scaffold was prepared by applying 3D printing technology, and the icaritin/β-tricalcium phosphate scaffold was prepared by low energy electron beam deposition technology. Mg-F membrane/icaritin/β-tricalcium phosphate scaffolds were fabricated by pulsed laser deposition technology. The microstructure, pore diameter, porosity, wire diameter, compressive strength, and elemental composition of the scaffolds were examined, and the icaritin binding force and slow-release properties were analyzed. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with β-tricalcium phosphate scaffold, icariin/β-tricalcium phosphate scaffold and Mg-F membrane/icariin membrane/β-tricalcium phosphate scaffold extract. Cell proliferation was measured by CCK8 assay. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the above three scaffolds, separately, and osteogenic induction medium was added, and the osteogenic differentiation ability was observed by alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that the structure of β-tricalcium phosphate scaffold was relatively regular and the pore connectivity rate was good; the surface of the icariin membrane/β-tricalcium phosphate scaffold had relatively dense icariin membrane covering the original microscopic pores; Mg-F membrane was deposited on the surface of the icariin membrane, leaving a relatively rough and loose surface with microscopic pores. The differences in pore diameter, porosity, wire diameter, and compressive strength of three kinds of scaffolds were not statistically significant (P > 0.05). (2) The icariin binding force of Mg-F membrane /icariin membrane /β-tricalcium phosphate scaffold was better than that of icariin membrane /β-tricalcium phosphate scaffold (P < 0.05), and slow release of icariin lasted longer. (3) The results of CCK8 assay showed that the three kinds of scaffold extracts did not affect the growth of bone marrow mesenchymal stem cells. Alizarin red staining showed that at 21 days of osteogenic induction, the number of calcium nodules and the maturity of calcium nodules in the Mg-F membrane/icariin membrane/β-tricalcium phosphate scaffold group and the icariin membrane/β-tricalcium phosphate scaffold group were better than those in the β-tricalcium phosphate scaffold group. (4) The results show that the Mg-F membrane/ icariin membrane / β-tricalcium phosphate scaffold has good cytocompatibility, osteogenic ability, drug binding and sustained release properties.

Key words: pulsed laser deposition, low energy electron beam, sustained-release membrane, β-tricalcium phosphate, bone tissue engineering scaffold, icaritin

中图分类号:

薛鹏, 杜斌, 刘锌, 孙光权, 程童飞, 陈浩, 何帅. 镀膜工艺结合3D打印制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征及成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(16): 2480-2487.

Xue Peng, Du Bin, Liu Xin, Sun Guangquan, Cheng Tongfei, Chen Hao, He Shuai. Characterization and osteogenic ability of Mg-F membrane/icariin membrane/beta-tricalcium phosphate scaffolds fabricated by coating process combined with 3D printing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(16): 2480-2487.

图/表（结果） 12

2.1 各组支架的形貌结构 3D打印β-磷酸三钙支架结构较为规则，孔隙连通率好，孔隙大小为300-400 μm，见图1A，B；淫羊藿素膜为淡黄色薄膜，Mg-F膜为黄色膜，见图1C。

β-磷酸三钙支架表面见较多微观微孔，见图2A；淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架表面可见较为致密的淫羊藿素膜覆盖原微观孔隙，见图2B；Mg-F膜在淫羊藿素膜表面沉积，留下较为粗糙、疏松的表面，存在微观孔隙，见图2C。

2.2 各组支架的孔隙率、孔隙体积、丝径量化扫描图显示3种支架宏观孔隙较为均一，孔隙畅通，镀膜前后未见明显差别，见图3A-C。相较于淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架、β-磷酸三钙支架而言，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架孔隙直径和孔隙率稍降低、丝径稍增加，但差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3D-F。表明镀膜后镀层厚度会影响支架相应结构参数，但不会导致统计学意义的差异。

2.3 各组支架的抗压强度 3种支架的轴向抗压强度均超过了松质骨的抗压强度，整体抗压性能优异，任意支架的轴向抗压强度均高于侧向抗压强度(P < 0.05)，且镀膜后支架的轴向/侧向抗压强度均提高，尤其是Mg-F膜修饰支架后支架抗压强度有明显提升，但组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.4 淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的傅里叶红外分析结果在淫羊藿素粉末的傅里叶红外光谱中发现，酮羟基的特殊吸收峰在1 650.91 cm-1，1 599.49 cm-1区域是芳香环的吸收峰，芳香醚的吸收峰在1 308.89 cm-1，在1 300 cm-1处观察到了C-O拉伸振动的耦合，酚羟基的弯曲振动为1 251.87 cm-1，叔醇中羟基的特征吸收峰为1 156.92 cm-1，在3 467.54 cm-1和3 298.32 cm-1处的峰值为O-H拉伸振动，在2 967.96 cm-1处观察到C-H的拉伸振动，见图5。一般羟基吸收峰出现的地方频率高(大于3 000 cm-1)，所以大于3 000 cm-1的吸收峰通常表明分子中存在羟基。

在淫羊藿素膜的傅里叶红外光谱中发现，酮羟基的吸收峰为1 649.50 cm-1，芳香环的区域吸收峰1 602.49 cm-1，酚羟基的弯曲振动为1 258.48 cm-1，叔醇羟基的特征吸收峰在1 159.04 cm-1处，O-H在3 466.67 cm-1和3 297.68 cm-1处有明显的拉伸振动；在2966.55 cm-1处观察到C-H的拉伸振动，见图5。结果表明淫羊藿素膜和淫羊藿素粉末的傅里叶红外光谱是相同的，在傅里叶红外光谱中可以找到淫羊藿素的特殊官能团。傅里叶红外验证了低能电子束沉积法在β-磷酸三钙支架上制备的淫羊藿素膜与淫羊藿素粉末具备一样的化学结构，化学组成未发生改变，不影响生物活性。
2.5 各组支架的表面元素成分X射线光电子能谱分析见图6。

β-磷酸三钙以O、C、Ca、P元素为主，符合β-磷酸三钙支架打印材料的元素构成。通过低能电子束沉积法在普通支架表面沉积淫羊藿素膜后，支架上淫羊藿素膜的表面元素仍与原成分一样。淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架由于淫羊藿素膜的加入，元素构成比例发生变化，C、O元素显著增加，占绝大部分比例。这是由于此时支架表面绝大部分都被淫羊藿素膜覆盖所致，检测到部分Ca、P元素说明部分β-磷酸三钙支架表面局部未能沉积淫羊藿素所致，这可能与支架表面不光滑导致局部沉积淫羊藿素膜不均有关。同时表明淫羊藿素膜较为致密平滑，覆盖全面，这与扫描电镜下观察到淫羊藿素膜覆盖原支架微观孔隙的结果相符。通过淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的X射线光电子能谱窄谱可知，镀膜后该支架表面淫羊藿素膜C1s的复合峰可以拟合到3个特征峰，这3特征峰对应于脂肪族在284.87 eV处的C-C键，286.56 eV应该对应于C-O，287.64 eV对应于C=O。淫羊藿素膜O1s的复合峰元素分别在531.58 eV对应于C=O，532.90 eV处对应-OH。通过拟合得到的特征峰与文献报道的淫羊藿素本身结构相对应[19]。这进一步表明，通过低能电子束沉积镀膜技术在支架上制备的淫羊藿素膜保留了淫羊藿素化学结构。
由于Mg-F为无机物，需X射线光电子能谱分析镀膜后Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架表面元素。Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的X射线光电子能谱全谱图显示，该支架含有O、Mg、Ca、F、P等元素，Mg与F元素的出现表明脉冲激光沉积镀膜后支架上Mg-F缓释膜的存在。而镀膜后仍存在其他元素也表明Mg-F膜是一层结构疏松的结构，未完全覆盖原支架，在支架表面留下了孔隙利于淫羊藿素释放，这与扫描电镜下观察到粗糙、疏松、有孔隙的Mg-F膜结果相符。
2.6 载药支架的淫羊藿素结合力及体外释放曲线 Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的淫羊藿素结合力显著优于淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架(P < 0.05)，见图7A。支架的淫羊藿素释放曲线显示：淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架在21 d时淫羊藿素累积释放量约到总量的50.77%，在经历过一个明显的突释阶段后，释放曲线逐渐趋缓，30 d时累积释放量达到约60.92%，且趋于平稳；相较于淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架在各个时间点的淫羊藿素释放较为缓慢，释放曲线平滑近似控释效果，直至60 d时释放量约达到57.12%，预计至90 d时仍有约30%的药物尚未释放，显著延长了淫羊藿素的中晚期释放，见图7B。

2.7 兔骨髓间充质干细胞的提取及培养 P0代细胞夹杂着大量形状不一的杂细胞，见图8A；通过贴壁筛选法，P1代细胞以梭形贴壁细胞为主，但可见较多杂细胞，见图8B。P2代细胞内杂细胞明显减少，细胞较规则，见图8C。P3代细胞贴壁良好，呈鱼群状、梭形排列，呈现典型的间充质干细胞形态，见图8D。图8E为分离得到的单核细胞层。

14 d的油红染色与28 d的茜素红染色结果显示，制备的细胞具有成脂分化与成骨分化的能力，见图9。

2.8 各组支架的细胞相容性 4组细胞的A450 nm值均随时间推移而增长，与空白对照组相比，3个支架组A450 nm值无明显变化，见图10，提示3个支架浸提液中的细胞生长情况良好，支架无细胞毒性。

2.9 各组的支架体外促成骨分化能力成骨诱导7 d时，3组支架的茜素红染色显示均有钙结节形成，但淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架组更多，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架组次之，依据淫羊藿素缓释曲线可知，这与淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架组淫羊藿素膜的早期释放较多有关；当诱导进行到21 d时，茜素红染色显示，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙组和淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架组钙结节数及钙结节成熟度明显优于β-磷酸三钙支架组，见图11。定量分析结果示，成骨诱导第7天时，淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架体外促成骨能力最优；成骨诱导第21天时，淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架及Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架体外促成骨能力已无差异，见图12。

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引言

股骨头坏死是一种骨科较常见的髋关节疾病，易导致股骨头永久畸形及髋关节残疾[1-2]，该疾病引起股骨头微循环受损，由于高压、缺氧和生长因子水平降低，导致血液供应和新骨形成障碍，若未采取保髋措施则最终会发生股骨头塌陷[3-4]。目前髓芯减压联合腓骨棒支撑术被认为是一种有效的保髋术式[5-6]。腓骨棒能提供力学支撑作用，起到爬行替代作用，但来源有限[7-8]。因此，开发合适的骨修复材料一直是保髋领域的研究热点[9]。目前在支架上负载生长因子促进骨修复是一种常用办法，镀膜工艺的发展为组织工程支架上负载生长因子提供了新思路。
淫羊藿素是淫羊藿苷的水解产物，属于黄酮类化合物，文献报道淫羊藿素有类似于雌激素的化学结构，具有与淫羊藿相近的成骨诱导作用[10- 11]。研究表明，淫羊藿素可通过BMP/RunX2/OSX信号通路上调骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白9的表达，调控下游成骨基因RunX2及OSX的活性，最终促进间充质干细胞的成骨分化[12]。镁(Mg)主要存在于人体骨骼中，是骨生长的必须元素，镁离子可以促进间充质干细胞的增殖和成骨分化，并且增强人体骨密度及力学性能[13]。
研究表明，镁离子可通过OPG/RANKL/RANK、PI3K/Akt及Wnt信号通路等调节骨代谢[14]，现阶段基于镁的新型骨修复材料正在不断被开发。氟(F)是骨骼中的一种基本元素，是影响骨形成的非激素因素，对骨形成有双向影响[15]。同时，氟可以刺激间充质干细胞成骨分化、促进细胞成熟和矿化、提高骨碱性磷酸酶和骨钙素的表达，并增加骨强度。此外，氟可促进羟基磷灰石成核及磷灰石在骨基质的沉积，增强骨的力学性能[16-17]。
此次实验使用的镀膜工艺是低能电子束沉积技术和脉冲激光沉积技术。低能电子束沉积技术制备的薄膜具有简单、可控、便捷、无污染的特点[18]，该技术已被证实可有效保护材料的原始结构不受破坏，例如聚乳酸、盐酸环丙沙星、诺氟沙星等[19]。脉冲激光沉积技术对靶材的种类没有限制，因此被广泛用于难熔材料和多组分薄膜的制备[18]。研究表明脉冲激光沉积技术也开始被用来制备缓释涂层，该技术制备的镁-羟基磷灰石膜覆盖环丙沙星药物可以实现环丙沙星的缓释，增强中晚期的药物释放[20]。综合淫羊藿素、Mg和F的物质特性以及两种镀膜技术的优缺点，此次实验采用低能电子束沉积技术法制备淫羊藿素膜，脉冲激光沉积法制备Mg-F膜。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计工艺研究及对比观察实验，组间比较进行方差分析(ANOVA)与t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年1-7月在南京理工大学化工实验室、南京中医药大学附属医院中心实验室、南京中医药大学附属医院实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料及仪器淫羊藿素(上海源叶公司)；β-磷酸三钙(杭州捷诺飞公司)；Mg粉末、CaF2粉末(国药公司)；扫描电子显微镜Quanta FEG250型(美国FEI公司)；倒置相差显微镜CKX41型(日本奥林巴斯公司)；高效液相色谱仪Agilent1200型(美国安捷伦公司)；X射线光电子能谱仪PHIQuanteraⅡ型(日本纳米分析仪器公司)；傅里叶变换红外光谱仪IS-10 型(赛默飞世尔公司)；电子万能试验机 UTM4102S型(深圳市新三思检测公司)；全自动酶标仪ELX-800(美国bioTek公司)；低能电子束沉积设备、激光电子束沉积设备(南京理工大学)；生物3D打印机、Regenovo Bio-Architect WS-X(杭州捷诺飞公司)；恒温培育箱 (DNP-9022，上海精宏公司)；α-MEM(以色列Biological Industries公司)；胎牛血清(浙江天杭生物公司)；双抗(美国Gibco公司)；淋巴细胞提取液Ficoll(美国Sigma公司)；地塞米松注射液(国药公司)；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(上海源叶公司)；茜素红染液，油红O染液(北京索莱宝公司)；成脂分化诱导液(塞业生物公司)。
1.3.2 实验动物 2月龄新西兰白兔2只，清洁级，体质量2.0-3.0 kg，用于提取兔骨髓间充质干细胞，采购于南京莱芙动物中心，许可证号：SCXK(苏)2019-0005，饲养于南京中医药大学附属医院实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2017-0068。实验方案已通过南京中医药大学附属医院伦理委员会审查，批件号：2021 DW-11-02，实验全程遵循实验动物使用及关怀指南。
1.4 实验方法
1.4.1 β-磷酸三钙支架的制备参照本课题组前期方法制
备[21]，步骤简述如下：用Solidworks建模软件进行三维支架模型的设计标准外观，设计为边长3.5 mm立方体。配制打印浆料，使用3D打印机进行增料打印并进行成型操作，完成半成品模型。将此模型置于真空干燥箱中干燥后行升温烧结，即可得到3D打印β-磷酸三钙多孔支架成品β-磷酸三钙支架。
1.4.2 淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的制备低能辅助电子束沉积设备工作参数如下：把9个β-磷酸三钙支架按3×3排列为一个组合面，对该组合面进行镀膜(支架共6个面，因此共需镀膜6次，下同)，工作电流缓慢调节至(6.5±0.1) A，再逐渐调节工作电压控制(0.70±0.10) kV，启动电子束，当真空度显示在1×10-2 Pa以上时，可通过观察窗看到在淫羊藿素靶材和β-磷酸三钙支架基底之间有等离子态的物质由靶材向基底转移，说明在基底上开始沉积薄膜，同时要控制束流不超过100 mA，以免过载。在镀膜过程中需在真空室内确保沉积过程连续稳定，当靶材消耗完毕时，沉积结束，将电流和电压缓慢归零。此次实验每个组合面选用10 mg淫羊藿素作为靶材进行沉积[19]，支架6个面全部镀膜后制备成淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架。
1.4.3 Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的制备医用级Mg粉末、CaF2粉末按1∶1的质量比混合，经机械研磨、压片等预处理后，放入真空沉积室中，使用脉冲激光沉积技术气化沉积。运用旋转悬吊模具固定淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架于靶标位置，镀膜过程中保持靶材匀速旋转，旋转速度为10 000 r/min，以免激光长时间照射靶材的同一位置，导致靶材变性。激光气化聚焦靶材反复沉积，时间持续60 min，在淫羊藿素支架表面沉积Mg-F膜，以制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架。
1.4.4 材料表征的测试
支架的形貌观察：将3种支架经冷冻干燥后喷金处理，即可得支架的孔隙形貌及支架表面结晶情况，采用扫描电镜对支架表面微观形貌、膜形态结构进行观察。
支架的孔隙直径、孔隙率、丝径：支架的量化设备为Regenovo Bio-Architect WS-X，每组各取3个样品，通过Regenovo研发的设备配套软件将光学相干层析聚焦位置调整至样本内部，随后点击三维数据采集，即可自动地对样本进行C-scan扫描获取结果。
支架的抗压强度测定：每组各取6个样品，按照GB/T1041-2008压缩性能测定的规定，在23 ℃室温下，采用电子万能试验机按5 mm/s的实验速度进行抗压强度测试，获得3种支架抗压强度的平均值，单位MPa，并将3种支架进行对比。轴向抗压强度及侧向抗压强度各进行3次。
傅里叶红外分析：采用红外光谱仪研究支架表面物质结构和组成，参数设置如下：光谱分辨率为 4 cm-1，扫描次数为 32次，波数范围300-4 000 cm-1。
X射线光电子能谱分析：采用X射线光电子能谱仪，在Al Kα单色X射线、功率29.6 W、X射线束直径100 μm、通能280 eV、真空度≤5×10-9 Pa的条件下，对支架进行分析，定性支架表面元素组成和键合状态。
淫羊藿素结合力测试：淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架、Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，每种支架取3个样品，分别浸泡于去离子水中进行超声振荡(40 kHz，180 W)5 min，利用高效液相色谱法检测浸泡液体中淫羊藿素含量。色谱：ZorbaxSB-C18，流动相为乙腈-水(体积比1∶2)，流速0.5 mL/min，波长λ=210 nm。药物结合力与色谱结果呈负相关性。
淫羊藿素缓释性能测试：淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架、Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，每种支架随机取3个支架称质量，将其分别浸入放置含10 mL PBS的试管中，2 000 r/h的速度振荡，每3 d取10 mL PBS，2 000 r/min离心10 min，取上清，利用高效液相色谱法检测上清液内淫羊藿素的浓度，绘制淫羊藿素累积释放曲线进行对比。并增补10 mL PBS继续振荡，持续至第60天。
1.4.5 支架细胞毒性及成骨能力检测
兔骨髓间充质干细胞的提取及培养：使用1%戊巴比妥钠按3 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉，待兔角膜反射消失后开始手术。兔髂嵴处备皮；切口1 cm暴露髂嵴，克氏针钻孔直达髓腔；含肝素钠针筒吸取骨髓5 mL；将5 mL α-MEM与骨髓混匀稀释，静置，吸去悬浮脂肪层后吹打制成细胞悬液；将淋巴细胞分离液5 mL与细胞悬液5 mL依次加入离心管，1 000 r/min离心5 min后，可见0.5-1.0 mm薄层乳糜状单核细胞层；吸取单核细胞层约1 mL制成细胞悬液；使用完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)重悬细胞并接种于培养皿，镜下观察细胞形态，标记为P0并置于培养箱，每2 d换液一次。镜下细胞达70%-80%汇合时传代，取P3代细胞进行后续实验。P3代细胞根据文献进行成脂分化及成骨分化实验，验证提取细胞具备干细胞分化能力[22]。
支架浸提液的制备：据GBT16886.12-2005医疗器械生物学评价第12部分制备浸提液。3种支架，每种随机选取6个，PBS清洗、环氧乙烷灭菌后放于浸提容器内。浸提介质为完全培养基，浸提比例为0.2 g/mL，在37 ℃细胞培养箱内浸提72 h。
CCK8检测：以含有体积分数10%支架浸提液的完全培养基为实验组，不含浸提液的完全培养基作为空白对照组。细胞培养同上。将P3兔骨髓间充质干细胞培养于96孔板，每孔种入4 000细胞，加入100 µL含支架浸提液或不含支架浸提液的培养基，设置6个复孔，每2 d换液一次。第1，3，5，7天各取出96孔板检测。每孔加入10 μL的CCK-8溶液孵育2 h，酶标仪检测450 nm吸光度值(A450 nm)，计算标准差，统计组间差异。实验重复3次。
茜素红染色：兔骨髓间充质干细胞以6×104/孔的细胞密度接种于6孔板中，置于培养箱中；待细胞70%-80%汇合时，将置入完全培养基内浸泡30 min的3种支架放入6孔板，加入成骨诱导培养基(完全培养基内加入50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松)，培养7，21 d，每2 d换液一次。预定时间点行茜素红染色：清洗、固定、茜素红染液染色4 h，倒置显微镜下观察，使用image J软件随机选取6个感兴趣区域进行阳性染色区定量分析。
1.5 主要观察指标 Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征结果。
1.6 统计学分析测量数据均使用SPSS 23.0进行统计分析，数据绘图由GraphPad Prism 8.43进行处理。数据表示为x±s。配对t检验用于组内比较。方差分析(ANOVA)用于多组间的比较，P < 0.05被认为差异有显著性意义。统计学方法已经由南京中医药大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

作者前期制备了负载淫羊藿苷微球的β-磷酸三钙支架，表征其物理特性后进行动物实验以验证其在股骨头坏死动物模型体内的骨修复效果[23]，证实载淫羊藿苷微球β-磷酸三钙支架相对于β-磷酸三钙支架显著促进了支架周围早期的骨修复，同时抑制了破骨细胞活性，并提高支架周围血管内皮生长因子的表达，有较好的促成骨及成血管作用。然而，该支架在30 d后随着淫羊藿苷释放完毕，支架骨修复能力显著下降。因此，此次实验将镀膜工艺与骨组织工程支架相结合，以设计可延长骨修复时间窗的支架。
实验通过傅里叶红外分析证明，淫羊藿素膜具备与淫羊藿素粉末一致的化学结构，这表明淫羊藿素在镀膜后分子结构未改变，不影响生物活性。同时，淫羊藿素镀膜前后X射线电子能谱结果显示仍存在与淫羊藿素粉末一致的特殊基团，也进一步验证了淫羊藿素膜物质结构未改变。由于Mg、F是无机物，无有机结构，因此通过X射线电子能谱进行Mg-F膜修饰支架后的表面成分分析，显示Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架表面有Mg、F元素，但其他元素仍存在，提示Mg-F膜并未将淫羊藿素膜完全覆盖，这与扫描电镜观察到Mg-F膜表面疏松的结构一致，表面的微观孔隙可利于淫羊藿素的释放。Mg-F膜的修饰有利于提高淫羊藿素与支架的结合力，Mg-F膜表面微孔结构使淫羊藿素需从微孔缓慢释放，这避免了淫羊藿素的早期突释，从而可以长久释放起到促成骨作用，这与淫羊藿素的释放曲线一致。Mg、F元素具备促间充质干细胞增殖及成骨分化的能力，且其皆有增强骨力学性能的效果[15，24]。研究表明淫羊藿素与Mg、F能通过不同信号通路及机制促进骨修复，因此，Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架能多机制、多通路协同增效促进成骨，实现更佳的骨修复效果[25-27]。在诱导7 d后进行茜素红染色，虽然Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架淫羊藿素释放少于淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架(约少15%)，但促成骨能力并未相差过多，这或许是因为Mg-F膜在降解过程中，Mg、F释放起到的促成骨作用实现了协同成骨作用。第21天，茜素红染色显示Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的钙结节数已与淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架无明显差异。根据缓释膜设计理念及文献依据[28]，Mg-F膜上的微孔会逐渐增加、扩大以促进淫羊藿素的释放。根据抗压实验得知，支架的轴向抗压能力达到了松质骨强度[29-30]，且任意支架轴向抗压能力均优于侧向，因此在进行支架植入手术时，负重区应力方向应与支架的轴向保持一致以发挥最佳支撑效果。支架抗压结果显示，支架的抗压强度随着镀膜层数的增加而提高，呈正相关，但无统计学意义。该结果表明镀膜可以提高支架的强度，稳定支架的结构，这应该取决于镀膜的成分及沉积时间，而抗压强度轴向强于侧向与支架设计和空间结构有关。通过量化支架的孔隙直径、孔隙率、丝径可知，镀膜不会引起相应参数的改变，因此支架仍具备原支架的设计功能及空间构型，利于骨小梁的爬行替代[31-32]。
采取多学科融合的方法设计并构建具备缓释功能的骨组织工程支架具备广阔前景[33-35]。如今，在支架表面修饰生长因子以促进骨修复正成为一种受欢迎的方法。其中，结合表面修饰的3D多孔β-磷酸三钙支架越来越受欢迎。β-磷酸三钙支架是一种具有骨传导性、生物安全性、生物相容性和生物降解性的骨替代材料。基于β-磷酸三钙支架的优点，加入促成骨因子将更有利于支架的促成骨作用。而镀膜技术可以非常方便地将生长因子负载于β-磷酸三钙支架上。实验制备了Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架及淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架，支架表征表明Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架具备优良的空间结构、力学性能和更佳的淫羊藿素缓释能力；细胞实验表明支架无细胞毒性，且具有良好的促成骨能力。综上，Mg-F膜能发挥缓释膜及促成骨两种作用，镀膜工艺修饰骨组织工程材料具备潜在应用价值。
此次实验的不足之处在于未进行不同剂量下淫羊藿素膜及Mg-F膜修饰支架的制备，因此对于Mg-F/ICT支架而言，该文所使用的镀膜参数或许并不是最优解；此外，支架体外实验证实其无细胞毒性，但缺乏在体安全性的研究，未进行支架的体内干预实验，因此后期拟在评估支架的体内生物安全性的同时进行分析体内成骨能力、明确Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架在股骨头坏死动物模型内的生物安全性及骨修复效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

镀膜工艺结合3D打印制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征及成骨能力

Characterization and osteogenic ability of Mg-F membrane/icariin membrane/beta-tricalcium phosphate scaffolds fabricated by coating process combined with 3D printing

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