静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的细胞相容性

doi:10.12307/2024.270

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (15): 2351-2357.doi: 10.12307/2024.270

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的细胞相容性

魏岁艳1，曹怡静1，赵帅1，李冬瑶1，魏琴2，许燕3，徐国强1,4

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆医科大学中心实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；3新疆大学机械工程学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830047；4新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2023-03-09 接受日期:2023-05-08 出版日期:2024-05-28 发布日期:2023-09-19
通讯作者: 徐国强，主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:魏岁艳，女，1994年生，甘肃省庆阳市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔材料学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(51965057)，项目负责人：许燕

Cytocompatibility of electrospun polyvinylidene fluoride piezoelectric bionic periosteum

Wei Suiyan1, Cao Yijing1, Zhao Shuai1, Li Dongyao1, Wei Qin2, Xu Yan3, Xu Guoqiang1, 4

1Department of Prosthodontics and Implantology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3College of Mechanical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830047, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Insitute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-03-09 Accepted:2023-05-08 Online:2024-05-28 Published:2023-09-19
Contact: Xu Guoqiang, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics and Implantology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Insitute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wei Suiyan, Master candidate, Department of Prosthodontics and Implantology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 51965057 (to XY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

静电纺丝：是利用高压静电场对高分子溶液的击穿作用来制备纳微米纤维材料的方法，其基本原理是在喷射装置和接收装置间施加上万伏的静电场，从纺丝液的锥体端部形成射流，并在电场中被拉伸，最终在接收装置上形成无纺状态的纳米纤维。
聚偏氟乙烯：为白色粉末状结晶性聚合物，是一种新型的高分子材料。通过静电纺丝技术制备的聚偏氟乙烯纳米纤维膜，在过滤材料、电池隔膜、生物医学等领域应用广泛，具有良好的发展前景。

背景：聚偏氟乙烯具有压电性能、良好的生物相容性和无毒性，使其成为骨膜修复合适的候选材料。

目的：评价掺锌镁离子静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的体外细胞毒性。
方法：采用静电纺丝技术分别制备纯聚偏氟乙烯、掺锌离子聚偏氟乙烯、掺镁离子聚偏氟乙烯、掺锌镁离子聚偏氟乙烯压电仿生骨膜，依次命名为PVDF、PVDF-Zn、PVDF-Mg和PVDF-Zn-Mg，其中锌、镁离子的质量分数均为1%。将成骨细胞、血管内皮细胞分别与4组仿生骨膜共培养，通过碱性磷酸酶染色、CD31免疫荧光染色、扫描电镜观察与CCK-8法检测仿生骨膜的细胞相容性。

结果与结论：①成骨细胞：培养7 d的碱性磷酸酶染色显示，PVDF-Zn组碱性磷酸酶分泌多于其他3组。扫描电镜下可见，培养1 d时，细胞在PVDF-Mg和PVDF-Zn-Mg仿生骨膜表面得到了一定的铺展，伪足向四周伸展；到3 d时，各组细胞边缘向材料伸出伪足；到第5，7天时，细胞铺展充分、生长形态良好且牢牢地覆盖在纤维表面，细胞伪足向四周及纤维空隙中伸展。CCK-8检测显示，随着时间的推移，各组仿生骨膜上的细胞增殖呈上升趋势，培养1，3，5，7 d的细胞相对增殖率均≥75%，细胞毒性≤1级。②血管内皮细胞：培养3 d的CD31免疫荧光染色显示，细胞在各组仿生骨膜上良好地黏附和铺展，彼此连接，其中PVDF-Zn-Mg组细胞数量多于其他3组。扫描电镜下可见，培养1，3 d时，细胞开始黏附在各组纤维表面；到5 d时，细胞在纤维表面均铺展良好并伸出明显的伪足；到7 d时，PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg仿生骨膜上的细胞呈复层生长，并伸展伪足至纤维空隙内。CCK-8检测显示，随着时间推移，各组仿生骨膜上的细胞增殖呈下降趋势，培养1，3，5，7 d的细胞相对增殖率均≥125%，细胞毒性为0级。③结果表明：掺锌镁离子静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜具有良好的细胞相容性。

https://orcid.org/0009-0008-4428-3264(魏岁艳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 静电纺丝, 聚偏氟乙烯, 骨缺损, 仿生骨膜, 细胞相容性, 骨组织工程

Abstract: BACKGROUND: Polyvinylidene fluoride (PVDF) with piezoelectric properties, good biocompatibility and nontoxicity make it a suitable candidate for periosteal repair.
OBJECTIVE: To evaluate the cytotoxicity of PVDF bionic periosteum by electrospinning with zinc and magnesium ions in vitro.
METHODS: Pure PVDF, zinc-doped PVDF, magnesium-doped PVDF and Zinc-magnesium ion PVDF piezoelectric bionic periosteum were prepared by electrospinning technology, respectively. They were named PVDF, PVDF-Zn, PVDF-Mg and PVDF-Zn-Mg, in which the mass fraction of zinc and magnesium ions were all 1%. Osteoblasts and vascular endothelial cells were co-cultured with four groups of bionic periosteum. Cell compatibility of bionic periosteum was determined by alkaline phosphatase staining, CD31 immunofluorescence staining, and scanning electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Osteoblasts: Alkaline phosphatase staining after 7 days of culture showed that the PVDF-Zn group secreted more alkaline phosphatase than the other three groups. Under a scanning electron microscopy, after 1 day of culture, the cells had a certain spread on the surface of PVDF-Mg and PVDF-Zn-Mg bionic periosteum, and the pseudopod extended to all sides. On day 3, the cell edge of each group extended pseudopods to the material. By days 5 and 7, the cells were fully spread, well grown and firmly covered the surface of the fibers, and the cellular pseudopods extended around and into the interstitial space of the fibers. CCK-8 assay showed that the cell proliferation on the bionic periosteum of each group showed an increasing trend over time and the relative proliferation rate of cells at 1, 3, 5, and 7 days was ≥75%, and the cytotoxicity was ≤ grade 1. (2) Vascular endothelial cells: CD31 immunofluorescence staining for 3 days showed that the cells adhered and spread well on the bionic periosteum of each group and connected with each other, and the number of cells in the PVDF-Zn-Mg group was more than that in the other three groups. Under scanning electron microscope, the cells began to adhere to the surface of each group of fibers after 1 and 3 days of culture. On day 5, the cells were well spread on the surface of the fibers and extended obvious pseudopods. On day 7, the cells on the PVDF-Mg and PVDF-Zn-Mg bionic periosteum grew in multiple layers and extended the pseudopod into the fibrous void. CCK-8 assay showed that the cell proliferation on the bionic periosteum of each group showed a downward trend over time, and the relative proliferation rate of cells at 1, 3, 5 and 7 days was ≥125%, and the cytotoxicity was grade 0. (3) The results showed that Zn-Mg electrospun PVDF piezoelectric bionic periosteum had good cytocompatibility.

Key words: electrospinning, polyvinylidene fluoride, bone defect, biomimetic periosteum, cell compatibility, bone tissue engineering

中图分类号:

魏岁艳, 曹怡静, 赵帅, 李冬瑶, 魏琴, 许燕, 徐国强. 静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2351-2357.

Wei Suiyan, Cao Yijing, Zhao Shuai, Li Dongyao, Wei Qin, Xu Yan, Xu Guoqiang. Cytocompatibility of electrospun polyvinylidene fluoride piezoelectric bionic periosteum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(15): 2351-2357.

图/表（结果） 14

2.1 成骨细胞和血管内皮细胞传代与培养培养第5天时，成骨细胞大多数呈细长梭形或柱状，如图1A所示；培养第7天时，血管内皮细胞紧密相连呈鹅卵石铺路样形状，如图1B所示。

2.2 仿生骨膜与成骨细胞共培养结果
2.2.1 碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶活性可作为评价骨形成早期的生化和组织学指标[24]，碱性磷酸酶染色可定性观察碱性磷酸酶的产生，膜表面颜色越深说明碱性磷酸酶分泌越多。培养7 d时各组成骨细胞碱性磷酸酶染色如图2所示，4种仿生骨膜组染色均较对照组明显，并且PVDF-Zn组染色较PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Zn-Mg组明显增强，PVDF-Mg组与PVDF-Zn-Mg组染色未见明显差别。

2.2.2 扫描电镜观察成骨细胞是骨骼形成的主要功能细胞，因此研究了成骨细胞在仿生骨膜表面的生长状况。如图3所示，培养1 d时，细胞开始黏附，成骨细胞在PVDF和PVDF-Zn仿生骨膜表面基本维持了成骨细胞的原始形态，而在PVDF-Mg和PVDF-Zn-Mg仿生骨膜表面得到了一定的铺展，伸出伪足向四周伸展；培养到3 d时，成骨细胞边缘向材料伸出伪足；培养到5，7 d时，细胞铺展充分且生长形态良好，细胞呈多边形，牢牢地覆盖在纤维表面，细胞伪足向四周及纤维空隙中伸展，由此表明纯的PVDF仿生骨膜和含有锌镁离子的PVDF仿生骨膜与成骨细胞共培养具有良好的细胞相容性。

2.2.3 CCK-8法检测细胞增殖对成骨细胞吸光度值进行重复测量方差分析，不同时间点间的细胞增殖差异有显著性意义(P < 0.001)，不同仿生骨膜组别之间的细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05)，而时间和分组之间有交互作用。
随着时间推移，各组细胞增殖呈上升趋势，培养第1天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值低于对照组(P < 0.05)；培养第3，5，7天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；培养第1，3，7天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第5天时，PVDF-Zn组与PVDF-Mg组细胞增殖吸光度值相比差异有显著性意义(P < 0.05)，如表2和图4所示。表3、图5所示，细胞毒性随着时间的推移逐渐减少，各组细胞相对增殖率≥75%，各组仿生骨膜细胞毒性等级逐渐趋于0级，根据细胞毒性等级标准可以得出，PVDF组、PVDF-Zn组PVDF-Zn组和PVDF-Zn-Mg组仿生骨膜均无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。

2.3 仿生骨膜与血管内皮细胞共培养结果
2.3.1 CD31免疫荧光染色培养3 d后，各组血管内皮细胞的CD31免疫荧光染色结果呈阳性，如图6所示，对照组和4组仿生骨膜表面的细胞聚集生长，开始融合，细胞在仿生骨膜上得到很好的黏附和铺展，彼此连接，PVDF-Zn-Mg组的细胞数量多于其他4组，说明静电纺丝PVDF仿生骨膜有利于血管内皮细胞增殖。

2.3.2 扫描电镜观察血管形成是骨骼形成和再生所必需的，骨组织的修复需要骨毛细血管来运输氧气和营养物质，由于骨缺损的修复不仅是骨的再生，也是血管再生的过程，因此研究了血管内皮细胞在静电纺丝仿生骨膜上的黏附情况，如图7所示，培养第1，3天时，细胞形态并未伸展完全，细胞开始黏附在纤维表面；培养到第5天时，细胞在各组复合纤维表面均铺展良好，并且可以观察到明显的伪足，细胞在4组仿生骨膜表面均得到了充分的伸展，伪足向四周伸展；培养到第7天时，相比较于PVDF、PVDF-Zn仿生骨膜，PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg仿生骨膜上的血管内皮细胞呈复层生长，具有良好的延伸性，伪足伸展至纤维空隙内，牢牢地附着于纤维膜上。综上，PVDF、PVDF-Zn、PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg仿生骨膜有利于血管内皮细胞的生长。

2.3.3 CCK-8法检测细胞增殖对血管内皮细胞增殖吸光度值进行重复测量方差分析，不同的时间点相比较细胞增殖差异有显著性意义(P < 0.001)，不同仿生骨膜组别之间的细胞增殖差异有显著性意义(P < 0.001)，并且时间和分组之间有交互作用。
随着时间推移，各组仿生骨膜的血管内皮细胞增殖呈下降趋势，培养第1天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.001)，PVDF-Zn-Mg组细胞增殖吸光度值低于PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Mg组(P < 0.05)；培养第3天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.001)，PVDF-Mg组细胞增殖吸光度值低于PVDF组、PVDF-Zn组(P < 0.05)；培养第5天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.001)，其余实验组两两比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；培养第7天时，4组仿生骨膜上的细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.001)，PVDF组、PVDF-Zn-Mg组细胞增殖吸光度值高于PVDF-Zn组、PVDF-Mg组(P < 0.05)，如表4、图8所示。如表5、图9所示，各组细胞相对增殖率≥125%，根据细胞毒性分级标准，各组仿生骨膜的细胞毒性等级均为0级，表明各组仿生骨膜具有优良的细胞相容性。

2.4 材料的细胞相容性由实验结果可知，各组仿生骨膜均具有良好的细胞相容性。

参考文献

[1] 陈海松,柳澄.骨膜反应对骨病变的诊断价值[J].中国中西医结合影像学杂志,2020,18(1):104-108.
[2] ZHANG X, AWAD HA, O’KEEFE RJ, et al. A perspective: engineering periosteum for structural bone graft healing. Clin Orthop Relat Res. 2008;466(8):1777-1787.
[3] WU L, GU Y, LIU L, et al. Hierarchical micro/nanofibrous membranes of sustained releasing VEGF for periosteal regeneration. Biomaterials. 2020;227:119555.
[4] 蒋昇源,宫智浩,宋凯凯,等.骨膜在骨折愈合及骨组织修复过程中的作用[J].中国组织工程研究,2020,24(30):4860-4865.
[5] CHEN X, YU B, WANG Z, et al. Progress of Periosteal Osteogenesis: The Prospect of In Vivo Bioreactor. Orthop Surg. 2022;14(9):1930-1939.
[6] LI H, WANG H, PAN J, et al. Nanoscaled Bionic Periosteum Orchestrating the Osteogenic Microenvironment for Sequential Bone Regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(33):36823-36836.
[7] FUKADA E, YASUDA I. On the Piezoelectric Effect of Bone. J Phys Soc Jpn. 2007; 12(10):1158-1162.
[8] HOLLENBERG AM, HUBER A, SMITH CO, et al. Electromagnetic stimulation increases mitochondrial function in osteogenic cells and promotes bone fracture repair. Sci Rep. 2021;11(1):19114.
[9] ZHENG T, HUANG Y, ZHANG X, et al. Mimicking the electrophysiological microenvironment of bone tissue using electroactive materials to promote its regeneration. J Mater Chem B. 2020;8(45):10221-10256.
[10] SAMADI A, SALATI MA, SAFARI A, et al. Comparative review of piezoelectric biomaterials approach for bone tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2022;33(12):1555-1594.
[11] KITSARA M, BLANQUER A, MURILLO G, et al. Permanently hydrophilic, piezoelectric PVDF nanofibrous scaffolds promoting unaided electromechanical stimulation on osteoblasts. Nanoscale. 2019;11(18):8906-8917.
[12] AGHAYARI S. PVDF composite nanofibers applications. Heliyon. 2022;8(11): e11620.
[13] WANG YW, WU Q, CHEN J, et al. Evaluation of three-dimensional scaffolds made of blends of hydroxyapatite and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) for bone reconstruction. Biomaterials. 2005;26(8):899-904.
[14] CHEN WC, HUANG BY, HUANG SM, et al. In vitro evaluation of electrospun polyvinylidene fluoride hybrid nanoparticles as direct piezoelectric membranes for guided bone regeneration. Biomater Adv. 2023;144:213228.
[15] LAKHKAR NJ, LEE IH, KIM HW, et al. Bone formation controlled by biologically relevant inorganic ions: role and controlled delivery from phosphate-based glasses. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(4):405-420.
[16] MA J, ZHAO N, BETTS L, et al. Bio-Adaption between Magnesium Alloy Stent and the Blood Vessel: A Review. J Mater Sci Technol. 2016; 32(9):815-826.
[17] SU Y, COCKERILL I, WANG Y, et al. Zinc-Based Biomaterials for Regeneration and Therapy. Trends Biotechnol. 2019;37(4):428-441.
[18] ZHAO Z, LI G, RUAN H, et al. Capturing Magnesium Ions via Microfluidic Hydrogel Microspheres for Promoting Cancellous Bone Regeneration. ACS Nano. 2021; 15(8):13041-13054.
[19] MIHAILESCU N, STAN GE, DUTA L, et al. Structural, compositional, mechanical characterization and biological assessment of bovine-derived hydroxyapatite coatings reinforced with MgF2 or MgO for implants functionalization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;59:863-874.
[20] MEHRJOU B, DEHGHAN-BANIANI D, SHI M, et al. Nanopatterned silk-coated AZ31 magnesium alloy with enhanced antibacterial and corrosion properties. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;116:111173.
[21] DIOMEDE F, MARCONI GD, FONTICOLI L, et al. Functional Relationship between Osteogenesis and Angiogenesis in Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2020;21(9):3242.
[22] 龚鑫,许燕,周建平,等.β 相 PVDF 纤维膜制备及其工艺参数优化[J].工程塑料应用,2022,50(2):82-87.
[23] WILLERSHAUSEN B, MARROQUIN BB, SCHAFER D, et al. Cytotoxicity of root canal filling materials to three different human cell lines. J Endod. 2000;26(12):703-707.
[24] ZHANG F, REN L F, LIN HS, et al. The optimal dose of recombinant human osteogenic protein-1 enhances differentiation of mouse osteoblast-like cells: an in vitro study. Arch Oral Biol. 2012;57(5):460-468.
[25] WU S, DONG T, LI Y, et al. State-of-the-art review of advanced electrospun nanofiber yarn-based textiles for biomedical applications. Appl Mater Today. 2022;27:101473.
[26] UNNITHAN AR, BARAKAT N, PICHIAH P, et al. Wound-dressing materials with anti-bacterial activity from electrospun polyurethane–dextran nanofiber mats containing ciprofloxacin HCl. Carbohydr Polym. 2012; 90(4):1786-1793.
[27] ZOU B, LIU Y, LUO X, et al. Electrospun fibrous scaffolds with continuous gradations in mineral contents and biological cues for manipulating cellular behaviors. Acta Biomater. 2012;8(4):1576-1585.
[28] YANG Z, YI P, LIU Z, et al. Stem Cell-Laden Hydrogel-Based 3D Bioprinting for Bone and Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:865770.
[29] TANDON B, BLAKER JJ, CARTMELL SH. Piezoelectric materials as stimulatory biomedical materials and scaffolds for bone repair. Acta Biomater. 2018;73:1-20.
[30] SAMADI A, AHMADI R, HOSSEINI SM. Influence of TiO2-Fe3O4-MWCNT hybrid nanotubes on piezoelectric and electromagnetic wave absorption properties of electrospun PVDF nanocomposites. Org Electron. 2019;75:105405.
[31] GUILLOT-FERRIOLS M, RODRIGUEZ-HERNANDEZ JC, CORREIA DM, et al. Poly(vinylidene) fluoride membranes coated by heparin/collagen layer-by-layer, smart biomimetic approaches for mesenchymal stem cell culture. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111281.
[32] SAMADI A, POURAHMAD S. Flexible piezoelectriccum-electromagnetic-absorbingmultifunctional nanocomposites based on electrospun poly (vinylidene fluoride) incorporated with synthesized porouscore-shellnanoparticles. Int J Energ Res. 2020;(13):44.
[33] HAN J, YANG Y, LU J, et al. Sustained release vancomycin-coated titanium alloy using a novel electrostatic dry powder coating technique may be a potential strategy to reduce implant-related infection. Biosci Trends. 2017;11(3):346-354.
[34] HE Y, ZHANG Y, SHEN X, et al. The fabrication and in vitro properties of antibacterial polydopamine-LL-37-POPC coatings on micro-arc oxidized titanium. Colloids Surf B Biointerfaces. 2018;170:54-63.
[35] WANG X, LIU S, LI M, et al. The synergistic antibacterial activity and mechanism of multicomponent metal ions-containing aqueous solutions against Staphylococcus aureus. J Inorg Biochem. 2016;163:214-220.
[36] SHEN X, ZHANG Y, MA P. Fabrication of magnesium/zinc-metal organic framework on titanium implants to inhibit bacterial infection and promote bone regeneration. Biomaterials. 2019;212:1-16. doi:10.1016/j.biomaterials.2019.05.008.
[37] PRASAD AS. Zinc: an antioxidant and anti-inflammatory agent: role of zinc in degenerative disorders of aging. J Trace Elem Med Biol. 2014;28(4):364-371.
[38] CHENG H, MAO L, XU X, et al. The bifunctional regulation of interconnected Zn-incorporated ZrO2 nanoarrays in antibiosis and osteogenesis. Biomater Sci. 2015;3(4):665-680.
[39] PENG F, WANG D, ZHANG D, et al. PEO/Mg-Zn-Al LDH Composite Coating on Mg Alloy as a Zn/Mg Ion-Release Platform with Multifunctions: Enhanced Corrosion Resistance, Osteogenic, and Antibacterial Activities. ACS Biomater Sci Eng. 2018; 4(12):4112-4121.
[40] RUDE RK, GRUBER HE, NORTON HJ, et al. Dietary magnesium reduction to 25% of nutrient requirement disrupts bone and mineral metabolism in the rat. Bone. 2005;37(2):211-219.
[41] ZREIQAT H, HOWLETT CR, ZANNETTINO A, et al. Mechanisms of magnesium-stimulated adhesion of osteoblastic cells to commonly used orthopaedic implants. J Biomed Mater Res. 2002;62(2):175-184.
[42] HU H, ZHANG W, QIAO Y, et al. Antibacterial activity and increased bone marrow stem cell functions of Zn-incorporated TiO2 coatings on titanium. Acta Biomater. 2012;8(2):904-915.
[43] KIM BS, KIM JS, PARK YM, et al. Mg ion implantation on SLA-treated titanium surface and its effects on the behavior of mesenchymal stem cell. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2013;33(3):1554-1560.
[44] 康雯,徐国强,迪丽努尔·阿吉,等.羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性[J].中国组织工程研究,2014,18(34):5466-5472.
[45] NAGANAWA T, ISHIHARA Y, IWATA T, et al. In vitro biocompatibility of a new titanium-29niobium-13tantalum-4.6zirconium alloy with osteoblast-like MG63 cells. J Periodontol. 2004;75(12):1701-1707.
[46] 林红赛,王春仁,王志杰,等.生物材料的细胞生物相容性评价方法的研究进展[J].中国医疗器械信息,2011,17(9):10-14.
[47] 章晓云,陈跃平,宋世雷,等.丝素蛋白/壳聚糖复合支架有良好的细胞相容性与渗透性[J].中国组织工程研究,2020,24(16):2544-2550.
[48] 韩雪,许亦权,李大伟,等.新型矿化胶原膜的体外细胞相容性评价[J].口腔材料器械杂志,2021,30(4):225-229.
[49] SCHOTT NG, FRIEND NE, STEGEMANN JP. Coupling Osteogenesis and Vasculogenesis in Engineered Orthopedic Tissues. Tissue Eng Part B Rev. 2021; 27(3):199-214.

引言

口腔颌面部骨缺损的常见病因是肿瘤、创伤、炎症感染、先天畸形等，目前治疗骨缺损的主要方法是骨移植，因此在骨缺损修复过程中人们关注更多的是骨移植，但忽略了骨膜在成骨中的作用。骨膜是一种致密且高度血管化的结缔组织膜，覆盖整个骨表面的80%以上[1]，在自体骨移植介导的骨修复中，骨膜可以提供超过70%的骨再生贡献[2]，骨膜功能的损伤或丧失会严重延缓骨组织再生的进程，甚至永久性不愈合[3]，因此也肯定了骨膜在骨折后骨再生中的决定性作用[4]。鉴于剥离天然骨膜的高成本和伦理相关问题，开发可模拟骨膜微环境的骨膜替代物、寻找人工骨膜替代天然骨膜材料成为新的研究方向。近年来，人工骨膜的仿生设计受到越来越多的关注，其再现了自然的骨膜细胞微环境，能够促进细胞的增殖、分化和成熟[5-6]，为骨缺损修复材料提供积极的研究意义。
骨的固有特性之一是压电性[7]，生物学电刺激有助于骨修复[8]，近年来压电材料作为骨组织再生的活性生物材料表现出了特别大的潜力[9-10]。目前各种类型的压电聚合物[聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)[11-12]、聚(3-羟基丁酸)[13]、铌酸钾锂[9]]已被引入骨组织工程，其中，PVDF已成为一种具有压电功能的生物相容性材料[14]。研究表明，静电纺丝技术制作的PVDF纤维支架有利于细胞的增殖和生长，具有良好的生物活性、成骨性能及成血管性能，可促进骨再生和伤口愈合[10]，使其成为骨膜修复合适的候选材料。
骨骼的主要组成成分——磷酸钙并不是一种化学性质均匀的物质，而是含有多种微量元素，包含Na+、Mg2+、Zn2+、Si4+、Sr2+、Mn2+等，这些元素在骨骼的形成、生长和修复中起着重要作用[15]。研究表明，微量元素具有促进成骨细胞黏附、控制降解、增加骨传导性能及机械强度特点[16]。相关研究表明，锌离子的加入通过促进碱性磷酸酶活性、细胞外基质矿化和成骨相关基因的表达来促进骨形成[17]，同时锌离子具有一定的抗菌性。通过微流控水凝胶微球捕获镁离子促进松质骨再生[18]，而且镁离子在细胞增殖、成骨和抗菌活性方面亦表现出良好的性能[18-20]。
骨缺损的修复不仅仅是骨组织再生，也是血管再生的过程[21]，所以用于替代丢失或损伤的骨组织和促进新骨形成生物材料的性能取决于它们诱导血管生成和刺激成骨的能力。虽然PVDF的性能很有应用前景，但其疏水和惰性特性导致了各种改性技术的发展。此次研究通过聚多巴胺对PVDF进行亲水改性，在静电纺丝PVDF仿生骨膜的基础上结合锌离子和镁离子，通过静电纺丝技术制作含有Zn2+、Mg2+的PVDF-Mg、PVDF-Zn、PVDF-Zn-Mg压电仿生骨膜，研究复合纤维膜的体外细胞相容性，旨在为骨组织再生领域的应用及研究的提供新的思路和参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计 PVDF压电仿生生物骨膜的体外细胞毒性实验，进行重复测量的方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年7月至2022年8月在新疆医科大学中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂与仪器 PVDF粉末及氯化锌、氯化镁粉末(新疆医科大学中心实验室提供)；胎牛血清、DMEM培养基(Gibco公司，美国)；CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)；CD31抗体、Goat Anti-Rabbit lgG(维百奥公司，中国)；戊二醛固定液、碱性磷酸酶染色液(Solaibio，北京)；荧光倒置显微镜(Leica，德国)；扫描电子显微镜(Jeol，日本)；多功能酶标仪(Thermo公司，美国)。
1.3.2 实验用细胞成骨细胞和血管内皮细胞来自新疆医科大学协同创新中心实验室冻存细胞株，实验使用的细胞均为复苏的三四代细胞，其生长特性、细胞表型均符合成骨细胞和血管内皮细胞的鉴定标准。其中成骨细胞来源于两三天龄的SD大鼠颅骨，血管内皮细胞来源于两三天龄的SD大鼠肾脏。
1.4 实验方法
1.4.1 掺锌镁离子的PVDF压电仿生骨膜的制备称取适量的PVDF粉末，溶于一定比例的丙酮和二甲基甲酰胺混合溶剂中，常温下磁力搅拌器搅拌 4 h，使PVDF完全溶解，将得到的PVDF溶液静置30 min去除气泡；将PVDF溶液移10 mL注射器中，并将其固定在微量注射泵上，针头与注射器连接并接上高压电源的正极，滚筒收集装置连接负极，进行静电纺制备PVDF仿生骨膜[22]。PVDF-Zn、PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg仿生骨膜是在上述步骤中另外加入氯化锌、氯化镁粉末电纺制作而成，其中锌、镁离子的质量分数均为1%。将材料裁剪成1 cm×1 cm大小，高温高压灭菌。
1.4.2 成骨细胞和血管内皮细胞复苏培养将第3代成骨细胞、血管内皮细胞的冻存管从液氮罐里快速取出，在37 ℃水浴锅中溶解，分别逐滴加入含有8-10 mL PBS的15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，其中成骨细胞加入含体积分数10%胎牛血清低糖DMEM培养基，血管内皮细胞加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，均接种于25 mL的细胞瓶中，当细胞铺满培养瓶底部80%-90%时，将细胞悬液根据一传三的原则传至第5代，制成细胞悬液备用。
1.4.3 仿生骨膜与成骨细胞共培养
碱性磷酸酶染色：将4组仿生骨膜平铺于24孔板内，将成骨细胞接种于各组仿生骨膜表面，以单独培养的细胞为对照，细胞浓度为1.6×107 L-1，每孔1 mL，每组3个平行样品，放入培养箱中孵育。培养第7天，显微镜下观察成骨细胞贴壁于瓶底铺满瓶底80%左右时，取出24孔板，弃培养液，缓冲溶液PBS冲洗3次；加入碱性磷酸酶固定液固定3 min，蒸馏水清洗；滴加配置好的碱性磷酸酶孵育液。放入湿盒中避光孵育20 min，蒸馏水清洗，加入甲基绿染色液复染5 min，PBS清洗，置于显微镜下拍照取图。
扫描电镜观察：将4组仿生骨膜平铺于24孔板内，调整成骨细胞浓度为0.5×107 L-1，接种于仿生骨膜表面，每孔1 mL，置于37 ℃的CO2细胞培养箱中培养。培养1，3，5，7 d后，用PBS洗涤3次，固定、脱水、干燥、喷金，置于扫描电镜下观察细胞形态与黏附情况。
CCK-8法检测细胞增殖：将4组仿生骨膜平铺于96孔板内，调整成骨细胞浓度为0.5×107 L-1，接种于仿生骨膜表面，每孔100 μL，以单独培养的细胞为对照，每组3个平行样品，放入培养箱中孵育。培养1，3，5，7 d，每孔加入10 μL CCK-8试剂，在37 ℃的培养箱中培养2 h，在波长为450 nm处用多功能酶标仪检测各孔的吸光度值。根据细胞相对增殖率的等级，来判断材料的毒性[23]，计算公式：细胞相对增殖率=实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值×100%，细胞毒性分级如表1。

1.4.4 仿生骨膜与血管内皮细胞共培养
CD31免疫荧光染色：将4组仿生骨膜平铺在24孔板中，每组3个平行样品，调整血管内皮细胞浓度为1.5×108 L-1，接种于各组仿生骨膜上，每孔1 mL，以单独培养的细胞为对照，每组3个平行样品，放入培养箱中孵育。培养3 d时细胞爬满载玻片约80%，置于2 mL 40 g/L多聚甲醛中固定30 min，加入0.5%Triton-X10通透15 min，加体积分数10%山羊血清室温封闭30 min；按1∶100的比例加CD31抗体，置于4 ℃冰箱中过夜；加二抗(1∶100)50 µL，在37 ℃恒温箱内避光孵育1 h；避光下加DAPI 染色溶液5 µL复染细胞核，避光孵育5 min，置于倒置荧光显微镜下观察拍照取图。
扫描电镜观察：将4组仿生骨膜平铺于24孔板内，调整血管内皮细胞浓度为2.0×107 L-1，接种于各组仿生骨膜表面，每孔1 mL，置于37 ℃的CO2细胞培养箱中培养。培养1，3，5，7 d后，用PBS洗涤3次，固定、脱水、干燥、喷金，置于扫描电镜下观察细胞形态与黏附情况。
CCK-8法检测细胞增殖：将4组仿生骨膜平铺于96孔板内，调整血管内皮细胞浓度为2.0×107 L-1，接种于各组仿生骨膜表面，每孔100 μL，以单独培养的细胞为对照，每组3个平行样品，放入培养箱中孵育。培养1，3，5，7 d，利用CCK-8法检测细胞增殖，方法同上。
1.5 主要观察指标各组仿生骨膜与成骨细胞、血管内皮细胞共培养时，不同时间点的细胞形态、增殖及黏附情况。
1.6 统计学分析运用SPSS 26.0统计软件分析，所得实验数据用x±s表示，行重复测量的方差分析，以 P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法在新疆医科大学公共卫生学院统计教研室指导下完成。

讨论

骨膜是骨表面除关节外所被覆的坚固结缔组织包膜，在骨折后骨重建过程中起决定性作用。随着组织工程骨膜的研究进展，仿生骨膜的研究日趋成熟和可靠。组织工程骨膜的相关研究不仅指导了骨组织工程的发展，也为骨组织治疗的优化提供了可能。目前，多种由静电纺丝技术制备的具有纳米级连续纤维的仿生骨膜已被用于组织的修复，静电纺丝制备的纳米纤维具有与细胞外基质结构相似的高孔隙率和大比表面积的特点，它们可以为细胞黏附提供场所，促进营养物质和废物的运输及细胞的生长增殖[25-27] 。
压电特性通过模拟骨生态位行为在损伤骨的修复和再生中起着至关重要的作用，压电生物材料在骨组织工程中具有重要的应用潜力，压电植入物可能促进骨折修复。在骨缺损损伤部位植入压电材料，通过生理负荷触发电应力诱导电刺激，这种超极化通过细胞膜电压激活钙通道，细胞内Ca2+在细胞增殖中起重要作用，因此可以推断，与非压电材料相比，生物相容性良好生物压电材料可导致受损组织的初始修复[28]。特定聚合物的生物相容性和压电性使其成为组织工程和再生的潜在候选者，特别是骨修复[29]。在压电材料中，PVDF类材料作为合成聚合物具有优异的机械性能、生物相容性和加工性能，具有工程所需的组织性能，特别是压电性能。PVDF具有a、b和c晶体结构，其中a晶体是非压电性的，但b和c晶体结构具有压电性[30]，因此，为了利用压电特性可以增加b相，通过产生最大的细胞刺激来加速骨修复[31]。研究表明，静电纺丝是增加PVDF中b相的一种高性能方法，因为同时施加张力和极化[32]。有研究利用静电纺丝工艺将PVDF与多面寡聚硅倍半氧烷-表没食子儿茶素没食子酸酯(POSS-EGCG)缀合在一起用于骨组织工程，结果表明压电b晶从77.4%提高到88.1%，促进了纳米纤维的压电性、抗炎性和抗氧化性，从而促进了成骨细胞的增殖和分化。
表面修饰是改变种植体生物性能的有效途径，表面性质包括亲水性、粗糙度和化学成分，在细胞和细菌的生长中起着重要作用。从抗菌感染的角度来看，在种植体表面加入抗生素(或抗菌肽)是杀死细菌最有效的方式[33-34]，然而细菌耐药性是一个全球关注的问题，限制了抗生素的应用。另一种有前景的策略是固定或加入金属离子，例如Ag+、Cu2+和Zn2+[35]，Ag+和Cu2+较Zn2+容易引起细胞毒性，此外，适当浓度的Zn2+具有抗炎优势，有利于组织愈合过程[36-37]，因此，Zn2+可能是骨科植入物表面修饰的更好选择[38-39]。理想的骨-种植体界面很大程度上取决于种植体表面的骨导电性和骨诱导性、抑菌性能，关键金属离子等生物活性化学成分有利于成骨细胞的功能和骨髓间充质干细胞的成骨分化。众所周知，锌是骨骼代谢和生成所必需的重要微量元素。此外，镁在成骨和成骨细胞黏附到骨科植入物中起着重要作用，饮食中镁的减少导致骨和矿物质代谢中断[40]。锌或镁已被证明能够促进骨髓间充质干细胞或成骨细胞的初始黏附、增殖和提高碱性磷酸酶活性[41-43]。
人体移植的生物医学材料处于复杂的生理环境中，受物理和自身的影响，任何体内植入材料在临床使用前都必须符合标准的理化性质和生物安全性能。生物安全是指材料与人体之间的相互作用，该材料必须对人体无毒、无过敏、无刺激性、无遗传毒性、无致癌，对人体组织、血液、免疫系统没有不良反应，因此有必要进行严格的生物相容性评价。需要进行生物相容性评价的原因是，可以在一定程度上预测植入材料在接触人体的过程中可能发生的潜在危害，而确保临床应用中的安全性[44]。自20 世纪70年代以来，生物医用材料应用于人体的安全性受到了专家的关注，并制定了生物医学材料的评价标准。国际标准化组织 ISO 对生物相容性的定义：生命有机体组织对非活性材料产生的一种性能 [45] 。
细胞相容性评价是生物材料体外生物相容性评价的一项重要内容，是指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性。细胞毒性实验作为检测生物材料毒性的手段,具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，目前几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有细胞毒性，已被广泛应用于生物相容性评价[46-48]。材料的毒性可以影响细胞器的活性，因此，通过细胞形态学的观察可以为材料毒性评价提供直观证据。细胞是通过蛋白吸附黏附到材料表面，通过吸附的蛋白质层去感受材料的表面性质，从而使得细胞在材料表面延伸、变形、伸出伪足，且进行增殖分化。通过仿生骨膜与成骨细胞和血管内皮细胞的共培养结果，发现细胞贴壁生长、形态正常，随着时间的推移，细胞数目增加，彼此之间紧密相邻。
骨再生的生理过程涉及组织发育、成熟和重塑的协调相互作用，此过程中成骨和血管生成是再造稳定和成熟骨骼的2个关键因素[49]，此次研究对成骨细胞和血管内皮细胞的细胞相容性进行研究。碱性磷酸酶是成骨细胞的表型标志物之一，它可直接反映成骨细胞的活性或功能状况。成骨细胞与仿生骨膜培养第7天时细胞染色呈阳性，有黑色颗粒沉着，细胞形态良好；与对照组相比，4组仿生骨膜上的细胞染色较深。CD31又称为血小板-内皮细胞黏附分子、血管内皮细胞特异性抗体，此次研究更直观地观察了血管内皮细胞在仿生骨膜表面黏附情况，发现细胞形态正常，聚集生长，开始融合，彼此连接；并且成骨细胞和血管内皮细胞在4组仿生生物骨膜上紧密黏附，细胞与仿生骨膜直接接触后生长良好，伸展充分，伪足伸展至空隙内，细胞增殖旺盛，说明4组仿生骨膜均具有良好的细胞相容性，且仿生骨膜的多孔结构为成骨细胞和血管内皮细胞的黏附提供了便利条件。CCK-8法检测细胞增殖毒性结果表明，仿生骨膜分别与成骨细胞和血管内皮细胞共培养时的细胞毒性分级为0级或1级，根据细胞毒性分级标准，表明没细胞有毒性，4组压电仿生骨膜均有良好的细胞相容性。
对于骨缺损修复植入材料的选择，应该从材料形态、力学性能、孔隙率、亲水性、可降解性、安全性、抑菌性等综合考虑，此次研究通过在静电纺丝PVDF压电仿生骨膜中加入Zn2+、Mg2+后观察成骨细胞和血管内皮细胞的变化，发现仿生骨膜均具有良好的细胞相容性。后续还需进一步研究静电纺丝PVDF压电仿生骨膜在压电刺激下对成骨细胞和血管内皮细胞成骨和成血管性能的影响，以及静电纺丝PVDF仿生生物骨膜的抑菌效果，PVDF仿生骨膜材料的压电效应、可持续性及体内植入效果。由于生物材料植入后的宿主免疫反应会调节成骨，从而影响新骨再生的结果，因此，同时了解共植入Zn2+、Mg2+是否以及如何对改善成骨诱导能力产生协同作用至关重要。
综上所述，通过体外细胞相容性实验可知，加入金属Zn2+、Mg2+的PVDF压电仿生生物骨膜有利于成骨细胞和血管内皮细胞的生长，细胞毒性为≤1级，表现出良好的细胞相容性，可以作为一种骨缺损修复有前景的修复材料，为骨组织工程修复骨缺损提供了新的思路，为临床应用和研究打下实验学的基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的细胞相容性

Cytocompatibility of electrospun polyvinylidene fluoride piezoelectric bionic periosteum

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 14

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	代越星, 郑利钦, 吴敏辉, 李志鸿, 李少彬, 郑德声, 林梓凌. 血管数量对小血管网计算流体力学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1206-1210.
[3]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[4]	王武, 樊晓磊, 谢杰, 胡懿郃, 曾敏. 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶修复兔骨软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 682-689.
[5]	兰伟伟, 于耀东, 黄棣, 陈维毅. Mg-Zn-Ca合金的体外降解行为[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 717-723.
[6]	周晓文, 符祖昶, 黄飞, 艾建国, 赵枫. 单平面胫骨骨搬移中骨水泥分段填塞封堵骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 736-740.
[7]	朱礼威, 王江玥, 白丁. 纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中应用的价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 753-758.
[8]	尹彤, 杨吉垒, 李友瑞, 刘卓冉, 姜明. 核壳结构纳米纤维在口腔组织再生中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 766-770.
[9]	王嘉旎, 陈俊宇. 金属离子促血管生成机制及在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 804-812.
[10]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[11]	周世博, 关健斌, 俞兴, 赵赫, 杨永栋, 刘涛. 股骨骨缺损动物模型制备现状及特点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 633-638.
[12]	曾志奎, 熊伟, 梁卫东, 钱国文, 梁超轶, 潘斌, 郭灵, 魏文强, 邱勋祥, 邓文芳, 袁灵梅. 骨碎补总黄酮调控H型血管影响大鼠股骨Masquelet诱导膜模型的骨重建[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5130-5135.
[13]	孔祥宇, 王兴, 裴志伟, 常家乐, 李斯琴, 郝廷, 何万雄, 张葆鑫, 贾燕飞. 生物支架材料及打印技术修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 479-485.
[14]	戴京, 刘沙沙, 沈明敬. 负载外泌体的可注射水凝胶修复种植体周围骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 347-354.
[15]	谷明西, 王常成, 田丰德, 安宁, 郝瑞胡, 郭林. 丝素蛋白/明胶/壳聚糖三维多孔软骨组织支架的制备及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 366-372.