疏调经筋推拿可维持膝骨关节炎软骨损伤兔软骨细胞内环境的稳定

doi:10.12307/2023.819

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5681-5687.doi: 10.12307/2023.819

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疏调经筋推拿可维持膝骨关节炎软骨损伤兔软骨细胞内环境的稳定

郑利君1，王凯1，李牧真1，王建民2，乔英杰1，李华东2

1山东中医药大学，山东省济南市 250014；2山东中医药大学附属医院推拿科，山东省济南市 250014

收稿日期:2022-08-30 接受日期:2022-10-31 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-05
通讯作者: 李华东，博士，主任医师，教授，山东中医药大学附属医院推拿科，山东省济南市 250014
作者简介:郑利君，女，1992年生，汉族，山东中医药大学在读博士，主要从事推拿治疗伤科疾病与内科疾病的研究。
基金资助:
山东省中医药科技项目(2021Q080)，项目负责人：李牧真；齐鲁医派中医学术流派传承项目[鲁卫函(2022)93号]，项目负责人：李华东

Shutiao Jingjin Massage can stabilize intracellular environment of rabbit chondrocytes following knee osteoarthritis-induced cartilage injury

Zheng Lijun1, Wang Kai1, Li Muzhen1, Wang Jianmin2, Qiao Yingjie1, Li Huadong2

1Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2Department of Massage, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2022-08-30 Accepted:2022-10-31 Online:2023-12-18 Published:2023-06-05
Contact: Li Huadong, MD, Chief physician, Professor, Department of Massage, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Zheng Lijun, MD candidate, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine, No. 2021Q080 (to LMZ); Qilu Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project, No. [2022]93 (to LHD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

膝骨关节炎：以膝关节疼痛、肿胀、进而僵硬、变形为主要特征，后期出现膝关节功能障碍甚或下肢畸形。该病主要侵袭关节软骨、软骨下骨以及滑膜组织，甚或累及周围韧带及肌肉组织，关节软骨的损伤退变是其病理学基础。

疏调经筋：膝为筋之府，筋为骨用，通过恢复经筋的正常形态结构及位置、改善经筋的功能，使经筋柔顺，通过柔筋、松筋、强筋达到约束骨骼的作用，使经筋和骨骼同时达到治疗目的。

背景：在前期应用中发现疏调经筋推拿法能有效改善膝骨关节炎的临床症状，但其治疗机制有待验证。
目的：探讨疏调经筋推拿法对膝骨关节炎的干预作用及其可能的作用机制。
方法：34只雄性新西兰兔随机分为空白组(9只)及造模组(25只)，造模组膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液建立膝骨关节炎兔模型。6周后两组各随机挑选1只进行软骨苏木精-伊红染色及Mankin’s 评分，模型评估后，造模组随机分为模型对照组、推拿组及氨糖组，每组8只。推拿组采取“疏调经筋推拿法”，隔日1次；氨糖组采用硫酸氨基葡萄糖胶囊水溶液灌胃，每日1次；共干预4周。干预结束1周后，番红O-固绿染色镜下观察软骨病理形态；Western blot、免疫组织化学染色法检测软骨组织中细胞外信号调节激酶1/2、核转录因子κB p65、Bcl-2、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达水平；ELISA法测定外周血清和关节液中白细胞介素1β的质量浓度。

结果与结论：①软骨切片镜下观察：模型对照组软骨表面缺损、破坏，软骨层变薄，软骨细胞异常簇状聚集，潮线破坏；推拿组软骨表面无明显缺损、破坏，软骨细胞排列基本正常，无明显异常聚集，潮线较规整；氨糖组与模型对照组相比未见明显改善；②与空白组相比，模型对照组细胞外信号调节激酶1/2、核转录因子κB p65、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达水平升高(P < 0.01)，Bcl-2表达降低(P < 0.01)；推拿组兔细胞外信号调节激酶1/2、核转录因子κB p65、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达水平明显低于模型对照组(P < 0.01)，稍低于氨糖组(P < 0.05)；Bcl-2表达明显高于模型对照组(P < 0.01)，稍高于氨糖组(P < 0.05)；③与空白组相比，模型对照组关节液、外周血清中白细胞介素1β质量浓度显著增高(P < 0.01)；与模型对照组相比，推拿组白细胞介素1β质量浓度降低(P < 0.01)；氨糖组白细胞介素1β质量浓度高于推拿组(P < 0.01)；④提示“疏调经筋推拿法”可以抑制软骨退变，延缓膝骨关节炎进展，可能是通过调节白细胞介素1β的分泌及释放、并通过白细胞介素1β与细胞外信号调节激酶1/2-核转录因子κB信号通路相互作用、抑制软骨细胞过度凋亡、维持软骨细胞内环境稳定、修复损伤软骨来实现的。

https://orcid.org/0000-0002-2882-6969(郑利君)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, 疏调经筋, 软骨损伤, 细胞外信号调节激酶1/2, 核转录因子κB, 软骨内环境

Abstract: BACKGROUND: It has been found that Shutiao Jingjin Massage can effectively improve the clinical symptoms of knee osteoarthritis in the early stage, but its treatment mechanism needs to be verified.
OBJECTIVE: To explore the effect of Shutiao Jingjin Massage on knee osteoarthritis and its possible mechanism
METHODS: Thirty-four male New Zealand rabbits were randomly divided into blank group (n=9) and model group (n=25). Rabbit models of knee osteoarthritis were established by injecting 4% papain solution into the knee joint cavity. Six weeks after modeling, one rabbit in each group was randomly selected for cartilage hematoxylin-eosin staining and Mankin’s scoring. After the model evaluation, the model group was randomly divided into model control group (n=8), massage group (n=8) and glucosamine group (n=8). The massage group was treated with Shutiao Jingjin Massage, once every other day; the glucosamine group was given aqueous solution of glucosamine sulfate capsules by gavage, once a day. Interventions in each group lasted 4 weeks. At 1 week after intervention, the pathological morphology of cartilage was observed by safranin O-fast green staining. The expression of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2, nuclear factor-kappa B p65, Bcl-2, Bax, and cysteine-aspartic acid protease-3 in cartilage tissue was detected by western blot assay and immunohistochemistry. The levels of interleukin-1β in peripheral blood and joint fluid were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Cartilage section microscopic observation: the model control group had cartilage surface defect and damage, cartilage layer thinning, abnormal cluster aggregation of chondrocytes, and tidal line damage; in the massage group, there was no obvious damage on the cartilage surface, chondrocyte arrangement was basically normal, no obvious abnormal aggregation occurred, and the tidal line was regular; compared with the model control group, the glucosamine group did not show significant improvement. Compared with the blank group, the expression of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2, nuclear factor-kappa B p65, Bax, and cysteine-aspartic acid protease-3 protein in the model control group was increased (P < 0.01), while the Bcl-2 expression decreased (P < 0.01). The expression levels of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2, nuclear factor-kappa B p65, Bax, and cysteine-aspartic acid protease-3 protein in the massage group were significantly lower than those in the model control group (P < 0.01) and slightly lower than those in the glucosamine group (P < 0.05), while the expression of Bcl-2 was significantly higher than that in the model control group (P < 0.01) and slightly higher than that in the glucosamine group (P < 0.05). Compared with the blank group, the mass concentrations of interleukin-1β in the joint fluid and peripheral blood were significantly increased in the model control group (P < 0.01). Compared with the model control group, the mass concentrations of interleukin-1β in the joint fluid and peripheral blood were significantly decreased in the massage group (P < 0.01). The mass concentrations of interleukin-1β in the joint fluid and peripheral blood were significantly higher in the glucosamine group than the massage group (P < 0.01). To conclude, Shutiao Jingjin Massage can inhibit cartilage degeneration and slow down the progression of knee osteoarthritis, probably by regulating the secretion and release of interleukin-1β, interacting with the extracellular signal-regulated kinase 1/2-nuclear transcription factor κB signaling pathway, inhibiting excessive apoptosis of chondrocytes, maintaining the stability of intracellular environment in chondrocytes and repairing damaged cartilage.

Key words: knee osteoarthritis, Shutiao Jingjin, cartilage injury, extracellular signal-regulated kinase 1/2, nuclear transcription factor κB, cartilage internal environment

中图分类号:

郑利君, 王凯, 李牧真, 王建民, 乔英杰, 李华东. 疏调经筋推拿可维持膝骨关节炎软骨损伤兔软骨细胞内环境的稳定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5681-5687.

Zheng Lijun, Wang Kai, Li Muzhen, Wang Jianmin, Qiao Yingjie, Li Huadong. Shutiao Jingjin Massage can stabilize intracellular environment of rabbit chondrocytes following knee osteoarthritis-induced cartilage injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5681-5687.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 32只新西兰兔分为4组，实验全程无动物脱失，全部进入结果统计分析。
2.2 兔KOA模型鉴定(膝关节软骨组织苏木精-伊红染色法及Mankin’s 评分) 见图1。

苏木精-伊红染色可见，空白组软骨表面规则，软骨细胞形态及排列正常，软骨基质染色正常，潮线完整，软骨层厚度可。造模组软骨表面破坏，软骨细胞数目明显减少，基质染色变浅，潮线破坏，软骨层变薄，提示KOA造模成功。造模组Mankin’s 评分为6.31±0.33，空白组为0.52±0.49，两组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.3 软骨组织大体观察分别从关节间隙、色泽、关节表面质地、关节边缘形态等方面大体观察4组兔膝关节软骨组织形态，详细结果见表2。

2.4 各组兔软骨组织病理染色情况
空白组：软骨表层光滑无异常缺损、破坏，软骨细胞均匀密集排列，呈梭形，软骨与软骨下骨分界清析，潮线清晰规整(图2A)。
模型对照组：软骨表面可见缺损、破坏，软骨层变薄，软骨细胞异常聚集，多呈簇状分布，潮线破坏、不连续(图2B)。
推拿组：软骨表层基质被红染，颜色较模型对照组鲜艳，胶原纤维层被染成绿色，染色范围介于空白组和模型对照组之间，软骨与软骨下骨分界较清晰，潮线较规整，软骨表面无明显缺损、破坏，软骨细胞排列基本正常，无明显异常聚集(图2C)。
氨糖组：关节软骨表面不完整，部分软骨表层可见缺损、破坏，与空白组比较，软骨基质番红染色范围较小，绿染范围较大，潮线分布不规整，与模型对照组相比未见有明显改善(图2D)。

2.5 Western blot检测兔膝关节软骨组织中目的蛋白的表达与空白组相比，模型对照组兔膝关节软骨组织中ERK1/2、核转录因子κB p65蛋白表达水平升高(P < 0.01)；推拿组兔ERK1/2、核转录因子κB p65蛋白表达水平明显低于模型对照组(P < 0.01)，稍低于氨糖组(P < 0.05)，见图3及表3。

与空白组相比，模型对照组兔膝关节软骨组织中Bcl-2蛋白表达减少，Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高(P < 0.01)；推拿组兔Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显低于模型对照组(P < 0.01)，稍低于氨糖组(P < 0.05)；而Bcl-2蛋白表达明显高于模型对照组(P < 0.01)；稍高于氨糖组(P < 0.05)，见图4及表4。

2.6 免疫组化检测结果空白组兔膝关节软骨组织中有少量ERK1/2、核转录因子κB p65表达，主要分布于胞浆、胞核；干预后，与空白组相比，模型对照组兔膝关节软骨组织中ERK1/2、核转录因子κB p65的表达增多，呈深棕色强阳性表达，差异有显著性意义(P < 0.01)；相较于模型对照组，推拿组兔软骨组织中ERK1/2、核转录因子κB p65的表达明显减少(P < 0.01)，呈浅棕色弱阳性表达，其中推拿组较氨糖组减少更加明显(P < 0.05)，见图5。

空白组兔膝关节软骨组织中Bax、Caspase-3少量表达，Bcl-2存在高表达，阳性表达部位主要在软骨细胞的胞质；干预后，与空白组相比，模型对照组兔膝关节软骨组织中Bax、Caspase-3呈深棕色强阳性表达，表达增多(P < 0.01)，Bcl-2表达减少(P < 0.01)；相较于模型对照组，推拿组兔软骨组织中Bax、Caspase-3的表达明显减少(P < 0.01)，Bcl-2表达增多(P < 0.01)，其中推拿组较氨糖组Bax表达减少及Bcl-2表达增多无显著性差异(P > 0.05)，而Caspase-3表达减少差异显著(P < 0.05)，见图6。

2.7 ELISA法检测各组兔关节液、外周血清中白细胞介素1β质量浓度比较关节液、外周血清中白细胞介素1β质量浓度随着病变程度而逐渐升高，干预后白细胞介素1β水平下降。干预结束1周后，与模型对照组相比，推拿组关节液、外周血清中白细胞介素1β质量浓度下降(P < 0.01)，氨糖组白细胞介素1β质量浓度高于推拿组(P < 0.01)，见表5。

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引言

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)以膝关节疼痛、肿胀、进而僵硬、变形为主要特征，后期出现膝关节功能障碍甚或下肢畸形。该病主要侵袭关节软骨、软骨下骨以及滑膜组织，甚或累及周围韧带及肌肉组织，关节软骨的损伤退变是其病理学基础。流行病学显示，国内KOA的患病率可达到8.1%，随着国内社会老龄化趋势加剧，发病率不断攀升，且随着年龄增长，发病人数逐步增加[1-3]。目前，始终没有任何疗法可有效逆转KOA进展[4]。全膝关节置换虽被称为终末期KOA的黄金疗法，然而术后返修、术后感染、无明显疗效等术后现象仍常见[5]。因此，有效延缓KOA进程，避免向终末期进展一直是临床医生研究的重点。国际骨关节炎协会推荐保守治疗是KOA的一线管理方案，凸显出保守治疗在KOA的临床治疗中的重要性[6]。KOA是中医骨伤科优势病种之一，中医药仍是其主要治疗手段，而推拿作为中医保守外治疗法的一种，其疗效已获得指南认可[7]。前期临床治疗中，以中医经典理论——“膝为筋之府”“筋为骨用”为指导、以膝周软组织治疗为重点的推拿治疗方案可有效缓解膝关节疼痛，但其治疗机制不明确。
此次研究通过建立KOA兔模型，以“膝关节旋正法”为核心的“疏调经筋推拿法”为干预手段，以硫酸氨基葡萄糖胶囊(维固力，罗达药厂)溶解后灌胃为对照干预手段，通过观察干预前后关节软骨病理变化，膝关节软骨中细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)、核转录因子κB p65、Bcl-2、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine-aspartic acid specific protease 3，Caspase-3)的表达，周围血清和膝关节液中白细胞介素1β的表达水平，探讨推拿干预KOA可能的作用机制，为临床推拿治疗KOA提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计简单随机对照动物实验，满足正态分布，采用单因素方差分析，否则采用秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2021年11月至2022年3月在山东中医药大学附属医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新西兰兔(普通级)34只，雄性，6月龄，体质量(2.75±0.25) kg，购于济南西岭角养殖繁育中心，动物使用许可证号：SCXK(鲁)2020 0004。饲养于山东中医药大学附属医院动物实验中心，标准单笼饲养，昼夜12 h明暗循环，温度20-24 ℃，空气湿度40%-60%。实验方法经山东中医药大学附属医院伦理委员会审核通过(批准号：2020-29)。
1.3.2 主要试剂与仪器内参GAPDH Rabbit Monoclonal antibody (proteintech，10494-1-AP)；Bcl-2抗体(Bioss，Bs-0032r)；Bax抗体(Bioss，Bs-0127r)；Caspase-3抗体(Bioss，Bs-0081r)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Sparkjade，EC0001)；Rabbit Interleukin 1β ELISA Kit(武汉基因美，JYM0011Rb)；Rabbit Tumor Nerosis Factor α ELISA Kit(武汉基因美，JYM0003Rb)；VELOCITY 18R高速冷冻离心机(Dynamica)；EPOCH微孔板分光光度计(酶标仪)(美国伯腾)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，JB-P5)病理切片机(上海徕卡仪器有限公司 RM2016)；Tanon 5200 Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能科技有限公司)。
1.4 方法

1.4.1 实验造模、分组适应性喂养1周后，按照随机数字表法将34只新西兰兔随机分出9只作为空白组，其余25只制备KOA模型(造模组)。造模组左膝关节剃毛、局部消毒后，分别在第1，4，7天于膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液(0.1 mL/kg)；空白组注射等量0.9%氯化钠溶液。6周后，两组各随机选出1只进行软骨苏木精-伊红染色，并使用Mankin’s评分(包括软骨结构、软骨细胞数量、软骨基质染色情况、潮线完整性)进行模型评估。模型评估成功后，将剩余24只兔随机分为模型对照组、推拿组及氨糖灌胃组(简称氨糖组)。分组及干预方式见表1。

1.4.2 干预
(1)推拿组：以“膝关节旋正法”为核心的“疏调经筋推拿法”。具体操作方法：
第1步：将兔健侧卧位固定，待其安静下肢放松后，以拇、示、中三指拿揉兔患肢前后侧、内外侧的肌群由上而下5 min，肌肉僵硬处重点操作，以兔子不挣扎为度；
第2步：施以膝关节旋正法：双手拇指定于胫骨转子两侧，其余四指从膝后方环绕固定腘窝部，双手同时施加一个相同方向的扭转力，力的方向与膝眼位置较低侧方向一致，同时双掌应与皮肤相对固定不产生摩擦，但皮肤与皮下组织应可产生相对滑动；一名助手同时固定股骨的同时向同一方向旋髌骨；每次手法反复操作3遍，扭转力大小以手下有松动感，但不引起兔子挣扎为度。
(2)氨糖组：硫酸氨基葡萄糖胶囊(维固力，罗达药厂)水溶液(10 mL)灌胃。根据Meeh-Rubner公式换算给药剂量81.75 mg/(kg·d)。
两组均于模型评估成功后同时开始干预。推拿组隔日操作一次，共干预4周；氨糖组每日固定时间灌胃一次，共灌胃4周。其余两组进行相同的抓取与固定，但不做任何干预。手法操作者在实验实施前均经过严格手法培训，保证手法力量大小、频率、节律的一致性。
1.4.3 取材及检测
(1)苏木精-伊红染色法观察兔软骨组织病理形态：造模结束后，空白组及造模组各选择1只兔，采用3%戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔注射过量麻醉处死，打开膝关节腔，截取股骨远端1 cm×1 cm软骨组织，生理盐水洗净，经40 g/L多聚甲醛中固定，脱钙、包埋后用于苏木精-伊红染色。软骨组织切片(4 μm)，脱蜡，苏木精染色，分化，氨水返蓝，伊红染色，再次分化，氨水返蓝，伊红染色，镜下观察、采集图像。
(2)番红O-固绿染色观察兔软骨组织病理形态：干预结束1周后，各组兔以3%戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔注射麻醉后，打开膝关节，截取股骨远端1 cm×1 cm软骨组织，生理盐水洗净，在多聚甲醛中固定，脱钙、包埋后用于番红O-固绿染色及免疫组化检测。软骨组织切片(4 μm)，脱蜡。固绿染色，水洗至无色，1%盐酸乙醇浸泡，水洗。番红染色，四缸无水乙醇快速脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。镜检，图像采集分析。
(3)Western blot检测兔膝关节软骨组织中目的蛋白的表达：切取兔胫骨平台软骨迅速置入液氮中暂存，后-80 ℃冰箱保存用于Western blot检测。软骨组织样本液氮研磨成粉末，冰上裂解，超声后4 ℃过夜裂解，4 ℃离心提蛋白，BCA法测蛋白浓度，电泳分离，PVDF膜转印，加一抗GAPDH(1∶2 000)、ERK1/2(1∶2 000)核转录因子κB p65(1∶500)、Bcl-2和Bax(1∶2 000)、Caspase-3(1∶500)4 ℃孵育过夜，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(1∶5 000)二抗孵育，化学发光、曝光、显影、定影、分析。
(4)免疫组化染色法观察兔软骨组织中目的蛋白的表达：软骨组织冲洗、脱钙、石蜡包埋、切片、脱蜡、PBS冲洗、抗原修复，封闭，分别加一、二抗(GAPDH、ERK1/2、核转录因子κB p65、Bcl-2、Bax、Caspase-3)，稀释比均为1∶200，孵育。PBS冲洗，显色、苏木精复染，梯度脱水、透明、中性树胶封固。镜检，分析。
(5)ELISA检测关节液和外周血清中白细胞介素1β表达：耳缘静脉取血，室温下静置30 min，离心(3 000 r/min，15 min)后，-20 ℃冰箱保存用于ELISA检测。膝关节局部消毒，按照毕氏关节冲洗液抽取方法，抽取约0.5 mL关节液，离心(3 000 r/min，15 min)后，置于-20 ℃冰箱中用于ELISA检测。血清样品设置空白孔、标准品孔及阳性对照孔，依次经过稀释加样，加酶结合物工作液，温育，洗板，显色，终止，结果测定、绘制曲线、计算浓度，数据分析。
1.5 主要观察指标番红O-固绿染色镜下观察软骨病理形态；Western blot、免疫组织化学染色法检测软骨组织组织中ERK1/2、核转录因子κB p65、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平；ELISA法测定外周血清和关节液中白细胞介素1β的表达水平。
1.6 统计学分析应用 SPSS 26.0对数据进行统计学分析，对符合正态分布且方差齐性的计量资料，采用单因素方差分析，不符合者采用非参数检验，对等级资料采用秩和检验，数据以x±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经山东中医药大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

KOA的发病率逐年攀升，但其发病机制仍未完全阐明，其症状以膝周疼痛、关节功能障碍为主[8-9]，因此临床治疗以缓解疼痛、改善膝关节功能为主。KOA属祖国医学“骨痹”范畴。虽属“骨痹”，但《素问》中曾论述“宗筋主束骨而利关节”，且“膝为筋之府”，古亦有“筋为骨用”“筋柔骨正”的理论。部分学者甚至提出筋痹是骨痹发展的主要基础[10]，研究证实揉筋、疏筋可疏通经络，刺激软骨修复，改善软骨退变[11-12]。现代研究认为，推拿作为一种机械力作用于皮肤表面，力量逐渐向内深透，节律性挤压局部组织促进血液循环，致痛物质的浓度随之下降，同时加快新陈代谢，促进组织修复[13]；另外，通过推拿手法可改变异常的病理状态，促进功能恢复。且研究证实，规律性、渐进性的抗阻力运动可以增强肌肉力量、增加骨量[14-15]。生理状态下，膝关节周围肌肉收缩，肌肉收缩产生的力量通过相关“筋”结构传递到“骨”，从而产生关节运动；而同理，推拿手法产生的力学效应亦可通过“筋”结构传递到“骨”结构。KOA易在关节处、肌肉与肌肉及肌肉与骨骼的链接处产生结节点。此次研究推拿干预方案以“膝关节旋正法”为核心，操作时强调辨明内外膝眼上下相对位置、即内外侧关节间隙大小后，被操作者与操作者对抗用力，操作者发力方向与膝眼较低一侧的方向一致，而被操作者与之进行抗阻力运动，使僵紧一侧经筋在旋转牵拉下得到松解。由于KOA兔无法自主抗阻力，故由助手辅助。调筋解结，恢复经筋的正常形态结构及位置、改善经筋的功能，使经筋柔顺，通过柔筋、松筋、强筋达到约束骨骼的作用，使经筋和骨骼同时达到治疗目的。同时旋髌骨可以改善股髌关节节活动度，松解粘连，改善关节周围血循环，营养关节软骨，促进软骨对营养物质的吸收。相对于传统推拿疗法，“疏调经筋推拿法”操作简单、用时短，且避免了关节运动类手法施术时的潜在风险。
白细胞介素1β能够促进软骨细胞发生凋亡，加重炎症反应[16-18]。软骨退变过程中，白细胞介素1β水平升高会导致进行性结构恶化，并通过多种级联作用，如核转录因子κB通路，发挥破坏功能。研究表明，白细胞介素1β刺激软骨细胞后，核转录因子κB通路被激活，通过一系列的级联反应，p65磷酸化进入细胞核中，启动炎症产物、分解代谢酶及凋亡介质等相关调控因子的基因转录[19-23]，细胞过度凋亡。核转录因子κB信号通路活化调节一系列细胞因子表达，导致KOA软骨过度分解代谢，在KOA发生及进展中起关键作用[24-27]。因此，有效抑制炎性因子及核转录因子κB通路激活被认为可能是治疗KOA的潜在靶标。核转录因子κB表达增加亦和MAPK信号通路传导有关，MAPK信号通路激活后，可以诱导核转录因子κB的表达，进而产生炎症因子[28]。MAPK可介导细胞凋亡[29]，ERK1/2通路是MAPK中最为重要的激活途径，研究中发现，通过抑制白细胞介素1β来抑制ERK1/2的激活可延缓骨关节炎进展[30-31]，且在动物模型中得到证实[32]。Bcl-2家族以及Caspase家族共同调控细胞凋亡，Bax和Bcl-2同属于Bcl-2家族，Bax促凋亡，而Bcl-2与Bax相拮抗而抑制细胞凋亡[33]。Bcl-2家族可调控细胞线粒体凋亡途径，Caspase-3作为多种细胞凋亡途径的下游，执行细胞凋亡。据上，ERK1/2-核转录因子κB信号通路的活化参与软骨退变，白细胞介素1β与ERK1/2通路之间互相影响，白细胞介素1β分泌及释放增加，可刺激ERK1/2的活化，通过一系列级联反应，下游的核转录因子κB通路被激活，核转录因子κB活化后除了调节白细胞介素1β的表达外，白细胞介素1β又可激活核转录因子κB信号通路，从而促使KOA发生与发展。
Western blot检测结果说明，治疗后，相较于模型对照组，氨糖组及推拿组ERK1/2、核转录因子κB p65、Bax、Caspase-3表达降低而Bcl-2表达升高；推拿组较氨糖组而言，ERK1/2、核转录因子κB p65、Bax、Caspase-3表达降低、Bcl-2表达升高趋势更为显著。免疫组化结果显示，正常兔膝关节软骨组织中也有ERK1/2、核转录因子κB p65、Bax、Caspase-3少量表达，Bcl-2存在高表达，阳性表达部位主要在软骨细胞的胞浆；当兔膝关节软骨受损，软骨组织内ERK1/2、核转录因子κB p65、Bax、Caspase-3表达反应性增多，而Bcl-2表达反应性减少，软骨细胞过度凋亡，软骨组织加速破坏；经治疗干预后，ERK1/2-核转录因子κB信号通路的活跃受到抑制，KOA兔膝关节软骨组织中ERK1/2、核转录因子κB p65表达降低，Bax、Caspase-3阳性表达减少，Bcl-2阳性表达增高，维持了软骨细胞增殖与凋亡间的稳定，抑制软骨细胞凋亡。ELISA检测结果表明，白细胞介素1β与KOA病变程度呈正相关，空白组含量最低，相较于模型对照组及氨糖组，推拿组白细胞介素1β水平明显降低。
总之，实验结果表明，以“膝关节旋正法”为核心的“疏调经筋推拿法”可以抑制软骨退变，延缓KOA进展，可能是通过调节白细胞介素1β的分泌及释放，并通过白细胞介素1β与ERK1/2-核转录因子κB信号通路相互作用、抑制软骨细胞的过度凋亡、维持软骨细胞内环境稳定、修复损伤软骨组织来实现的。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

疏调经筋推拿可维持膝骨关节炎软骨损伤兔软骨细胞内环境的稳定

Shutiao Jingjin Massage can stabilize intracellular environment of rabbit chondrocytes following knee osteoarthritis-induced cartilage injury

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