SMAD4过表达干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白的表达

doi:10.12307/2024.413

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3648-3653.doi: 10.12307/2024.413

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SMAD4过表达干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白的表达

姚婷1，官蓉威2，高原1

成都医学院第二附属医院，1内分泌科，2骨科，四川省成都市 610000

收稿日期:2023-05-21 接受日期:2023-07-11 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 高原，副主任医师，成都医学院第二附属医院内分泌科，四川省成都市 610000
作者简介:姚婷，女，1978年生，四川省成都市人，汉族，2001年西南医科大学毕业，副主任医师，主要从事糖尿病、甲状腺疾病方面的研究。
基金资助:

Overexpression of SMAD4 interferes with the expression of iron metabolism related proteins in osteoporotic rats

Yao Ting1, Guan Rongwei2, Gao Yuan1

1Department of Endocrinology, 2Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2023-05-21 Accepted:2023-07-11 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Gao Yuan, Associate chief physician, Department of Endocrinology, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Yao Ting, Associate chief physician, Department of Endocrinology, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨质疏松：是一种慢性系统性骨病，以骨微细结构破坏、骨量下降为特征。骨质疏松患者骨脆性增加，容易发生骨折，以老年人和绝经后妇女居多。
铁调素：是铁代谢的主要调节者，通过调节铁代谢相关蛋白膜铁转运蛋白1、转铁蛋白受体1、二价金属离子转运体1等表达，调控铁的吸收、利用和释放，进而影响骨代谢。

背景：SMAD家族成员4(SMAD4)能够促进骨质疏松大鼠骨重建，然而SMAD4是否干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白表达尚不清楚。

目的：探究SMAD4过表达对骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白表达的影响。
方法：大鼠随机分为假手术组、卵巢摘除组、转染对照组和SMAD4过表达组，后3组切除卵巢建立骨质疏松大鼠模型，假手术组仅切除脂肪组织。1周后行股骨髓腔腺病毒注射，SMAD4过表达组和转染对照组分别注射过表达SMAD4基因的腺病毒及对照空载病毒，注射1个月后进行指标检测。显微CT、苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测骨质疏松大鼠骨形成和骨吸收情况；ELISA检测血清铁蛋白、铁调素水平；免疫组化染色检测股骨组织碱性磷酸酶、骨钙素、核因子κB受体激活因子配体、抗酒石酸酸性磷酸酶水平；RT-qPCR检测股骨组织SMAD4、铁调素、二价金属离子转运体1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA水平；Western blot检测股骨组织SMAD4、碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素、核因子κB受体激活因子配体、抗酒石酸酸性磷酸酶、β-胶原降解产物、铁调素、二价金属离子转运体1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1蛋白水平。

结果与结论：①假手术组大鼠股骨组织骨小梁完整，几乎未见破骨细胞；卵巢摘除组、转染对照组骨小梁稀疏，存在大量破骨细胞；SMAD4过表达组大鼠骨小梁增多，破骨细胞减少；②与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织SMAD4、碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素蛋白水平、血清和股骨组织铁调素水平明显降低，股骨组织核因子κB受体激活因子配体、抗酒石酸酸性磷酸酶、β-胶原降解产物蛋白水平、二价金属离子转运体1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA和蛋白水平明显升高(P < 0.05)；③与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织SMAD4、碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素蛋白水平、血清和股骨组织铁调素水平明显升高，股骨组织核因子κB受体激活因子配体、抗酒石酸酸性磷酸酶、β-胶原降解产物蛋白水平、二价金属离子转运体1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA和蛋白水平明显降低(P < 0.05)；④提示过表达SMAD4通过干预铁代谢相关蛋白表达促进骨质疏松大鼠骨重建。

https://orcid.org/0009-0006-8023-4879(姚婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: SMAD4, 过表达, 铁调素, 骨质疏松, 铁代谢相关蛋白

Abstract: BACKGROUND: SMAD family member 4 (SMAD4) can promote bone remodeling in osteoporotic rats, but it is unclear whether SMAD4 interferes with the expression of iron metabolism related proteins in osteoporotic rats.
OBJECTIVE: To explore the effect of SMAD4 overexpression on the expression of iron metabolism related proteins in osteoporotic rats.
METHODS: Rats were randomized into sham group, ovariectomy group, transfection control group and SMAD4 overexpression group. Animal models of osteoporosis were established in the latter three groups by ovariectomy, and only adipose tissue was removed in the sham group. One week later, adenovirus was injected into the femoral bone marrow cavity. SMAD4 overexpression group and transfection control group were injected with adenovirus overexpressing SMAD4 gene and control empty virus, respectively. Index detection was performed at 1 month after injection. Micro-CT, hematoxylin-eosin staining and tartrate resistant acid phosphatase staining were used to detect bone formation and bone resorption in osteoporotic rats. ELISA was used to detect serum ferritin and hepcidin levels. Immunohistochemical staining was used to detect alkaline phosphatase, osteocalcin, receptor activator for nuclear factor-κB ligand and tartrate resistant acid phosphatase levels in femoral tissue. RT-qPCR was used to detect SMAD4, hepcidin, divalent metal transporter 1, transferrin receptor1 and ferroportin1 mRNA levels in femoral tissue. Western blot was used to detect SMAD4, alkaline phosphatase, osteocalcin, osteoprotegerin, receptor activator for nuclear factor-κB ligand, tartrate resistant acid phosphatase, β-Crosslaps, hepcidin, divalent metal transporter 1, transferrin receptor 1, and ferroportin 1 protein levels.
RESULTS AND CONCLUSION: In the sham group, bone trabeculae in femur tissue were intact, and almost no osteoclasts were found. In the ovariectomy and transfection control groups, the bone trabeculae were sparse and a large number of osteoclasts were present. In the SMAD4 overexpression group, the number of bone trabeculae was increased and the number of osteoclasts was decreased. Compared with the sham group, the ovariectomy group showed a significant reduction in the protein expression of SMAD4, alkaline phosphatase, osteocalcin, and osteoprotegerin in femoral tissue and hepcidin levels in serum and femoral tissue, while receptor activator for nuclear factor-κB ligand, tartrate resistant acid phosphatase, β-Crosslaps protein levels, divalent metal transporter 1, transferrin receptor1, ferroportin1 mRNA and protein levels were significantly increased (P < 0.05). Compared with the transfection control group, the SMAD4 overexpression showed a significant increase in SMAD4, alkaline phosphatase, osteocalcin, and osteoprotegerin protein levels in femoral tissue and hepcidin levels in serum and femoral tissue, while the expressions of receptor activator for nuclear factor-κB ligand, tartrate resistant acid phosphatase, β-Crosslaps protein levels, divalent metal transporter 1, transferrin receptor1, and ferroportin 1 at mRNA and protein levels were significantly decreased (P < 0.05). To conclude, overexpression of SMAD4 promotes bone remodeling in osteoporotic rats by interfering with the expression of iron metabolism related proteins.

Key words: SMAD4, overexpression, hepcidin, osteoporosis, iron metabolism related proteins

中图分类号:

姚婷, 官蓉威, 高原. SMAD4过表达干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3648-3653.

Yao Ting, Guan Rongwei, Gao Yuan. Overexpression of SMAD4 interferes with the expression of iron metabolism related proteins in osteoporotic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3648-3653.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入实验的80只大鼠分为4组，均完成实验，全部进入结果分析。
2.2 过表达SMAD4对骨质疏松大鼠股骨组织骨重建的作用 RT-qPCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织SMAD4 mRNA和蛋白水平明显降低(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织SMAD4 mRNA和蛋白水平明显升高(P < 0.05)。见图1A，B。
显微CT扫描结果和骨形态学指标显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织骨密度明显降低，横断面可见明显骨髓空腔，骨小梁厚度、骨小梁数目和骨体积分数明显降低，骨小梁间距明显升高(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织骨密度明显升高，骨髓空腔明显减小，骨小梁厚度、骨小梁数目和骨体积分数明显降低，骨小梁间距明显降低(P < 0.05)。见图1C，D。苏木精-伊红染色和TRAP染色结果显示，假手术组大鼠股骨组织骨小梁完整，几乎未见破骨细胞；卵巢摘除组、转染对照组骨小梁稀疏、变薄，存在大量破骨细胞。与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织骨小梁增多、变厚，破骨细胞数量减少。见图1E，F。

2.3 过表达SMAD4对骨质疏松大鼠股骨组织骨形成标志物及骨吸收标志物表达的影响免疫组化染色结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织骨形成标志物碱性磷酸酶、骨钙素累积吸光度值明显降低，骨吸收标志物RANKL、TRAP累积吸光度值明显升高(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织碱性磷酸酶、骨钙素累积吸光度值明显升高，RANKL、TRAP累积吸光度值明显降低(P < 0.05)。见图2A。
同样Western blot结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织骨形成标志物碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素蛋白水平明显降低，骨吸收标志物RANKL、TRAP、β-胶原降解产物蛋白水平明显升高(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素和蛋白水平明显升高，RANKL、TRAP、β-胶原降解产物蛋白水平明显降低(P < 0.05)。见图2B。

2.4 过表达SMAD4对骨质疏松大鼠血清铁蛋白、铁调素和股骨组织铁代谢相关蛋白表达的影响 ELISA结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠血清铁蛋白水平明显升高，铁调素水平明显降低(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠血清铁蛋白水平明显降低，铁调素水平明显升高(P < 0.05)。见图3A。
RT-qPCR和Western blot检测结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除组大鼠股骨组织铁代谢相关蛋白铁调素mRNA和蛋白水平明显降低，DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA和蛋白水平明显升高(P < 0.05)；与转染对照组相比，SMAD4过表达组大鼠股骨组织铁调素mRNA和蛋白水平明显升高，DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA和蛋白水平明显降低(P < 0.05)。见图3B、C。

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引言

骨质疏松是一种全身性骨代谢异常的疾病，主要发病机制为骨微细结构破坏和骨量减少，常见于老年人和绝经后妇女人群中[1]。造成骨质疏松的因素众多，如不良生活习惯、老年人骨重建能力降低、雌激素缺乏引起的破骨细胞活性增加等，当骨形成小于骨吸收时，骨质疏松发生[2-3]。近年来研究显示，铁代谢紊乱与骨代谢疾病存在着密切联系，铁超载可能是引发骨质疏松的重要因素之一[4]。肝细胞分泌的铁调素(hepcidin)是铁代谢的主要调节者，其负责调控肠上皮细胞对铁的吸收以及将肝细胞和巨噬细胞中的铁释放到血液中[5]。铁调素通过调节铁代谢相关蛋白表达，调控铁的吸收、利用和释放，进而影响骨代谢[6]。当机体铁超载时，肝脏分泌铁调素增多，铁调素与膜铁转运蛋白1结合，导致膜铁转运蛋白1内化、降解，减少细胞内铁的释放，从而维持血液中的铁稳态[7]。铁调素也可通过抑制转铁蛋白受体1、二价金属离子转运体1(divalent metal transporter 1，DMT1)表达，减少铁聚积[8-9]。而膜铁转运蛋白1、转铁蛋白受体1、DMT1介导的铁摄取均能够促进破骨细胞的分化和骨吸收，进而导致骨量减少，引发骨质疏松[10]。SMAD家族成员4(SMAD family member 4，SMAD4)能够促进成骨分化，维持骨稳态，在骨形态发生中起重要作用[11]。研究发现miR-214通过抑制SMAD4表达抑制成骨细胞的增殖，进而促使骨质疏松发生[12]。针刺通过激活转化生长因子β1/SMAD4信号通路改善骨质疏松大鼠骨小梁微结构并增加骨量[13]。另外研究发现温肾益髓生血方通过抑制肝脏SMAD4、铁调素的表达改善肾性贫血大鼠的贫血情况[14]。山菠菜多糖通过抑制转化生长因子β1/SMAD4信号通路和铁调素的表达，改善长时间大强度运动大鼠铁缺乏状态[15]。然而SMAD4是否通过调控铁调素水平干预铁代谢相关蛋白表达影响骨质疏松尚无研究报道。因而，此次研究拟探究SMAD4过表达通过调控铁调素水平干预铁代谢相关蛋白表达对骨质疏松大鼠的影响，以期为铁代谢方向治疗骨质疏松提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析 (ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2020年7月至2022年5月在成都医学院第二附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 80只8周龄SPF级雌性SD大鼠，体质量为200-220 g，购买于四川大学实验动物中心，许可证号：SCXK (川)2018-026。于室温23-25 ℃、标准湿度55%-60%、光照/黑夜各12 h环境中饲养，饮水饮食正常，1周后实验。
实验方案经成都医学院第二附属医院动物实验伦理委员会批准(批准号：20200213)，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂和仪器过表达SMAD4基因的腺病毒及对照空载病毒(汉恒生物科技(上海)有限公司)；SMAD4、铁调素、DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；铁蛋白ELISA试剂盒(上海科艾博生物科技有限公司)；骨钙素、骨保护素、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)、核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)、β-胶原降解产物抗体(上海碧云天生物技术有限公司)。微型电钻(瑞士hamilton公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；显微CT扫描仪(德国Siemens公司)；蛋白电泳仪、荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)。
1.4 方法

1.4.1 骨质疏松大鼠模型制作与分组 80只大鼠按随机数字表法随机分为假手术组、卵巢摘除组、转染对照组和SMAD4过表达组，每组20只。后3组腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定后进行备皮、消毒。大鼠自耻骨2.0-3.0 cm纵向切开皮肤，分离筋膜，切除卵巢，术毕逐层缝合切口；假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织。1周后，卵巢切除大鼠股骨组织骨小梁减少，骨密度降低，横断面可见明显骨髓空腔，视为造模成功。

随后转染对照组和SMAD4过表达组大鼠进行股骨骨髓腔腺病毒注射。步骤如下，大鼠进行麻醉、固定、备皮、消毒，用微型电钻(直径0.5 mm)在股骨远部的髁间窝钻孔，使用微量注射器将33 G骨髓针全部插入股骨腔中，SMAD4过表达组和转染对照组大鼠分别注射5 μL过表达SMAD4基因的腺病毒及对照空载病毒(病毒滴度均为1012 TU/mL)，骨髓针停留10 min后缓慢拔出，并用骨蜡封口。实验过程未有大鼠死亡。注射1个月后取大鼠眼球血，随后腹腔注射氯胺酮(75 mg/kg)麻醉处死大鼠，取股骨组织备用。
1.4.2 显微CT扫描和重建转染1个月后处死大鼠，取股骨组织置于40 g/L多聚甲醛中固定，避光保存。显微CT对股骨进行扫描和重建，比较骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨小梁间距和骨体积分数等指标。
1.4.3 苏木精-伊红染色观察股骨组织骨形成将股骨组织用体积分数10%甲醛溶液4 ℃固定24 h后，锯取厚度约0.5 cm的骨片，再用体积分数10%甲醛溶液固定24 h，然后将骨组织置于乙二胺四乙酸脱钙剂中脱钙，每日更换新鲜脱钙液，直至组织软化为止，当探针能轻易刺破骨骼时表示脱钙完成。流水冲洗24 h，梯度乙醇充分脱水，用石蜡包埋，制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水，水洗，苏木精染色5 min，水洗，体积分数1%的盐酸乙醇分化，水洗，0.6%氨水返蓝，水洗，伊红染色3 min，二甲苯透明，中性胶封固，显微镜下观察股骨组织新骨形成情况。
1.4.4 TRAP染色观察股骨组织骨吸收石蜡切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，水洗，2.5%戊二醛固定，水洗，TRAP染色60 min，水洗，苏木精复染细胞核5 min，水洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性胶封固，显微镜下观察股骨组织破骨细胞染色情况。
1.4.5 ELISA检测血清铁蛋白、铁调素水平取大鼠眼球血，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，取上清，按照ELISA试剂盒操作说明进行抗原包被，加入样品和抗体，显色，终止反应，检测完成后绘制标准曲线，根据公式测定大鼠血清铁蛋白、铁调素水平。
1.4.6 免疫组化染色检测股骨组织碱性磷酸酶、骨钙素、RANKL、TRAP表达水平石蜡切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，高温抗原修复，体积分数3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加3%牛血清白蛋白室温封闭30 min，加入碱性磷酸酶、骨钙素、RANKL、TRAP一抗(1∶400)4 ℃孵育过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育1 h，滴加二氨基联苯胺显色液显色，自来水终止显色，苏木精复染细胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性胶封固，显微镜下观察染色情况并计算累积吸光度值。

1.4.7 RT-qPCR检测股骨组织SMAD4、铁调素、DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA表达水平取各组股骨组织，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒反转录为cDNA，使用SYBR Green法进行扩增，荧光定量PCR仪进行反应，反应条件：94 ℃预变性60 s后进行11个温度递减循环(94 ℃ 20 s，65-60 ℃ 40 s，每个循环递减0.5 ℃，72 ℃1.5 min)，随后进行29个恒温循环(94 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，2 ℃ 90 s)。以同一样本的GAPDH的Ct值作内参，使用2-ΔΔCt公式计算SMAD4、铁调素、DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1 mRNA相对水平。PCR引物序列见表1。

1.4.8 Western blot检测股骨组织SMAD4、碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素、RANKL、TRAP、β-胶原降解产物、铁调素、DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1蛋白水平取各组股骨组织，用预冷的生理盐水充分浸泡、蒸馏水冲洗以去除血液，将骨组织剪碎并称质量，用液氮研磨成粉末，100 mg骨组织加入200 μL蛋白提取液混匀，冰浴30 min，4 ℃离心15 min，上清即为骨组织总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，检测标准品和样品在A562 nm处的吸光度，根据标准曲线和样品体积计算样品蛋白浓度。各组取等量蛋白加入上样缓冲液加热，蛋白经电泳、转聚偏二氟乙烯膜后，5%脱脂奶粉中封闭2 h，分别加入SMAD4、碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素、RANKL、TRAP、β-胶原降解产物、铁调素、DMT1、转铁蛋白受体1、膜铁转运蛋白1一抗(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，含吐温-20的Tris盐酸缓冲液洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h，用增强型化学发光显色剂显色，凝胶成像仪拍照，IPP软件进行灰度分析，以同一样本的GAPDH为内参，计算比值求得上述蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①转染1个月后，显微CT、苏木精-伊红染色、TRAP染色观察股骨组织骨重建情况；②ELISA检测血清铁蛋白、铁调素水平；③免疫组化染色、RT-qPCR、Western blot检测股骨组织SMAD4、骨代谢、铁代谢相关蛋白mRNA和蛋白表达水平。
1.6 统计学分析用SPSS 16.0进行统计分析。所有计量数据均符合正态分布，以x±s表示，多组间计量数据的比较使用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经成都医学院第二附属医院生物统计学专家审核。

讨论

铁代谢异常与多种骨科疾病密切相关，其中铁超载是引发骨质疏松的重要因素之一[16]。当机体铁含量较多时，铁调素分泌减少，导致骨吸收增加，而骨形成被抑制；同时铁调素也能够阻止铁向细胞外排出，造成骨小梁体积和厚度减小，进而导致骨量减少[17-18]。SMAD4通过促进成骨分化，维持骨稳态。研究发现miR-125b通过抑制SMAD4表达，促使绝经后大鼠骨质疏松发生[19]。miR-664-3p通过抑制SMAD4表达，抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化，同时miR-664-3p转基因小鼠骨组织SMAD4水平降低，骨量减少[20]。另外研究发现SMAD通过激活铁调素表达改善铁过载引起的遗传性血色素沉着症和铁负荷性贫血[21]。姜黄素和黄芩素通过上调铁调素及SMAD4表达，减轻骨髓中的铁沉积[22]。然而SMAD4是否通过调控铁调素水平影响骨质疏松尚无研究报道。此次研究通过摘除卵巢建立骨质疏松大鼠模型，将过表达SMAD4基因的腺病毒注入大鼠股骨髓腔内，首次发现卵巢摘除大鼠骨组织SMAD4、铁调素水平较低，血清铁蛋白水平较高，而过表达SMAD4能够提高铁调素表达，降低血清铁蛋白水平，从而促进骨形成，并抑制骨吸收。推测可能是卵巢摘除大鼠由于体内雌激素缺乏导致机体铁超载，超载的铁通过芬顿反应产生大量活性氧，抑制成骨细胞的活性，进而减少骨质合成；同时促进破骨细胞分化、成熟及骨吸收，导致骨量减少[23-24]；而过表达SMAD4通过提高铁调素表达减轻铁超载，从而缓解骨质疏松。
铁调素是铁代谢的主要调节者，铁调素通过调节铁代谢相关蛋白表达调控铁的吸收、利用和释放，进而影响骨代谢[25]。当机体铁超载时，肝脏分泌铁调素增多，铁调素与膜铁转运蛋白1结合，导致膜铁转运蛋白1内化、降解，减少细胞内铁的释放[26]。同时铁调素也可通过抑制转铁蛋白受体1、DMT1表达，减少铁聚积[27]。碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素是反映骨形成的标志物，其中碱性磷酸酶、骨钙素是成骨分化早期标志物，直接反映成骨细胞的活性及成骨分化能力，而成骨细胞活性及功能是骨再生的必要条件[28]。RANKL、TRAP、β-胶原降解产物是反映骨吸收的标志物，其中RANKL能够促进破骨细胞的分化、成熟，并抑制其凋亡，而骨保护素能够抑制RANKL的功能，从而抑制破骨细胞分化[29]。研究发现老年女性骨质疏松患者血清铁调素水平降低，铁代谢水平升高，且铁调素、铁代谢水平与患者骨密度、骨折发生相关[30]。过表达铁调素能够降低卵巢摘除小鼠血清铁蛋白水平，抑制破骨细胞分化，从而改善小鼠骨质疏松症状[31]。此次研究首次发现，卵巢摘除大鼠铁代谢相关蛋白膜铁转运蛋白1、转铁蛋白受体1、DMT1水平升高，骨形成标志物碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素水平降低，骨吸收标志物RANKL、TRAP、β-胶原降解产物水平升高。推测原因可能是卵巢摘除大鼠铁调素水平降低，促进了铁转运蛋白1、转铁蛋白受体1、DMT1蛋白的表达，造成机体铁积聚，从而增强了破骨细胞活性和功能，并抑制了成骨细胞活性[32-33]；而过表达SMAD4能够抑制卵巢摘除大鼠铁代谢相关蛋白表达，进而抑制骨吸收，并促进骨形成。
综上所述，过表达SMAD4通过干预铁代谢相关蛋白表达促进骨质疏松大鼠骨重建。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

SMAD4过表达干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白的表达

Overexpression of SMAD4 interferes with the expression of iron metabolism related proteins in osteoporotic rats

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