载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶促进骨性关节炎骨缺损的修复

doi:10.12307/2024.363

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (10): 1568-1574.doi: 10.12307/2024.363

• 水凝胶材料Hydrogel materials • 上一篇下一篇

载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶促进骨性关节炎骨缺损的修复

苏坤阳，陈毕能，陈益樑，金少枫

中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院(泉州市海峡医院)中医康复科，福建省泉州市 362000

收稿日期:2023-04-04 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-04-08 发布日期:2023-08-19
通讯作者: 金少枫，主管治疗师，中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院(泉州市海峡医院)中医康复科，福建省泉州市362000
作者简介:苏坤阳，男，1987年生，福建省泉州市人，汉族，主管治疗师，主要从事骨科康复方向的研究。

Strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel promotes bone defect repair in osteoarthritis

Su Kunyang, Chen Bineng, Chen Yiliang, Jin Shaofeng

Department of Traditional Chinese Medicine Rehabilitation, 910 Hospital of Chinese People's Liberation Army Joint Logistics Support Force (Quanzhou Strait Hospital), Quanzhou 362000, Fujian Province, China

Received:2023-04-04 Accepted:2023-05-25 Online:2024-04-08 Published:2023-08-19
Contact: Jin Shaofeng, Supervisor therapist, Department of Traditional Chinese Medicine Rehabilitation, 910 Hospital of Chinese People's Liberation Army Joint Logistics Support Force (Quanzhou Strait Hospital), Quanzhou 362000, Fujian Province, China
About author:Su Kunyang, Supervisor therapist, Department of Traditional Chinese Medicine Rehabilitation, 910 Hospital of Chinese People's Liberation Army Joint Logistics Support Force (Quanzhou Strait Hospital), Quanzhou 362000, Fujian Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

雷奈酸锶：是一种具有抑制破骨、调控成骨作用的功能性药物。近年来的研究显示，雷奈酸锶可以促进软骨分化，从而调控软骨的修复，因此其在骨性关节炎的治疗中展现了巨大的潜力。
药物递送系统：是指通过将药物搭载于生物材料中来构建一种能够使药物在时空及剂量上在疾病部位特异性分布的体系，其可在疾病部位持续释放治疗药物，显著提高药物的生物利用度，减少毒副作用、用药次数，增强治疗效果。

背景：软骨退行性变和软骨下骨损伤是骨性关节炎的主要病理特征，根据这一病理特征进行局部调控将是骨性关节炎治疗的有前景改进方案。

目的：设计并研究一种可注射载雷奈酸锶药物递送系统，观察其在骨性关节炎局部促进软骨修复并改善软骨下骨结构的治疗效果。
方法：①体外实验：将雷奈酸锶搭载于海藻酸钠/胶原水凝胶基质中构建原位药物递送系统，表征该系统的体外缓释性能。将载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶(实验组)、海藻酸钠/胶原水凝胶(对照组)分别与骨髓间充质干细胞共培养，以单独培养的细胞为空白对照组，检测细胞增殖活性；在成软骨诱导分化后，分别进行番红O染色、阿利新蓝染色及RT-qPCR检测。将两种水凝胶分别与成骨细胞共培养，以单独培养的细胞为空白对照组，进行免疫荧光染色及RT-qPCR检测。②体内实验：取18只成年SD大鼠，通过内侧半月板切除的方法建立右后侧膝骨性关节炎模型，造模后1周，采用随机数字表法分3组处理：空白组不进行任何处理，对照组膝关节腔内注射海藻酸钠/胶原水凝胶，实验组右膝关节腔内注射载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶，每组6只。造模后第6周取材，分别进行Micro-CT扫描、苏木精-伊红染色、番红O染色及免疫荧光染色。

结果与结论：①体外实验：载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶具有疏松多孔的微观结构，可持续释放雷奈酸锶，至21 d时累计释放量(60.89±0.58)%。骨髓间充质干细胞活死染色显示，两种水凝胶均具有良好的细胞相容性。CCK-8检测显示，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可促进骨髓间充质干细胞的增殖；番红O染色、阿利新蓝染色、免疫荧光染色及RT-qPCR检测显示，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化。免疫荧光染色及RT-qPCR检测显示，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可通过增加骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值而降低骨吸收活性。②体内实验：Micro-CT扫描显示，与空白组、对照组比较，实验组大鼠膝关节软骨下骨骨体积分数与骨密度升高(P < 0.05，P < 0.01)。组织学染色显示，与空白组、对照组比较，实验组大鼠膝关节软骨损伤明显减轻，促进Ⅱ型胶原蛋白的表达、抑制基质金属蛋白酶2蛋白的表达(P < 0.05，P < 0.01)。③结果表明：载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶能促进骨性关节炎软骨缺损的修复、重建软骨和软骨下骨之间的复杂界面。

https://orcid.org/0009-0000-0346-401X(苏坤阳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨关节炎, 药物递送系统, 海藻酸钠/胶原水凝胶, 雷奈酸锶, 软骨下骨, 软骨修复

Abstract: BACKGROUND: Cartilage degeneration and subchondral bone damage are the main pathological features of osteoarthritis, and treatment based on this pathological feature will be a promising improvement for osteoarthritis.
OBJECTIVE: To design and study an annotated strontium ranelate-loaded drug delivery system and to observe its therapeutic effect on promoting cartilage repair and improving subchondral bone structure in osteoarthritis.
METHODS: (1) In vitro experiment: Strontium ranelate was loaded into sodium alginate/collagen hydrogel matrix to construct in situ drug delivery system, and the in vitro slow release performance of the system was characterized. Strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel (experimental group) and alginate sodium/collagen hydrogel (control group) were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells, respectively, and cultured cells were used as a blank control group to detect cell proliferative activity. After chondroblast-induced differentiation, saffron O staining, Alcian blue staining and RT-qPCR were performed respectively. The two hydrogels were co-cultured with osteoblasts, and the cultured cells were used as a blank control group for immunofluorescence staining and RT-qPCR. (2) In vivo experiment: A total of 18 adult SD rats were selected and the model of right posterior knee osteoarthritis was established by the method of medial meniscectomy. After 1 week, the rats were divided into three groups by the random number table method: The blank group did not receive any treatment. The control group was injected with sodium alginate/collagen hydrogel in the knee, and the experimental group was injected with strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel, with 6 rats in each group. After 6 weeks, the samples were subjected to Micro-CT scanning, hematoxylin-eosin staining, saffron O-solid green staining and immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: Strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel had porous microstructure and sustainable release of strontium ranelate. At 21 days, the cumulative release reached (60.89±0.58)%. Bone marrow mesenchymal stem cell staining showed that both hydrogels had good cytocompatibility. The results of the CCK-8 assay demonstrated that strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel could promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. The results of Safranin O staining, Alcian blue staining, immunofluorescence staining and RT-qPCR exhibited that strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel could promote chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Immunofluorescence staining and RT-qPCR revealed that strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel could decrease bone resorptivity by increasing the ratio of osteophosphorin/nuclear factor κB receptor activator ligand. (2) In vivo experiment: Micro-CT scan verified that compared with the blank group and control group, the subchondral bone volume fraction and bone mineral density of the knee of rats were increased in the experimental group (P < 0.05, P < 0.01). Histological staining displayed that compared with the blank group and control group, the knee cartilage injury was significantly reduced; the expression of type II collagen was promoted, and the expression of matrix metalloproteinase 2 protein was inhibited in the experimental group (P < 0.05, P < 0.01). (3) These results confirm that the strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel can promote the repair of cartilage defects in osteoarthritis and reconstruct the complex interface between cartilage and subchondral bone.

Key words: osteoarthritis, drug delivery system, sodium alginate/collagen hydrogel, strontium ranelate, subchondral bone, cartilage repair

中图分类号:

苏坤阳, 陈毕能, 陈益樑, 金少枫. 载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶促进骨性关节炎骨缺损的修复[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(10): 1568-1574.

Su Kunyang, Chen Bineng, Chen Yiliang, Jin Shaofeng. Strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel promotes bone defect repair in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(10): 1568-1574.

图/表（结果） 9

2.1 载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶的构建及药物释放实验成功地制备了具有良好成胶性能的可注射性海藻酸钠/胶原水凝胶，见图1A；扫描电子显微镜下可见载药前后的海藻酸钠/胶原水凝胶均具有优良的疏松多孔微观结构，见图1B、C。药物释放结果显示，第1天时，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶的药物释放量为(28.29±2.06)%，而后药物释放逐渐减缓，在21 d的时间内持续释放了总共(60.89±0.58)%的药物，见图1D。

2.2 水凝胶体外实验结果
2.2.1 水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖与活性的影响细胞活死染色显示，各组活细胞数量(绿色荧光)明显多于死细胞数量(红色荧光)，并且3组之间活细胞和死细胞数量无明显差别，见图2A。CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，各组细胞数量增加，培养第1，3天，3组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第7天，实验组细胞增殖吸光度值高于对照组、空白对照组(P < 0.05)，见图2B。

2.2.2 水凝胶对骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的影响番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其可以与软骨基质中的多糖如硫酸软骨素、硫酸角质素等阴离子基团结合，从而使得软骨基质被染色[14]。阿利辛蓝染料可使软骨分化细胞产生的糖胺聚糖被染色，在经过核固红复染后可以使软骨分化细胞的细胞质呈现粉红色、细胞核呈现红色，从而直观地观察成软骨分化细胞的分布和含量[15-16]。
如图3A所示，番红O染色显示，相比于空白对照组及对照组，实验组阳性染色细胞数量明显增加；阿利辛蓝染色呈现了相似结果，实验组被染为红色的软骨分化细胞数量明显多于空白对照组和对照组。RT-qPCR检测显示，实验组细胞内SOX-9 mRNA的表达高于空白对照组、对照组(2.42±0.42，1.03±0.04，0.98±0.14，P < 0.05)，Ⅱ型胶原α1链mRNA的表达高于空白对照组、对照组(3.01±0.84，1.02±0.04，0.91±0.11，P < 0.05)，空白对照组与对照组细胞内SOX-9、Ⅱ型胶原α1链mRNA的表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3B、C。

2.2.3 水凝胶对MC3T3-E1细胞骨吸收相关基因表达的影响如图4A、B所示，实验组细胞内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的mRNA表达均低于空白对照组、对照组(P < 0.05或P < 0.01)，空白对照组与对照组细胞内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。如图4C、D所示，实验组细胞内RANKL的mRNA表达低于空白对照组、对照组(P < 0.01)，骨保护素的mRNA表达高于空白对照组、对照组(P < 0.05或P < 0.01)，空白对照组与对照组细胞内RANKL和骨保护素的mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。因此这些结果表明，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可以通过增加骨保护素/RANKL比值来降低骨吸收活性。

2.2.4 水凝胶对骨髓间充质干细胞软骨分化及MC3T3-E1细胞骨吸收相关蛋白表达的影响见图5。

水凝胶对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响：如图5A所示，Ⅱ型胶原呈绿色荧光，细胞核呈蓝色，实验组被染为绿色荧光的阳性细胞数量明显多于空白对照组、对照组。图5CⅡ型胶原免疫荧光染色定量分析结果显示，实验组Ⅱ型胶原阳性细胞比率(0.69±0.11)高于空白对照组(0.39±0.05)、对照组(0.40±0.08) (P < 0.05)，空白对照组与对照组Ⅱ型胶原阳性细胞比率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
水凝胶对MC3T3-E1细胞骨吸收相关蛋白表达的影响：基质金属蛋白酶2免疫荧光染色结果显示，实验组被染为绿色荧光的阳性细胞数量明显少于空白对照组、对照组，见图5B。基质金属蛋白酶2免疫荧光染色定量分析结果显示，实验组基质金属蛋白酶2阳性细胞比率(0.47±0.07)低于空白对照组(0.78±0.15)、对照组(0.76±0.03)(P < 0.05或P < 0.01)，空白对照组与对照组基质金属蛋白酶2阳性细胞比率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5D。
2.3 水凝胶体内实验结果
2.3.1 实验动物数量分析 18只大鼠全部进入结果分析。
2.3.2 各组大鼠膝关节标本Micro-CT扫描 Micro-CT扫描显示，空白组和对照组大鼠膝关节软骨下骨的骨小梁结构相较于实验组显得疏松菲薄，见图6A。数据分析显示，实验组软骨下骨骨体积分数为(40.72±1.41)%，明显高于空白组的(32.56±2.56)%和对照组的(33.67±4.08)% (P < 0.05或P < 0.01)，并且骨密度分析也进一步证实了实验组软骨下骨骨密度高于其他两组，空白组与对照组间骨体积分数与骨密度比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图6B、C。

2.3.3 各组大鼠膝关节标本组织形态观察苏木精-伊红染色和番红O染色显示，空白组和对照组大鼠膝关节软骨表面存在明显侵蚀现象，软骨面存在有裂隙和变形；实验组大鼠膝关节软骨表面侵蚀减少，表现出相对完整的形态，见图7A。组织学染色定量分析结果显示，实验组软骨侵蚀深度低于空白组、对照组[(0.91±0.28)，(2.79±0.85)，(3.24±0.63) mm，P < 0.05或P < 0.01]，空白组与对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7B。番红O染色定量分析结果显示，空白组和对照组的相对黏多糖含量低于实验组(P < 0.01)，空白组与对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7C。

2.3.4 各组大鼠膝关节标本Ⅱ型胶原与基质金属蛋白酶2免疫荧光染色如图8A、B所示，Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶2蛋白呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，与空白组和对照组相比，实验组大鼠膝关节标本Ⅱ型胶原阳性细胞数量增加、基质金属蛋白酶2阳性细胞数减少。免疫荧光染色定量分析结果显示，实验组Ⅱ型胶原阳性细胞比率高于空白组、对照组(0.71±0.06，0.46±0.06，0.35±0.12，P < 0.01)，空白组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8C；实验组基质金属蛋白酶2阳性细胞比率低于空白组、对照组(0.34±0.08，0.57±0.06，0.49±0.05，P < 0.05)，空白组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8D。

2.4 水凝胶的生物相容性由体外实验与体内实验可知，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶具有良好的生物相容性。

参考文献

[1] BRANDT KD, DIEPPE P, RADIN E. Etiopathogenesis of Osteoarthritis. Med Clin North Am. 2009; 93(1):1-24.
[2] MASSICOTTE F, LAJEUNESSE D, BENDERDOUR M, et al. Can altered production of interleukin-1beta, interleukin-6, transforming growth factor-beta and prostaglandin E(2) by isolated human subchondral osteoblasts identify two subgroups of osteoarthritic patients. Osteoarthritis Cartilage. 2002;10(6):491-500.
[3] TELLEGEN AR, RUDNIK-JANSEN I, POURAN B, et al. Controlled release of celecoxib inhibits inflammation, bone cysts and osteophyte formation in a preclinical model of osteoarthritis. Drug Deliv. 2018;25(1):1438-1447.
[4] DENG C, ZHU H, LI J, et al. Bioactive Scaffolds for Regeneration of Cartilage and Subchondral Bone Interface. Theranostics. 2018;8(7):1940-1955.
[5] ZHAO CF, LI ZH, LI SJ, et al. PLGA scaffold carrying icariin to inhibit the progression of osteoarthritis in rabbits. R Soc Open Sci. 2019;6(4):181877.
[6] YANG J, ZHU Y, WANG F, et al. Microfluidic liposomes-anchored microgels as extended delivery platform for treatment of osteoarthritis. Chem Eng J. 2020;400. doi.org/10.1016/j.cej.2020.126004.
[7] PELLETIER JP, KAPOOR M, FAHMI H, et al. Strontium ranelate reduces the progression of experimental dog osteoarthritis by inhibiting the expression of key proteases in cartilage and of IL-1β in the synovium. Ann Rheum Dis. 2013;72(2):250-257.
[8] TAT SK, PELLETIER JP, MINEAU F, et al. Strontium ranelate inhibits key factors affecting bone remodeling in human osteoarthritic subchondral bone osteoblasts. Bone. 2011;49(3):559-567.
[9] WAN L, ZHANG X, WU D, et al. Application of Robot Positioning for Cannulated Screw Internal Fixation in the Treatment of Femoral Neck Fracture: Retrospective Study. JMIR Med Inform. 2021;9(1):e24164.
[10] REGINSTER JY, SEEMAN E, DE VERNEJOUL MC, et al. Strontium ranelate reduces the risk of nonvertebral fractures in postmenopausal women with osteoporosis: Treatment of Peripheral Osteoporosis (TROPOS) study. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90(5):2816-2822.
[11] MEUNIER PJ, ROUX C, SEEMAN E, et al. The effects of strontium ranelate on the risk of vertebral fracture in women with postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 2004;350(5):459-468.
[12] HERNÁNDEZ-GONZÁLEZ AC, TÉLLEZ-JURADO L, RODRÍGUEZ-LORENZO LM. Alginate hydrogels for bone tissue engineering, from injectables to bioprinting: A review. Carbohydr Polym. 2020;229:115514.
[13] MA S, ZHOU J, HUANG T, et al. Sodium alginate/collagen/stromal cell-derived factor-1 neural scaffold loaded with BMSCs promotes neurological function recovery after traumatic brain injury. Acta Biomater. 2021;131:185-197.
[14] YANG YF, ZHANG JY, QIAN YX, et al. Superparamagnetic Iron Oxide is Suitable to Label Tendon Stem Cells and Track Them In Vivo with MR Imaging. Ann Biomed Eng. 2013;41(10):2109-2119.
[15] IRANI S, HONARPARDAZ A, CHOUBINI N, et al. Chondro-inductive nanofibrous scaffold based gelatin/polyvinyl alcohol/chondroitin sulfate for cartilage tissue engineering. Polym Adv Technol. 2020;31(6):1395-1402.
[16] HEINEMANN C, HEINEMANN S, BERNHARDT A, et al. Novel textile chitosan scaffolds promote spreading, proliferation, and differentiation of osteoblasts. Biomacromolecules. 2008;9(10):2913-2920.
[17] GAO H, PAN Q, DONG W, et al. Progress in Osteochondral Regeneration with Engineering Strategies. Ann Biomed Eng. 2022;50(10):1232-1242.
[18] WU J, PAN Y, YU Y, et al. Axial Compressive Loading Attenuates Early Osteoarthritis by Reducing Subchondral Bone Remodeling.Am J Sports Med. 2023;3635465231164644. doi: 10.1177/03635465231164644.
[19] SU W, LIU G, LIU X, et al. Angiogenesis stimulated by elevated PDGF-BB in subchondral bone contributes to osteoarthritis development. JCI Insight. 2020;5(8):e135446.
[20] CHEN Y, XU W, SHAFIQ M, et al. Injectable nanofiber microspheres modified with metal phenolic networks for effective osteoarthritis treatment. Acta Biomater. 2023;157:593-608.
[21] LIAO B, DING M, WANG Y, et al. Strontium ion attenuates osteoarthritis through inhibiting senescence and enhancing autophagy in fibroblast-like synoviocytes. Mol Biol Rep. 2023; 50(2):1437-1446.
[22] DING G, HE Y, SHI Y, et al. Sustained-Drug-Release, Strong, and Anti-Swelling Water-Lipid Biphasic Hydrogels Prepared via Digital Light Processing 3D Printing for Protection against Osteoarthritis: Demonstration in a Porcine Model. Adv Healthc Mater. 2023;e2203236. doi: 10.1002/adhm.202203236.
[23] WANG H, LIN C, ZHANG X, et al. Mussel-Inspired Polydopamine Coating: A General Strategy To Enhance Osteogenic Differentiation and Osseointegration for Diverse Implants. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(7):7615-7625.
[24] FIGUEROA-PIZANO MD, VELAZ I, PENAS FJ, et al. Effect of freeze-thawing conditions for preparation of chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels and drug release studies. Carbohydr Polym. 2018;195:476-485.
[25] GU Z, WANG J, FU Y, et al. Smart Biomaterials for Articular Cartilage Repair and Regeneration. Adv Funct Mater. 2023;10(33):2212561.
[26] 陈臻浩,赵广雷,石晶晟,等.Sox9对软骨细胞分化和基质产生的调控机制[J].复旦学报(医学版), 2019,46(6):824-828.
[27] TENG B, ZHANG H, ZENG Z, et al. Application of functionalized hyaluronic acid hydrogel with the activity of regulating the behaviors of stem cells in repairing rabbit knee articular cartilage. J Biomater Appl. 2023;37(9):1617-1625.
[28] YU H, LIU Y, YANG X, et al. The anti-inflammation effect of strontium ranelate on rat chondrocytes with or without IL-1 beta in vitro. Exp Ther Med. 2022; 23(3).doi:10.3892/etm.2022.11131.
[29] YU DG, DING HF, MAO YQ, et al. Strontium ranelate reduces cartilage degeneration and subchondral bone remodeling in rat osteoarthritis model. Acta Pharmacol Sin. 2013;34(3):393-402.
[30] HU Y, Chen X, Wang S, et al. Subchondral bone microenvironment in osteoarthritis and pain. Bone Res. 2021;9(1):20.
[31] KWAN TAT S, LAJEUNESSE D, PELLETIER JP, et al. Targeting subchondral bone for treating osteoarthritis: what is the evidence? Best Pract Res Clin Rheumatol. 2010;24(1):51-70.
[32] BETTICA P, CLINE G, HART DJ, et al. Evidence for increased bone resorption in patients with progressive knee osteoarthritis: longitudinal results from the Chingford study. Arthritis Rheum. 2002;46(12):3178-3184.
[33] LI X, JIN L, TAN Y. Different roles of matrix metalloproteinase 2 in osteolysis of skeletal dysplasia and bone metastasis (Review). Mol Med Rep. 2021;23(1):70.
[34] MARÍN-RAMOS NI, THEIN TZ, GHAGHADA KB, et al. miR-18a Inhibits BMP4 and HIF-1α Normalizing Brain Arteriovenous Malformations. Circ Res. 2020;127(9):e210-e231.
[35] KOVÁCS B, VAJDA E, NAGY EE. Regulatory Effects and Interactions of the Wnt and OPG-RANKL-RANK Signaling at the Bone-Cartilage Interface in Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2019; 20(18):4653.
[36] CHEN J, LAN Y, HE Y, et al. 99Tc-MDP-induced human osteoblast proliferation, differentiation and expression of osteoprotegerin. Mol Med Rep. 2017;16(2):1801-1809.
[37] XU F, DONG Y, HUANG X, et al. Pioglitazone affects the OPG/RANKL/RANK system and increase osteoclastogenesis. Mol Med Rep. 2016;14(3):2289-2296.

引言

骨性关节炎是一种以进行性软骨损伤、软骨下骨重塑、滑膜炎和骨赘形成为特征的关节疾病，主要临床表现为受累关节的持续疼痛和活动受限，严重损害患者的身体功能和生活质量[1-2]。在骨性关节炎的疾病进程中，软骨损伤和软骨下骨的重塑互相影响形成恶性循环，一方面，软骨退变导致软骨下骨代谢紊乱、软骨下骨重塑和硬化；另一方面，软骨下骨硬化可加剧软骨的组织功能障碍和退行性变[3-4]。目前临床上骨性关节炎的非手术治疗包括适当锻炼、减重等方法为主的物理治疗和以非类固醇类抗炎药、止痛药等药物为主的药物治疗，但是这些治疗方案仅能缓解疼痛等临床症状并不能改善疾病的进程。当骨性关节炎进展至晚期时，手术治疗仍是目前临床上唯一治疗方案[5-6]。因此，研究一种能够同时改善骨性关节炎局部软骨损伤和软骨下骨重塑的非手术治疗方案将具有非常重要的临床意义。
雷奈酸锶是一种用于治疗绝经后骨质疏松症的药物，但是近期研究表明，雷奈酸锶对骨性关节炎具有强大潜在治疗效应[7]。雷奈酸锶可通过抑制破骨相关基因如核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达抑制破骨细胞的分化，促进破骨细胞的凋亡，发挥抑制骨吸收的作用[8]。研究表明，骨性关节炎软骨下骨的变化由异常的骨吸收阶段和骨硬化阶段组成，因此雷奈酸锶可通过抑制骨吸收改善局部的骨代谢，从而改善软骨下骨的微结构特征。此外，近期的研究还证实，雷奈酸锶可通过促进骨髓间充质干细胞的软骨分化、加速大鼠股骨髁缺损部位的软骨再生 [9]。雷奈酸锶的系统用药已被证实可直接改善骨性关节炎的疾病的进展，但系统用药方式使得药物在骨性关节炎局部的利用效率不高，并且会造成消化道反应如恶心、腹泻等不良反应[10-11]。
关节内注射给药是治疗骨性关节炎最有吸引力的方法之一，其可显著提升药物在局部的浓度且减少全身不良反应的出现[6]。将关节内注射给药的方法与骨组织工程药物递送系统相结合可进一步增加给药效率，有效延长药物在关节内的滞留时间，有效减少多次反复注射带来的诸如关节出血或感染等并发症。对于这一治疗方案，合适的载体材料和药物的选择是达成满意治疗效果的决定性因素。基于海藻酸钠的可注射水凝胶具有与天然细胞外基质相似性、良好的孔隙率以及生物降解性，被广泛用于组织工程[12]。胶原蛋白是骨和软骨细胞外基质的主要成分，因此，海藻酸钠和胶原相结合的复合水凝胶可模拟软骨细胞微环境，为关节腔内注射给药提供了一种优良的药物递送载体[13]。
此次研究将雷奈酸锶负载于海藻酸钠/胶原水凝胶基质内构建了一种用于治疗骨性关节炎的可注射药物缓释系统，拟通过细胞实验研究复合载药水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、成软骨分化以及成骨细胞破骨相关基因表达等的影响，将该药物递送体系注射至骨性关节炎模型大鼠关节腔内，研究其在骨性关节炎局部应用的治疗效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，体内动物实验，进行t检验或单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2022年12月在中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院(泉州市海峡医院)实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要细胞骨髓间充质干细胞、成骨细胞系MC3T3-E1购自苏州赛业公司。
1.3.2 药品与试剂雷奈酸锶购自齐岳生物公司；Ⅰ型胶原、海藻酸钠、氯化钙、青-链霉素双抗、阿新蓝染料溶液、40 g/L多聚甲醛固定液购自索莱宝公司；抗Ⅱ型胶原蛋白抗体、抗基质金属蛋白酶2抗体购自武汉ABclonal公司；FITC标记的山羊抗兔二抗购自北京Bioss公司；DMEM低糖培养基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶-EDTA购自Gibco公司；骨髓间充质干细胞成软骨诱导培养基均购自苏州赛业公司；活死细胞染色试剂盒和细胞增殖活性试剂盒(CCK-8)、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自Takara 公司；苏木精-伊红染料购自Sigma 公司。
1.3.3 实验动物 8周龄雄性SD大鼠18只，体质量300-400 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK (湘)2019-0004。实验已获得中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院(泉州市海峡医院)动物伦理委员会的批准(批准号：院医伦[2022]54号)，并按照其既定准则进行。
1.4 实验方法
1.4.1 载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶的合成将海藻酸钠溶于去离子水中，制备20 g/L的海藻酸钠溶液；将Ⅰ型胶原溶于醋酸缓冲液中，制备5 g/L的Ⅰ型胶原溶液，并最终调节pH值为7.2。将海藻酸钠溶液和Ⅰ型胶原溶液以体积比2∶1混合，随后将药物雷奈酸锶加入到上述溶液中，配置药物终浓度为5 mmol/L的混合溶液。最后，将0.4 mol/L的CaCl2溶液缓慢加入到上述含有雷奈酸锶的海藻酸钠/胶原混合溶液中，使得混合溶液交联而形成凝胶。以同样的方法配置不含有雷奈酸锶的海藻酸钠/胶原水凝胶作为对照组。通过扫描电子显微镜(Nova400，FEI，美国希尔斯伯勒)对载药前后水凝胶微的结构特征进行观察。
1.4.2 载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶的药物释放将2 mL载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶放置到透析膜中，并将其浸泡到4 mL PBS中，将复合体系在37 ℃下进行持续振荡。在浸泡的第1，2，3，4，5，7，14，21天，分别收取浸泡液并加入等量的新浸泡液，在360 nm处检测各个时间点浸泡液的吸光度值以确定其中的药物浓度，从而研究雷奈酸锶从水凝胶基质中的释放曲线。
1.4.3 水凝胶的体外实验
(1)水凝胶与骨髓间充质干细胞共培养：使用含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM低糖培养基培养骨髓间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内。观察细胞达到80%-90%融合度时，使用胰蛋白酶消化并传代，传至第3代时用于后续细胞实验。
细胞活死染色：将骨髓间充质干细胞以1×104/孔的密度接种到24孔板内，每孔分别加入载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶(实验组)、海藻酸钠/胶原水凝胶(对照组)，每孔0.5 mL，以单独培养的细胞为空白对照。培养3 d后，在避光条件下用钙黄素AM和碘化丙啶分别对活细胞和死细胞进行染色，荧光显微镜下观察染色结果。
细胞增殖检测：按如上方法分组并培养细胞。培养1，3，7 d后，在避光条件下向每孔中加入10%培养基体积的CCK-8试剂孵育2 h，在450 nm处检测吸光度值。
细胞番红O染色及阿利新蓝染色：将骨髓间充质干细胞以1×105/孔的密度接种到24孔板内，待细胞贴壁生长后将培养基更换软骨分化培养基，每孔分别加入载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶(实验组)、海藻酸钠/胶原水凝胶(对照组)，每孔0.5 mL，以单独培养的细胞为空白对照。诱导14 d后，去除培养液，用40 g/L多聚甲醛对细胞进行固定。在番红O染色中，细胞固定后用PBS清洗，随后在室温下使用番红O染液对细胞进行染色30 min。在阿利新蓝染色中，细胞经充分固定及冲洗后，在室温下用阿新蓝染料溶液对细胞进行染色，染色完成后再使用核固红进行样本的复染。两种染色结果均通过倒置光学显微镜进行观察和拍照。
Ⅱ型胶原免疫荧光染色：将骨髓间充质干细胞以2×105/孔的密度接种到6孔板内，待细胞贴壁生长后将培养基更换软骨分化培养基，每孔分别加入载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶(实验组)、海藻酸钠/胶原水凝胶(对照组)，每孔1 mL，以单独培养的细胞为空白对照。诱导14 d后，用40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，随后以4 ℃预冷的PBS洗涤3次；0.1% Triton X-100室温对细胞进行透化20 min，用体积分数10%山羊血清对细胞进行封闭30 min；加入一抗4 ℃下孵育过夜，加入FITC标记山羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h；加入DAPI染液对细胞核染色2 min，以PBS洗涤3次后，荧光显微镜下观察染色结果，并记录阳性细胞数量，分析阳性细胞比率。
RT-qPCR检测：细胞分组及处理同Ⅱ型胶原免疫荧光染色，检测SOX-9、Ⅱ型胶原α1链mRNA的表达。诱导14 d后，使用离心柱法从细胞中提取总RNA，并对所提取的RNA进行质检。应用反转录试剂盒将所提取的总RNA反转录为cDNA。然后将100 ng的cDNA加入含有 10 μL的 2×SuperReal PreMix Plus、1.2 μL引物和6.8 μL双蒸水的20 μL反应体系中，使用Light Cycler 480 PCR仪进行扩增，扩增反应条件为：95 ℃预变性3 min，以95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s为1个循环，进行循环反应40次，仪器自动检测熔解曲线。引物序列如表1所示。所有的表达基因通过GAPDH进行标准化，指定基因的相对表达水平使用2-ΔΔCt法计算。
(2) 水凝胶与MC3T3-E1细胞共培养：将MC3T3-E1细胞以2×105/孔的密度接种到6孔板内，每孔分别加入载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶(实验组)、海藻酸钠/胶原水凝胶(对照组)，每孔1 mL，以单独培养的细胞为空白对照。
基质金属蛋白酶2免疫荧光染色：培养14 d后，进行基质金属蛋白酶2免疫荧光染色，染色方法同Ⅱ型胶原免疫荧光染色。

RT-qPCR检测：培养14 d后，检测骨重塑基因基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、RANKL及骨保护素mRN的表达。检测方法同上。引物序列见表1。

1.4.4 水凝胶体内实验
骨性关节炎动物模型的建立与分组处理：通过内侧半月板切除的方法建立大鼠骨性关节炎模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，妥善麻醉后在右后膝关节前侧进行纵向皮肤切口，暴露关节囊；然后在内侧副韧带和髌韧带之间纵向切开关节囊，切断内侧半月板韧带、去除内侧半月板，确认膝关节失稳后缝合切口。术后1周，采用随机数字表法将18只大鼠分3组处理(n=6)：空白组不做处理，对照组关节内注射海藻酸钠/胶原水凝胶50 µL，实验组关节内注射载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶50 µL。造模后第6周，麻醉后处死大鼠，取出造模膝关节标本。
Micro-CT扫描：将膝关节标本放置在Micro-CT系统[中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院(泉州市海峡医院)实验室]中，在48 kV的电压、200 μA的电流和18 μm的图像像素尺寸下进行扫描检测，研究软骨下骨质的结构改变和矿化程度，并定量分析新生骨体积分数和骨密度。
组织形态观察：在Micro-CT扫描后，所有标本均通过分级乙醇系列脱水、在莫尔斯溶液中脱钙，石蜡包埋后将样品块切成 5 μm 厚的切片，分别进行苏木精-伊红染色与番红O染色。①苏木精-伊红染色：首先将切片梯度脱蜡至水后，浸入苏木精染液中染色5 min，漂洗后分别用1%盐酸乙醇分化及1%氨水水溶液返蓝；随后将切片放入伊红染液中染色，漂洗并梯度脱水封固后在显微镜下观察。②番红O染色：常规将切片脱蜡至水，加入Weigert铁苏木精染液染色3 min，酸性分化液分化15 s后加入到固绿染色液内浸染5 min；随后弱酸溶液洗涤去除多余染液，将切片入番红染液浸染5 min，漂洗并梯度脱水封固后观察染色情况。通过ImageJ软件测量软骨面损伤深度及染色的黏多糖面积，对染色结果进行半定量对比分析。
免疫荧光染色：通过免疫荧光染色评估骨性关节炎部位成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原和骨吸收相关蛋白基质金属蛋白酶2的表达。将切片与抗Ⅱ型胶原抗体、抗基质金属蛋白酶2抗体在4 ℃孵育过夜，与FITC标记的山羊抗兔二抗一起孵育1 h，使用DAPI对细胞核进行染色，荧光显微镜下观察染色结果，并记录阳性细胞数量，分析阳性细胞比率。
1.5 主要观察指标两种水凝胶的体外实验与体内实验结果。
1.6 统计学分析所有实验数据均从3个独立实验中获得，并以x±s的方式表示。使用SPSS 19.0软件进行统计分析，统计学差异进行t检验或单因素方差分析。P < 0.05被认为组间差异有显著性意义。该文统计学方法已经泉州市海峡医院生物统计学专家审核。

讨论

关节软骨变性损伤是导致骨性关节炎出现关节疼痛和功能障碍的主要问题所在，最初被认为是推动骨性关节炎发展的唯一因素，然而仅针对关节软骨变性的治疗方案不足以阻止疾病进展。最近的证据表明，软骨下骨病理改变也是骨性关节炎的主要特征，是骨性关节炎进展的主要因素[17-18]。关节软骨和软骨下骨相互连接而形成功能协调的联动单元，软骨下骨在关节运动过程中为上覆的软骨提供机械支撑，并响应机械环境变化而经历不断的重塑。此前的研究显示，在骨性关节炎中软骨下骨微结构的变化先于关节软骨损伤[19]。根据这一病理机制，此次研究将雷奈酸锶负载到海藻酸钠/胶原水凝胶载体基质内构建了一种可注射药物递送系统，通过雷奈酸锶的持续原位缓释促进关节软骨的修复并改善软骨下骨的代谢紊乱。雷奈酸锶是由2个二价锶离子与雷奈酸稳定结合而形成的盐。锶离子是人体必需的微量元素之一，具有多种生理功能[20]。雷奈酸锶被证实具有显著促进软骨再生、促进成骨细胞增殖分化并抑制破骨活性的功能。有研究显示，雷奈酸锶可减轻骨性关节炎患者关节疼痛、减轻关节软骨损伤、延缓疾病的进程，并且可显著降低尿中Ⅱ型胶原降解生物标志物的水平[21]。此次研究以胶原和海藻酸钠为基础构建了具有良好生物相容性的药物载体，通过关节内注射的方式将雷奈酸锶直接递送至骨性关节炎部位，减少全身用药反应。载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶具有良好的疏松的孔隙结构，这有利于存在于凝胶网络结构中的雷奈酸锶进行自由扩散，从而释放至周围环境中[22]。通过体外实验对雷奈酸锶从复合凝胶中的释放曲线进行了研究，药物递送系统在第1天存在快速释放情况，这可能是由于表层水凝胶基质内的药物扩散以及表面吸附的药物释放所导致；随后结构凝胶基质内部的药物缓慢扩散释放与凝胶部分降解导致的药物释放，使得药物的总体释放速率明显放缓[23-24]。总体上来说，复合水凝胶载体展现了较为良好的药物缓释效果，这对雷奈酸锶在关节内的持续原位释放、减少关节内药物注射次数来说具有重要的意义。
由于缺乏脉管系统和淋巴系统，成熟软骨细胞的增殖和迁移能力是非常有限的，因此促进损伤软骨的再生仍然是一个挑战[25]。此次研究通过药物的原位释放促进内源性骨髓间充质干细胞的成软骨分化，从而改善骨性关节炎局部的软骨损伤。SOX-9在骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中起着非常关键的作用，其可以调节软骨分化过程中多种细胞因子的表达水平，招募转录复合物的成分和介体复合物的亚基，从而参与并调控软骨分化的多个阶段[26]。Ⅱ型胶原α1链是编码Ⅱ型胶原蛋白α1链的基因。Ⅱ型胶原蛋白是软骨组织中的一种特异性的纤维状胶原，其是一软骨形成及软骨抗压能力形成的关键蛋白[27]。此次研究结果证实，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶通过缓释雷奈酸锶显著上调成软骨相关基因SOX-9及Ⅱ型胶原α1链的表达，并且免疫荧光染色证实，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可促进Ⅱ型胶原蛋白的表达，这也与此前多项研究结果保持一致。YU等[28]的研究显示，雷奈酸锶可促进多种软骨分化关键蛋白如Ⅱ型胶原、聚蛋白多糖的表达，从而促进软骨修复。另一项研究在应用雷奈酸锶治疗大鼠骨性关节炎模型6周后发现，Ⅱ型胶原、SOX-9、聚蛋白多糖等软骨分化蛋白的表达显著增高，骨性关节炎局部软骨损伤显著减轻[29]。
在异常的机械负荷作用下，软骨下骨局部破骨细胞活性增加、骨吸收增强，这一微环境的改变通常是最先检测到的骨性关节炎改变之一。在早期骨性关节炎中，骨重建率比正常骨快20倍，骨重建标志物显著增加[30]，这使得软骨下骨局部代谢紊乱，在骨性关节炎的早期吸收增加、而后期出现硬化[31-32]。成骨细胞可表达多种蛋白对骨吸收及骨重塑过程进行调控，其中最为关键的包括蛋白水解酶基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9及骨保护素和RANKL。此前的研究显示，这些基因的表达在骨性关节炎软骨下骨局部的表达明显异常[8]。因此，实验通过研究载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶对这4种基因表达的调控作用，探索其改善骨性关节炎软骨下骨代谢微环境的潜能。基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9主要通过降解细胞外基质成分(包括 Ⅰ 型胶原蛋白以及其他细胞外成分如纤连蛋白)来介导骨吸收，其中基质金属蛋白酶2主要由成骨细胞产生，而基质金属蛋白酶9由成骨细胞和破骨细胞产生[33-35]。因此，实验研究了复合体系对成骨细胞系MC3T3-E1基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达的影响，结果证实载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶复合水凝胶可以抑制基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的基因表达，并且在雷奈酸锶的持续作用下其蛋白表达水平显著降低。骨保护素/核因子κB受体激活因子/RANKL信号通路是调节破骨细胞功能和骨吸收的重要信号通路。RANKL和骨保护素由成骨细胞和骨髓间充质干细胞分泌。RANKL与破骨细胞和破骨祖细胞表面的核因子κB受体激活因子结合，发挥促进破骨细胞形成和骨吸收的作用。骨保护素可以与RANKL结合，从而竞争性地减少RANKL与核因子κB受体激活因子的结合[36-37]。载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可以通过增强骨保护素表达、抑制RANKL来发挥抑制破骨细胞活性的作用。
此次研究采用了内侧半月板切除的方法来诱导大鼠骨性关节炎模型，相比于其他方法如前交叉韧带切除术诱导的骨性关节炎，切除内侧半月板被证实可以缓慢而稳定地诱导骨性关节炎疾病模型。载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶的局部注射可以通过促进软骨分化相关蛋白的表达、抑制骨吸收相关蛋白如基质金属蛋白酶2表达来促进软骨面的修复，改善软骨下骨的状态，从而协同调控骨性关节炎的进展。同时，研究也存在一定的局限性，例如未设置不同浓度雷奈酸锶进行作用效果的对比研究、动物实验中未设置正常关节面进行对比等。
结论：实验以海藻酸钠和Ⅰ型胶原混合凝胶为载体，通过物理共混的方法将雷奈酸锶负载于混合凝胶基质中而构建了一种复合原位药物缓释体系，该复合体系在体外展现了良好的缓释效果，并具有优良的细胞相容性。体外细胞实验结构证实，这一复合载药体系可以促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化，并且可以抑制长成骨细胞骨吸收相关基因的表达。体内实验结果表明，该复合载药凝胶通过在关节腔局部释放雷奈酸锶而防止了软骨面的损伤、改善软骨下骨结构，从而抑制了骨性关节炎的进展。因此，作为一种创新的可注射功能性凝胶制剂，载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶可在原位缓释并保持雷奈酸锶的疗效，为骨性关节炎治疗提供了一种有效策略。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

载雷奈酸锶海藻酸钠/胶原水凝胶促进骨性关节炎骨缺损的修复

Strontium ranelate-loaded sodium alginate/collagen hydrogel promotes bone defect repair in osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[4]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[5]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[6]	刘瀚峰, 王晶晶, 余云生. 人造外泌体治疗心肌梗死：应用现状及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1118-1123.
[7]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[8]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[9]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[10]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.
[11]	张亚茹, 陈焱君, 张晓东, 陈胜华, 黄文华. 谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 550-555.
[12]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[13]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.
[14]	陈俊炎, 孟庆奇, 李斯明. 关节腔注射治疗骨关节炎药物载体系统中的软骨靶向功能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 458-463.
[15]	孟志成, 乔卫平, 赵阳, 刘洪飞, 李凯杰, 马博. 免疫细胞及相关细胞因子在骨关节炎发病及治疗中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 280-287.