负载外泌体的可注射葡聚糖/明胶复合水凝胶修复大鼠椎间盘退变

doi:10.12307/2023.554

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5477-5482.doi: 10.12307/2023.554

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

负载外泌体的可注射葡聚糖/明胶复合水凝胶修复大鼠椎间盘退变

潘玉军，时长江，曹胜，穆怀昭，张义龙，王凯华

承德医学院附属医院，河北省承德市 067000

收稿日期:2022-09-06 接受日期:2022-10-19 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-20
通讯作者: 张义龙，主任医师，科副主任，医学博士，硕士生导师，承德医学院附属医院脊柱外科，河北省承德市 067000
作者简介:潘玉军，男，1984年生，河北省承德市人，满族，硕士，主治医师，承德医学院附属医院，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
承德市科学技术研究与发展计划项目(201801A050)，项目负责人：潘玉军

An injectable dextran/gelatin composite hydrogel loaded with exosomes for repair of rat intervertebral disc degeneration

Pan Yujun, Shi Changjiang, Cao Sheng, Mu Huaizhao, Zhang Yilong, Wang Kaihua

Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China

Received:2022-09-06 Accepted:2022-10-19 Online:2023-12-08 Published:2023-04-20
Contact: Zhang Yilong, Chief physician, MD, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Pan Yujun, Master, Attending physician, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
Chengde Science and Technology Research and Development Program, No. 201801A050 (to PYJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘退变：简单概括就是椎间盘的老化，主要是由于年龄增长、常年劳损、创伤等原因造成的椎间盘髓核脱水，椎间盘失去其正常的弹力与张力，就不足以支撑患者的大幅度活动，还会压迫神经而出现疼痛症状。椎间盘退变是椎间盘突出、椎管狭窄等相关疾病的病理基础，也是导致腰腿疼痛的主要原因之一，已成为世界范围内较突出的公共卫生问题之一。
外泌体：是细胞通过出芽方式分泌到胞外的纳米级囊性小泡，粒径在40-120 nm之间，具有双层膜结构，无免疫原性、无致瘤性，并且含有大量的核酸、蛋白质、脂质和细胞因子等生物活性成分，可参与不同细胞间的信息传递，调控受体细胞的生物学功能。外泌体作为细胞间相互调控的囊泡，主要通过其内容物调控基因的表达及细胞功能，从而延缓甚至逆转椎间盘退变的发生与发展。

背景：外泌体可改善退变椎间盘的炎症微环境，但将单纯外泌体直接注射于退变椎间盘内的局部浓度与一过性地释放不能保证持续的作用，因此单纯的外泌体体内治疗效果有限。
目的：观察负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶修复大鼠退变椎间盘的效果。
方法：提取大鼠骨髓间充质干细胞外泌体。利用Schiff交联反应制备负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶，检测水凝胶的微观结构、弹性模量与体外缓释性能。取60只SD大鼠，采用随机数字表法分为5组，每组12只：A组为正常对照，B、C、D、E组采用经皮穿刺法建立椎间盘退变模型，依次向退变椎间盘内注射PBS、外泌体、葡聚糖/明胶复合水凝胶与负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶，术后8周，分别进行影像学、病理组织学与Western blot检测。

结果与结论：①负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶呈现三维多孔结构，孔隙之间相互连通，孔径为50-200 μm，弹性模量(4.41±0.23) kPa，在体外可持续稳定释放外泌体达20 d以上。②术后8周X射线片显示，与A组比较，B-E组椎间盘高度指数百分比降低(P < 0.05)；与B组比较，C-E组椎间盘高度指数百分比升高(P < 0.05)，其中E组升高最明显。术后8周MRI检查显示，与A组比较，B-E组髓核组织结构均遭到不同程度破坏；与B组比较，C-E组髓核组织结构均得到不同程度改善，其中E组改善最明显。③术后8周的苏木精-伊红染色与番红O 染色显示，B组髓核结构遭到严重破坏，仅含有少量的胶原组织；C-E组髓核结构相较于B组有所改善，其中E组髓核组织结构更细清晰、规则且胶原含量最多。④Western blot检测显示，与A组比较，B-E组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达减少(P < 0.05)；与B组比较，C-E组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达增加(P < 0.05)，其中E组增加最明显。⑤结果表明，将负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶注射至退变椎间盘内，可在一定程度上恢复椎间盘高度与信号强度，恢复组织结构，延缓椎间盘退变。

https://orcid.org/0000-0001-8262-7306(潘玉军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 水凝胶, 外泌体, 复合水凝胶, 动物实验

Abstract: BACKGROUND: Exosomes can improve the inflammatory microenvironment of the degenerated intervertebral disc. However, direct injection of exosomes into the degenerated intervertebral disc at local concentrations and transient release cannot guarantee sustained effects, so the in vivo therapeutic effect of exosomes alone is limited.
OBJECTIVE: To observe the effect of exosome-loaded glucan/gelatin composite hydrogel on repairing rat degenerative intervertebral disc.
METHODS: Exosomes were extracted from bone marrow mesenchymal stem cells of rats. Exosome-loaded dextran/gelatin composite hydrogels were prepared by Schiff crosslinking reaction, and the microstructure and elastic modulus of the hydrogels were detected. Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups, with 12 rats in each group. Group A was the normal control. In groups B, C, D, and E, the intervertebral disc degeneration model was established by percutaneous puncture. PBS, exosomes, glucan/gelatin composite hydrogel and exosome-loaded glucan/gelatin composite hydrogel were injected into the intervertebral disc in turn. At postoperative 8 weeks, imaging, histopathology and western blot assay were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The exosome-loaded glucan/gelatin composite hydrogels presented a three-dimensional porous structure with interconnected pores. The pore size was 50-200 μm, and the elastic modulus was (4.41±0.23) kPa, respectively. The exosomes could be released continuously and stably in vitro for more than 20 days. (2) At 8 weeks after operation, X-ray films exhibited that the intervertebral disc height index percentages of rats in groups B-E were lower than those in group A (P < 0.05). The intervertebral disc height index percentages of rats in groups C, D and E were higher than those in group B
(P < 0.05), of which group E was the most obvious. At 8 weeks after operation, MRI examination showed compared with group A, the tissue structure of nucleus pulposus in groups B-E was damaged to different degrees. Compared with group B, the tissue structure of nucleus pulposus in groups C-E was improved to varying degrees, among which group E had the most obvious improvement. (3) Hematoxylin-eosin staining and saffron O staining at 8 weeks after surgery exhibited that the structure of the nucleus pulposus in group B was severely damaged and only contained a small amount of collagen. Compared with group B, the structure of nucleus pulposus in groups C-E was improved, and the structure of nucleus pulposus in group E was finer, clearer, regular and had the most collagen content. (4) Western blot assay demonstrated that compared with group A, the expression levels of type II collagen and proteoglycan protein in groups B-E were decreased (P < 0.05). Compared with group B, the expression levels of type II collagen and proteoglycan protein in groups C-E were increased (P < 0.05), and those in group E were the most obvious. (5) It is concluded that the dextran/gelatin composite hydrogel loaded with exosomes injected into the degenerative intervertebral disc can restore the intervertebral disc height and intervertebral disc signal intensity, restore the tissue structure, and delay intervertebral disc degeneration to a certain extent.

Key words: intervertebral disc degeneration, hydrogel, exosome, composite hydrogel, animal experiment

中图分类号:

潘玉军, 时长江, 曹胜, 穆怀昭, 张义龙, 王凯华. 负载外泌体的可注射葡聚糖/明胶复合水凝胶修复大鼠椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5477-5482.

Pan Yujun, Shi Changjiang, Cao Sheng, Mu Huaizhao, Zhang Yilong, Wang Kaihua. An injectable dextran/gelatin composite hydrogel loaded with exosomes for repair of rat intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5477-5482.

图/表（结果） 7

2.1 外泌体的提取与鉴定透射电镜下可见实验提取物呈现椭圆或圆形囊泡结构，中空凹陷，与外泌体的形态相符，见图1A；Nanosight纳米颗粒分析仪检测结果显示，实验制备的微泡粒径为(100.38±18.27) nm，与外泌体的粒径范围相符，见图1B；Western Blot检测显示，实验提取物中的外泌体表面标志物TSG101、CD63呈阳性表达，见图1C。

2.2 复合水凝胶的微观形貌、力学性能与体外药物缓释性能扫描电镜下可见葡聚糖/明胶复合水凝胶呈现三维多孔结构，孔隙之间相互连通，孔径为50-200 μm，负载外泌体后复合水凝胶的孔径略微增大，见图2A，B；负载外泌体前后复合水凝胶的弹性模量分别为(4.38±0.56)，(4.41±0.23) kPa，二者比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2C；水凝胶浸泡于PBS中后，第2天即可检测到外泌体的释放，在第6-10天水凝胶较快速地释放外泌体，外泌体累计释放量达到(59.36±9.87)%，此后水凝胶缓释释放外泌体，至第20天时，水凝胶累计释放外泌体的量达到(87.21±2.54)%，见图2D。

2.3 复合水凝胶的动物体内实验
2.3.1 实验动物数量分析 60只大鼠全部进入结果分析。
2.3.2 影像学检查结果通过X射线片检查各组大鼠目标椎间隙高度，计算椎间盘高度指数百分比，见图3。术后1周时，与A组比较，B、C组椎间盘高度指数百分比显著降低(P < 0.05)；与B、C组比较，D、E组椎间盘高度指数百分比显著升高(P < 0.05)。术后8周时，与A组比较，B-E组椎间盘高度指数百分比显著降低(P < 0.05)；与B组比较，C-E组椎间盘高度指数百分比显著升高(P < 0.05)；E组椎间盘高度指数百分比显著高于C、D组(P < 0.05)。

MRI检查显示，术后1周时，A组髓核组织完整，T2信号均匀，B-E组髓核组织结构均遭到不同程度的破坏，T2信号不均匀，MRI指数由高到低为A组>E组>D组>C组≈B组。术后8周时，与B组比较，C-E组髓核组织结构与T2信号均有不同程度改善，MRI指数由高到低为A组>E组>D组≈C组>B组，见图4。

2.3.3 椎间盘病理观察结果见图5。

苏木精-伊红染色显示，A组中细胞和细胞外基质组织良好；B组中髓核结构被破坏，纤维环层片状结构紊乱，退变位点被纤维软骨组织和不同细胞形态的细胞所占据，损伤部位存在大量的瘢痕与纤维结缔组织，椎间盘结构无法辨认；C-E组损伤部位不同程度存在瘢痕和纤维结缔组织，部分椎间盘结构无法辨认，其中E组细胞和细胞外基质结构较C、D组清晰、规则。
番红O染色显示，A组髓核组织完整，含有丰富的胶原组织；B组髓核结构遭到严重破坏，仅见少量的胶原组织；C-E组髓核组织结构破坏程度均轻于B组，胶原含量不同程度地增加，其中以E组髓核组织结构更细清晰、规则且胶原含量最多。
椎间盘组织学评分结果显示，A-E组目标椎间盘组织学评分依次为(4.13±0.15)，(13.02±0.14)，(9.65±0.12)，(10.21±0.18)，(7.08±0.31)分，B-E组评分均高于A组(P < 0.05)，C-E组评分均低于B组(P < 0.05)，E组评分低于C、D组(P < 0.05)。
2.3.4 椎间盘组织Western blot检测检测结果显示，与A组比较，B-E组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达均显著减少(P < 0.05)；与B组比较，C-E组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达均显著增加(P < 0.05)；与C、D组比较，E组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白表达均显著增加(P < 0.05)，见图6。

2.3.5 复合水凝胶的组织相容性由动物实验病理组织学观察结果可知，负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶具有良好的组织相容性。

参考文献

[1] WANG Y, CHE M, XIN J, et al. The role of IL-1β and TNF-α in intervertebral disc degeneration. Biomed Pharmacother. 2020;131:110660.
[2] KIRNAZ S, CAPADONA C, WONG T, et al. Fundamentals of Intervertebral Disc Degeneration. World Neurosurg. 2022;157:264-273.
[3] CHAO-YANG G, PENG C, HAI-HONG Z. Roles of NLRP3 inflammasome in intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(6):793-801.
[4] KOS N, GRADISNIK L, VELNAR T. A Brief Review of the Degenerative Intervertebral Disc Disease. Med Arch. 2019;73(6):421-424.
[5] XU P, GUAN J, CHEN Y, et al. Stiffness of photocrosslinkable gelatin hydrogel influences nucleus pulposus cell propertiesin vitro. J Cell Mol Med. 2021;25(2):880-891.
[6] CHEN W, CHEN H, ZHENG D, et al. Gene-Hydrogel Microenvironment Regulates Extracellular Matrix Metabolism Balance in Nucleus Pulposus. Adv Sci (Weinh). 2019;7(1):1902099.
[7] LI M, LI R, YANG S, et al. Exosomes Derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Prevent Acidic pH-Induced Damage in Human Nucleus Pulposus Cells. Med Sci Monit. 2020;26:e922928.
[8] HE L, HE T, XING J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes protect cartilage damage and relieve knee osteoarthritis pain in a rat model of osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):276.
[9] 甘翼搏,李培,周强,等.不同浓度的葡聚糖/明胶复合水凝胶支架性能表征及其对体外构建组织工程髓核的影响[J].第三军医大学学报,2015,37(8):707-712
[10] LUO L, JIAN X, SUN H, et al. Cartilage endplate stem cells inhibit intervertebral disc degeneration by releasing exosomes to nucleus pulposus cells to activate Akt/autophagy. Stem Cells. 2021;39(4):467-481.
[11] WANG Y, WU Y, DENG M, et al. Establishment of a Rabbit Intervertebral Disc Degeneration Model by Percutaneous Posterolateral Puncturing of Lumbar Discs Under Local Anesthesia. World Neurosurg. 2021;154: e830-e837.
[12] BAI JY, ZHANG YZ, FAN Q, et al. Reactive Oxygen Species-Scavenging Scaffold with Rapamycin for Treatment of Intervertebral Disk Degeneration. Adv Healthc Mater. 2020; 9(3):e1901186.
[13] BOUHSINA N, DECANTE C, HARDEL JB, et al. Correlation between magnetic resonance, X-ray imaging alterations and histological changes in an ovine model of age-related disc degeneration. Eur Cell Mater. 2021;42:166-178.
[14] ZHOU J, WU Y, ZHANG X, et al. Enzyme Catalyzed Hydrogel as Versatile Bioadhesive for Tissue Wound Hemostasis, Bonding, and Continuous Repair. Biomacromolecules. 2021; 22(4):1346-1356.
[15] ZHANG W, BAO B, JIANG F, et al. Promoting Oral Mucosal Wound Healing with a Hydrogel Adhesive Based on a Phototriggered S-Nitrosylation Coupling Reaction. Adv Mater. 2021; 33(48):e2105667.
[16] ZHANG FX, LIU P, DING W, et al. Injectable Mussel-Inspired highly adhesive hydrogel with exosomes for endogenous cell recruitment and cartilage defect regeneration. Biomaterials. 2021;278:121169.
[17] LIN J, WANG Z, HUANG J, et al. Microenvironment-Protected Exosome-Hydrogel for Facilitating Endometrial Regeneration, Fertility Restoration, and Live Birth of Offspring. Small. 2021;17(11):e2007235.
[18] HU J, LU Y, CAI L, et al. Functional compressive mechanics and tissue biocompatibility of an injectable SF/PU hydrogel for nucleus pulposus replacement. Sci Rep. 2017;7(1):2347.
[19] CHRISTIANI T, MYS K, DYER K, et al. Using embedded alginate microparticles to tune the properties of in situ forming poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate bioadhesive hydrogels for replacement and repair of the nucleus pulposus of the intervertebral disc. JOR Spine. 2021;4(3):e1161.
[20] YU L, SUN ZJ, TAN QC, et al. Thermosensitive injectable decellularized nucleus pulposus hydrogel as an ideal biomaterial for nucleus pulposus regeneration. J Biomater Appl. 2020; 35(2):182-192.
[21] ZHU Y, TAN J, ZHU H, et al. Development of kartogenin-conjugated chitosan-hyaluronic acid hydrogel for nucleus pulposus regeneration. Biomater Sci. 2017;5(4):784-791.
[22] GENG X, MO X, FAN L, et al. Hierarchically designed injectable hydrogel from oxidized dextran, amino gelatin and 4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate for tissue engineering application. J Mater Chem. 2012;22(48):25130-25139.
[23] UNAL S, ARSLAN S, KARADEMIR YILMAZ B, et al.Glioblastoma cell adhesion properties through bacterial cellulose nanocrystals in polycaprolactone/gelatin electrospun nanofibers. Carbohydr Polym. 2020;233:115820.
[24] CAZZANELLI P, WUERTZ-KOZAK K. MicroRNAs in Intervertebral Disc Degeneration, Apoptosis, Inflammation, and Mechanobiology. Int J Mol Sci. 2020;21(10):3601.
[25] ZHANG Y, HAN S, KONG M, et al. Single-cell RNA-seq analysis identifies unique chondrocyte subsets and reveals involvement of ferroptosis in human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(9):1324-1334.
[26] SHIM EK, LEE JS, KIM DE, et al. Autogenous Mesenchymal Stem Cells from the Vertebral Body Enhance Intervertebral Disc Regeneration via Paracrine Interaction: An in Vitro Pilot Study. Cell Transplant. 2016;25(10):1819-1832.
[27] Bhujel B, Shin HE, Choi DJ, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes and Intervertebral Disc Regeneration: Review.Int J Mol Sci. 2022;23(13):7306.
[28] FOO JB, LOOI QH, CHONG PP, et al. Comparing the therapeutic potential of stem cells and their secretory products in regenerative medicine. Stem Cells Int. 2021;2021:2616807.
[29] ONO M, KOSAKA N, TOMINAGA N, et al. Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells contain a micro RNA that promotes dormancy in metastatic breast cancer cells. Science signaling. 2014;7(332):ra63.
[30] LIAO Z, LUO R, LI G, et al. Exosomes from mesenchymal stem cells modulate endoplasmic reticulum stress to protect against nucleus pulposus cell death and ameliorate intervertebral disc degeneration in vivo. Theranostics. 2019;9(14):4084-4100.
[31] HU Y, TAO R, WANG L, et al. Exosomes Derived from Bone Mesenchymal Stem Cells Alleviate Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Apoptosis by Inhibiting Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:2310025.
[32] XIAO Q, ZHAO Z, TENG Y, et al. BMSC-Derived Exosomes Alleviate Intervertebral Disc Degeneration by Modulating AKT/mTOR-Mediated Autophagy of Nucleus Pulposus Cells. Stem Cells Int. 2022;2022:9896444.
[33] ZHU L, SHI Y, LIU L, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes ameliorate nucleus pulposus cells apoptosis via delivering miR-142-3p: therapeutic potential for intervertebral disc degenerative diseases. Cell Cycle. 2020;19(14):1727-1739.
[34] QIAN J, WANG X, SU G, et al. Platelet-rich plasma-derived exosomes attenuate intervertebral disc degeneration by promoting NLRP3 autophagic degradation in macrophages. Int Immunopharmacol. 2022;110:108962.

引言

椎间盘退变简单概括就是椎间盘的老化，主要是由于年龄增长、常年劳损、创伤等原因造成椎间盘髓核脱水，椎间盘失去其正常的弹力跟张力，就不足以支撑患者的大幅度活动，还会压迫神经而出现疼痛症状。椎间盘退变是椎间盘突出、椎管狭窄等相关疾病的病理基础，也是导致腰腿疼痛的主要原因之一，已成为世界范围内较突出的公共卫生问题之一[1-2]。椎间盘退变的发病机制复杂且尚不明确，包括非生理性机械压力、遗传易感性、衰老、激素、不良生活方式及椎间盘营养失衡等在内的多种因素均可诱发椎间盘退变[3-4]。目前的保守治疗(卧床休息、服用药物、理疗等)与手术治疗(开窗髓核摘除术、脊柱融合术)虽可一定程度地缓解病痛，但无法完全恢复椎间盘的生物完整性和生物力学性能，治疗效果均有限。因此，寻找减缓甚至逆转椎间盘退变的方法，一直是该领域的研究热点之一。
椎间盘退变主要起源于髓核的退变，所以治疗椎间盘退变的关键即是修复退变的髓核。水凝胶具有与髓核相似的结构，并且具有良好的细胞相容性与亲水性，可为细胞提供营养供应与代谢物质交换的通道，是髓核组织工程良好的支架材料[5-6]。但是，水凝胶缺乏必要的生物活性成分。外泌体是细胞通过出芽方式分泌到胞外的纳米级囊性小泡，粒径在40-120 nm之间，具有双层膜结构，无免疫原性、无致瘤性，并且含有大量的核酸、蛋白质、脂质和细胞因子等生物活性成分，可参与不同细胞间的信息传递，调控受体细胞的生物学功能。外泌体作为细胞间相互调控的囊泡，主要通过其内容物调控基因的表达及细胞功能，从而延缓甚至逆转椎间盘退变的发生与发展。LI等[7]研究表明，间充质干细胞来源的外泌体促进软骨细胞胞外基质、Ⅱ型胶原和聚蛋白多糖的表达，通过下调基质降解酶降低基质降解，保护髓核细胞免受酸性pH值诱导的细胞凋亡。外泌体通过促进髓核细胞增殖、抑制髓核细胞凋亡/焦亡与椎间盘异常血管增生以及炎性因子的产生而增加有活性髓核细胞的数量，改善椎间盘的炎症微环境。以往的研究大多是将外泌体直接应用于退变椎间盘内，然而单纯的外泌体治疗在体内的治疗效果有限，因为外泌体的局部浓度与一过性地释放不能保证持续的作用，因此，亟需开发一种模拟细胞外基质的3D支架充当有效的载体。基于此，作者认为水凝胶负载外泌体可能是椎间盘退变治疗的良好选择。
该实验由大鼠骨髓间充质干细胞分离提取外泌体，将其负载于葡聚糖/明胶复合水凝胶后注射至大鼠退变椎间盘内观察修复效果，以期为后期的临床应用提供一定的实验室数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组样本比较采用ANOVA程序进行单因素方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Kruskal-Wallis法。
1.2 时间及地点实验于2022年1-7月在承德医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂与仪器大鼠骨髓间充质干细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM/F12培养基(北京伊诺凯科技有限公司)；葡聚糖(湖北科沃德化工有限公司)；明胶(江苏采薇生物科技有限公司)；高碘酸钠(上海高信化玻仪器有限公司)；TSG101、CD63抗体(欣博盛生物科技有限公司)；Ⅱ型胶原、蛋白聚糖抗体(南京森贝伽生物科技有限公司)；Nanosight纳米颗粒分析仪(英国Malvern公司)；透射电镜(北京欧波同光学技术有限公司)；小动物MRI机(苏州纽迈分析仪器股份有限公司)；X射线机(南京普爱医疗设备股份有限公司)；超速离心机(广州硕谱生物科技有限公司)；扫描电镜(北京欧波同光学技术有限公司)；材料试验机(上海松顿仪器制造有限公司)。
1.3.2 实验动物选取60只雄性SD大鼠，8周龄，体质量200-230 g，购自承德医学院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK(冀)2022-002。采用随机数字表法将大鼠分成A、B、C、D、E组，每组12只。动物实验已通过承德医学院动物实验中心伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞外泌体的提取[8] 复苏冻存的大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到含10 mL完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基)的T75培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。第2天，更换培养基以去除未贴壁细胞。待细胞生长较为密集后，用0.25%胰酶消化细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的培养液终止消化，按 1∶3 进行传代培养。选取第3-6代骨髓间充质干细胞进行后续实验。每3 d更换一次培养基。当细胞密度达到 80%时，更换为无血清的DMEM/F12培养基。48 h后收集培养基，300×g离心10 min 以去除细胞；取上清，2 000×g离心20 min，以去除死细胞及一些亚结构；取上清，10 000×g离心1 h，以去除凋亡小体及微小囊泡；取上清，0.22 μm滤网过滤，去除大于200 nm的物质；将滤液置入超速离心机，4 ℃下120 000×g 离心12 h，弃上清，以适量PBS重悬。-80 ℃分装保存或直接用于实验。
1.4.2 外泌体的鉴定使用Nanosight纳米颗粒分析仪检测外泌体PBS悬液，并使用NTA检测分析软件测量分析外泌体粒径。使用投射电镜观察外泌体的形态，将5 μL重悬外泌体溶液滴加到100目载样铜网上，室温静置10 min，然后用磷钨酸钠溶液滴到铜网上负染1 min，用滤纸吸去余液，将铜网放置在透射电镜下，电压调至80 kV，观察外泌体形态。采用Western Blot检测外泌体标志物TSG101和CD63的表达情况(具体检测方法见1.4.6部分)。
1.4.3 葡聚糖/明胶复合水凝胶的制备[9] 将10 g的葡聚糖粉末加入100 mL水中，37 ℃下磁力搅拌6 h使其完全溶解；将一定量的高碘酸钠溶解于水中溶液滴加到葡聚糖溶液中，室温下避光孵育6 h；加入1 mL二乙二醇搅拌15 min，终止反应；将产物置于透析袋中透析3 d，置于塑料培养皿中，超低温冰箱冷冻后置于冷冻干燥器中抽干，保存于真空干燥器内，得氧化葡聚糖。
将10 g的明胶粉末加入于100 mL PBS中，37 ℃下磁力搅拌6 h使其完全溶解；加入14.5 mL的乙二胺，磁力搅拌均匀，以浓盐酸调节pH值为5.0，磁力搅拌6 h，冷却至室温；置入透析袋中透析3 d，每天换水4次；置于塑料培养皿中，超低温冰箱冷冻后置于冷冻干燥剂中抽干，保存于真空干燥器内，得氨基化明胶。
取一定量的氧化葡聚糖与氨基化明胶，分别溶解于PBS中，37 ℃下磁力搅拌6 h使其完全溶解，得到100 g/L的葡糖溶液与200 g/L的明胶溶液，静置30 min后滤菌器抽滤除菌，4 ℃保存待用。将葡聚糖溶液与明胶溶液按照3∶5的质量比混合，37 ℃水浴孵育30 min，得到葡聚糖/明胶复合水凝胶。扫描电镜下观察复合水凝胶的内部结构。
1.4.4 负载外泌体复合水凝胶的制备将葡聚糖溶液与明胶溶液按照3∶5的质量比混合后，加入外泌体，其中外泌体的质量浓度为40 μg/mL[10]，37 ℃水浴孵育30 min，得到负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶。取负载外泌体前后的复合水凝胶，放入PBS中浸泡24 h，测量样本厚度，置于材料试验机中进行压缩测试，压缩速率为1 mm/min，计算样品弹性模量。每种样品设置3个平行样。
1.4.5 复合水凝胶中外泌体的释放将负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶放入96孔板内，每孔100 µL，每孔加入150 µL的PBS，在37 ℃条件下置于摇床中振荡，振荡速率为75 r/min，设置相应的采样时间点，每孔吸取100 µL的PBS，离心后取上清液，检测吸光度值，计算外泌体累计释放率。每次取样后再充新鲜的100 µL PBS。每种样品设置3个平行样。
1.4.6 复合水凝胶的动物体内实验
椎间退变造模与实验动物分组处理：A组大鼠为正常对照，不进行任何处理。取B、C、D、E组大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥50 mg/kg，麻醉生效后备皮，通过触诊找到Co7/8、Co8/9椎体，使用20G针头，限深5 mm，从椎间盘正上方垂直刺入髓核中心部位并旋转360°，持续30 s[11]。造模后，B组向造模节段注射10 μL的PBS，C组向造模节段注射10 μL的外泌体(40 μg/mL)，D组向造模节段注射10 μL的未负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶，E组向造模节段注射10 μL的负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶。将 SD大鼠放置于饲笼自然苏醒，自由饮食水，观察SD大鼠死亡及并发症发生情况。如造模期间有大鼠死亡，则给予补充造模，保证每组12只大鼠。
影像学检查：术后1，8周，麻醉大鼠后置于检测平台，调整X射线光源对准目标椎间盘，拍摄并获取图片，参照以往文献方法计算椎间盘高度指数[12]，进而计算椎间盘高度指数百分比(术后椎间盘高度指数/术前椎间盘高度指数)。将大鼠置于MRI平台上并扫描目标椎间盘，进行矢状面T2加权信号扫描，扫描参数为：TR/TE=5 400 ms/236 ms，层厚1.6 mm，矩阵320×9 256。利用Vue PACs软件检测目标椎间盘髓核面积与对应的信号强度，采用MRI指数评估椎间盘退变程度。
病理观察：术后8周影像学检查结束后，过量麻醉处死大鼠，在Co7和Co8椎体中央用咬骨钳剪断，在剪骨时避免过度牵拉或挤压对椎间盘结构产生影响。浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定7 d，置于脱钙液中脱钙30 d，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(片厚4 μm)，进行苏木精-伊红染色与番红O染色。采用改良的组织学评分进行组织学评价[13]，通过全面评估纤维环、髓核组织的细胞结构和形态，以及纤维环和髓核组织边界来确定椎间盘退变程度。该评估量表基于椎间盘结构上的纤维环和髓核结构进行评估，评分范围0分(每类0分)为正常椎间盘，15分(每类3分)为严重椎间盘退变。
Western blot检测：术后8周，取退变椎间盘组织(1.4.2中的细胞、外泌体)，检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖蛋白的表达。加入细胞或组织裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，提取上清液，置于-80 ℃下保存；利用BCA法检测进行蛋白定量检测；制备凝胶板→配制分离胶→配制浓缩胶→电泳(120 V，1.5 h)→转膜(100 V，2 h)→脱脂牛奶封闭2 h→加入一抗(TSG101、CD63抗体，稀释比1∶ 1 000；Ⅱ型胶原、蛋白聚糖抗体，稀释比1 ∶ 1 000、1 ∶ 10 000)4 ℃孵育过夜→加入二抗(稀释比1∶ 1 000)避光孵育2 h→显色成像。
1.5 主要观察指标各组大鼠退变椎间盘影像学检查、病理观察与Western blot检测结果。
1.6 统计学分析实验所得数据应用SPSS 23.0软件包进行统计学分析，计量资料采用x±s表示，多组样本比较采用ANOVA程序进行单因素方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Kruskal-Wallis法；P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经承德市承德医学院附属医院生物统计学专家审核。

讨论

近年来，水凝胶材料因其优良的生物性能与多种多样的交联方式被广泛应用于医学修复、再生领域，例如：口腔颌面部、椎间盘替代、骨关节面修复等[14-19]，是组织工程和再生医学的重要研究方向。水凝胶固有的亲水性使其具有吸水膨胀及水化的特点，且易于修饰，可体现出与不同生物组织相似的机械与润滑性质，并且具有微创修复组织的能力，还可均匀包裹细胞、传递生物分子与药物，在椎间盘髓核组织再生与修复中得到了广泛应用[20-21]。作为天然的聚合材料，葡聚糖与明胶具有良好的生物相容性、完全可降解性及低免疫原性等优点，均是组织工程常用的材料。明胶是胶原蛋白多级的水解产物，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)重复序列，为细胞的生长提供黏附位点，具有良好的细胞黏附性，并可促进细胞生长[22-23]；葡聚糖具有与软骨细胞外基质氨基葡聚糖相似的结构，将其与明胶复合可模拟软骨的基质成分。实验结果显示，葡聚糖/明胶复合水凝胶呈现三维多孔结构，孔隙之间相互连通，孔径为50-200 μm，可为内部细胞提供养分供应与代谢物质交换的通道，可以在应力作用下保持三维结构的完整性。
椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板组成。凝胶状的髓核组织细胞密度低，细胞外基质主要包括Ⅱ型胶原和蛋白多糖，蛋白多糖(主要为聚集蛋白聚糖和透明质酸)可维持椎间盘水分，保持椎间盘高度，缓冲脊柱的轴向负荷。研究表明，椎间盘退变的发病机制与过度的炎症反应、细胞外基质的异常分解代谢、细胞凋亡密切相关[24-25]。大量的研究证实，间充质干细胞的旁分泌作用在椎间盘退变的修复与再生中发挥了重要作用[26-27]。间充质干细胞的旁分泌作用能够以细胞外囊泡的方式分泌产生大量生物活性因子(生长因子、细胞因子、趋化因子及外泌体等)并作用于邻近的细胞，这些因子在关键生物学过程的调节中起着重要作用[28]。人体大部分细胞均可释放外泌体，外泌体来源于细胞内，主要是由细胞膜内陷形成的多泡体与细胞膜融合，向外释放其包含的囊泡，这些囊泡即是外泌体。外泌体是干细胞条件培养液发挥主导作用的物质[29]。与使用间充质干细胞移植治疗相比较，间充质干细胞外泌体性质更加稳定、容易储存、无排斥反应、无致瘤性，可能成为弥补传统干细胞治疗方法在椎间盘退变修复中不足的理想替代物。外泌体可通过促进髓核细胞增殖、抑制髓核细胞凋亡与焦亡、抑制椎间盘异常血管增生、抑制炎症反应来增加有活性髓核细胞的数量，促进细胞外基质合成，进而改善椎间盘的炎症微环境，延缓甚至逆转椎间盘退变。LIAO等[30]的研究发现，外泌体通过自分泌机制激活HIF-1α/Wnt信号通路增加GATA4和转化生长因子β1的表达，从而促进软骨终板来源干细胞向椎间盘的迁移和向髓核细胞的转化，抑制椎间盘退变。HU等[31]研究显示，外泌体通过抑制氧化应激来减轻应激介导的髓核细胞凋亡。据报道，在椎间盘退变修复中，外泌体可通过调控AKT、ERK、MAPK通信号通路发挥抗炎、抗细胞凋亡作用[10，32-34]。
实验结果显示，造模后大鼠目标椎间盘持续下降，髓核细胞与细胞外基质显著减少，髓核结构异常；造模早期，单纯的水凝胶组与负载外泌体水凝胶组椎间盘高度与T2信号值明显好于模型组，说明葡聚糖/明胶复合水凝胶具有良好的机械性能，可以缓冲椎间盘上的压力，在一定程度上起到延缓椎间盘退变的作用。单纯的外泌体组经过一定时间的治疗后也可部分恢复椎间盘高度、增加细胞外基质、恢复髓核结构，但其治疗效果不如负载外泌体水凝胶组，主要原因可能为：具有亲水性交联网络的葡聚糖/明胶复合水凝胶，不但可以为细胞生长提供支架作用，其降解产物还在一定程度上改善局部微环境，为细胞生长、分化及细胞外基质合成创造有利条件，有待后续实验进一步证实；并且负载外泌体水凝胶组可以持续地释放外泌体，促进髓核细胞的增殖并分泌细胞外基质，因此在造模后期椎间盘高度与T2信号值要明显好于水凝胶组。
综上所述，将负载外泌体的葡聚糖/明胶复合水凝胶注射至退变椎间盘内，可在一定程度上恢复椎间盘高度与椎间盘信号强度，恢复组织结构，延缓椎间盘退变，为椎间盘退变治疗提供了一种潜在的组织工程学方法。但是，研究依然存在很多的局限性：在实验周期内，大鼠处于生长期，其生长期与椎间盘退变之间的关系需要进一步明确；鼠尾椎间盘是非承重椎间盘，未能完全模拟人体椎间盘力学环境；无法进行疼痛及功能等的行为学评分；另外，外泌体成分复杂，包含多种蛋白质、脂质、RNA、mRNA、miRNA 等，还需进一步了解各种成分的作用时机和作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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椎间盘退变主要起源于髓核的退变，所以，治疗椎间盘退变的关键即是修复退变的髓核。水凝胶具有与髓核相似的结构，并且具有良好的细胞相容性与亲水性，可为细胞提供营养供应与代谢物质交换的通道，是髓核组织工程良好的支架材料。但是，水凝胶缺乏必要的生物活性成分。外泌体是细胞通过出芽方式分泌到胞外的纳米级囊性小泡，粒径在40-120 nm之间，具有双层膜结构，无免疫原性、无致瘤性，并且含有大量的核酸、蛋白质、脂质和细胞因子等生物活性成分，可参与不同细胞间的信息传递，调控受体细胞的生物学功能。外泌体作为细胞间相互调控的囊泡，主要通过其内容物调控基因的表达及细胞功能，从而延缓甚至逆转椎间盘退变的发生与发展。研究已证实，LI等研究表明，间充质干细胞来源的外泌体促进软骨细胞胞外基质、II型胶原和聚蛋白多糖的表达，通过下调基质降解酶降低基质降解，保护髓核细胞免受酸性pH值诱导的细胞凋亡。外泌体通过促进髓核细胞增殖，抑制髓核细胞凋亡/焦亡、椎间盘异常血管增生以及炎性因子的产生而增加有活性髓核细胞的数量，改善椎间盘的炎症微环境。以往的研究大多是将外泌体直接应用于退变椎间盘内，然而，单纯的外泌体治疗在体内的治疗效果有限，因为外泌体的局部浓度与一过性地释放不能保证持续的作用，因此，亟需开发一种模拟细胞外基质的3D支架充当有效的载体。基于此，作者认为水凝胶负载外泌体可能是椎间盘退变治疗的良好选择。此次实验由骨髓间充质干细胞分离提取外泌体，将其负载于葡聚糖/明胶复合水凝胶后注射至大鼠退变椎间盘内，观察修复效果，以期为后期的临床应用提供一定的实验室数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载外泌体的可注射葡聚糖/明胶复合水凝胶修复大鼠椎间盘退变

An injectable dextran/gelatin composite hydrogel loaded with exosomes for repair of rat intervertebral disc degeneration

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[1]	农复香, 蒋志雄, 李英豪, 许文聪, 施智兰, 罗慧, 张晴朗, 钟爽, 唐梅文. 外泌体调控铁死亡在疾病诊断治疗中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-10.
[2]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 颈椎矢状力线参数与颈椎间盘退变患者退变节段及Pfirrmann分级的关联性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1319-1324.
[3]	潘钟杰, 秦志鸿, 郑铁军, 丁晓飞, 廖世杰. 股骨头坏死发病机制中非编码RNA的靶标性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1441-1447.
[4]	练诗林, 张燕, 蒋强, 张晗硕, 李土胜, 丁宇. 全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1199-1204.
[5]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[6]	李诚, 郑国爽, 蒯贤东, 于炜婷. 海藻酸盐支架修复关节软骨[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1080-1088.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[9]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[10]	张厚君, 邓博文, 蒋昇源, 赵毅, 任敬佩, 徐林, 穆晓红. 脑性瘫痪儿童脑脊液内外泌体的蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 903-908.
[11]	高婷, 马小红, 李晓荣. 三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 860-865.
[12]	袁博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[13]	许其静, 杨伊春, 雷微, 杨莹, 余江, 夏婷婷, 张萌, 章涛, 张潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[14]	陈冠廷, 张琳琪, 李清茹. 外泌体miRNA对慢性肾脏病诊断价值的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 970-976.
[15]	熊治林, 孙红, 刘淼, 庄勇. 铁死亡在椎间盘退变和骨关节炎中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5884-5890.