沉默 MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞 HEK-293T增殖及凋亡的影响

doi:10.12307/2023.165

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3838-3844.doi: 10.12307/2023.165

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沉默 MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞 HEK-293T增殖及凋亡的影响

张艺1，吴道秋1，汤弘婷1，李梦醒2，刘虹麟3，陈忠良4，李琴山1，5

贵州医科大学，1医学检验学院临床生物化学教研室，4组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院，2血液科，5贵州省产前诊断中心，贵州省贵阳市 550004；3北京中日友好医院临床医学研究所，北京市 100000

收稿日期:2022-05-05 接受日期:2022-06-08 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-19
通讯作者: 李琴山，博士，博士生导师，教授，贵州医科大学医学检验学院临床生物化学教研室，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院贵州省产前诊断中心，贵州省贵阳市 550004
作者简介:张艺，女，1996年生，贵州省遵义市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事结直肠癌的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960476，81460365)，项目负责人：李琴山；国家自然科学基金(81760039)，项目负责人：李梦醒；国家自然科学基金(81402451，82173378)，项目负责人：刘虹麟；贵州省科技厅资助项目( [2019]1270)，项目负责人：李琴山；贵州省科技厅资助项目( [2020]4Y160)，项目负责人：李梦醒；贵州省卫生健康委基金(gzwkj2021-160)，项目负责人：李梦醒

Effect of MKRN1 silencing on proliferation and apoptosis of human embryonic kidney cells HEK-293T

Zhang Yi1, Wu Daoqiu1, Tang Hongting1, Li Mengxing2, Liu Honglin3, Chen Zhongliang4, Li Qinshan1, 5

1Department of Clinical Biochemistry, School of Medical Laboratory Science, 4Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Department of Hematology, 5Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 3Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100000, China

Received:2022-05-05 Accepted:2022-06-08 Online:2023-08-28 Published:2023-01-19
Contact: Li Qinshan, MD, Doctoral supervisor, Professor, Department of Clinical Biochemistry, School of Medical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zhang Yi, Master candidate, Department of Clinical Biochemistry, School of Medical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 81960476 (to LQS), 81460365 (to LQS), 81760039 (to LMX), 81402451 (to LHL), and 82173378 (to LHL); grants from Guizhou Provincial Science and Technology Department, Nos. [2019]1270 (to LQS) and [2020]4Y160 (to LMX); the Foundation of Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwkj2021-160 (to LMX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

四环素调控(Tet-on)系统：四环素调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上四环素抗性操纵子为基础而建立的。Tet-on系统通过添加四环素或其衍生物如强力霉素激活目的基因的表达。当环境中不存在强力霉素时，目的基因不被表达；而当存在强力霉素时，目的基因能够得到表达。该系统最大的优势是能够可逆地诱导基因表达。
环指蛋白1(Makorin ring finger protein 1，MKRN1)基因：位于7号染色体长臂，cDNA全长1 449 bp，编码长度为482个氨基酸的蛋白质，主要分布在细胞核，在不同物种间高度保守，是RING finger家族中新发现的一种泛素连接酶。

背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长，但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达，持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应，利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势，且可规避上述缺点，对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。
目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体，研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。
方法：采用RNAi技术，针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1，sh2，sh3)，将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列；通过三质粒系统转染HEK-293T细胞，并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养，进行慢病毒包装，收取48 h及72 h病毒液，将其浓缩后感染HEK-293T细胞，感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率；Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功；通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。

结果与结论：①设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3)，均成功连入Tet-on载体，且各组载体序列正确；通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞；②实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P < 0.05)，且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复；③集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P < 0.05)；Western blot检测敲低MKRN1后，增殖细胞核抗原表达下调，细胞凋亡相关指标BAX表达增加，Bcl2表达下调，Bcl2/BAX的比值下调(P < 0.001)；④结论：采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株，且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖，并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础，也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。

https://orcid.org/0000-0002-3468-7117(张艺)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: MKRN1基因, 四环素诱导调控表达系统, 基因表达调控, 慢病毒

Abstract: BACKGROUND: It has been reported that makorin ring finger protein 1 (MKRN1) knockdown can inhibit the growth of tumor cells, but whether MKRN1 plays a role in the body as a tumor-related protein needs further study. The siRNA-mediated gene silencing is transient, and therefore, the duration is short and the conventional lentivirus technique also has an off-target effect. A cell line stably silencing MKRN1 gene constructed using Tet-on lentivirus system has reversible advantages and can avoid the above shortcomings, which is of great significance for the further study on the biological function of MKRN1.
OBJECTIVE: To construct a MKRN1 gene silencing vector mediated by the Tet-on lentivirus system in order to study the effect of MKRN1 gene silencing on the proliferation and apoptosis of human embryonic kidney cells HEK-293T.
METHODS: Using RNAi technique, three short hairpin RNAs (shRNAs) were designed for MKRN1 gene, namely sh1, sh2, and sh3, and three shRNA sequences were ligated into tetracycline-induced expression vector pTripz. The correct sequence was verified by sequencing. HEK-293T cells were transfected with the three-plasmid system and cultured in the complete medium containing 1 mg/L doxycycline for lentivirus packaging. The virus solution was collected at 48 and 72 hours and concentrated to infect HEK-293T cells. Forty-eight hours after infection, the virus infection efficiency was observed by fluorescence microscope. The knockout efficiency of MKRN1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and western blot assay. The successful construction of tetracycline-induced expression system was detected by western blot assay. Colony formation test and western blot assay were used to detect the effect of silencing MKRN1 expression on the proliferation and apoptosis of HEK-293T cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Three MKRN1-shRNAs, named sh1, sh2, and sh3, were successfully inserted into the Tet-on vector, and the sequence of each vector was correct. HEK-293T cells were successfully transfected with lentivirus. (2) RT-qPCR and western blot results indicated that the MKRN1 knockdown level of the first sequence of the three shRNA sequences was significantly decreased (P < 0.05), and the expression of the target gene was rescued in the silent group without doxycycline induction. (3) The proliferation of HEK-293T cells decreased after MKRN1 silencing detected by colony formation experiments (P < 0.05). Western blot assay results revealed that after MKRN1 knockdown, the expression of proliferating cell nuclear antigen was down-regulated, the expression of BAX was increased, the expression of Bcl2 was down-regulated, and the Bcl2/BAX ratio was down-regulated (P < 0.001). (4) To conclude, the HEK-293T cell line stably silencing MKRN1 can be constructed by using Tet-on lentiviral vector system, and the silencing of MKRN1 can inhibit the proliferation of HEK-293T cells and promote their apoptosis. The construction of stably silencing MKRN1 HEK-293T cells can lay a foundation for the further study on the biological function of MKRN1 and also provide a methodological reference for the study of the biological function of other genes.

Key words: MKRN1, tetracycline inducible expression system, gene expression regulation, lentivirus

中图分类号:

张艺, 吴道秋, 汤弘婷, 李梦醒, 刘虹麟, 陈忠良, 李琴山. 沉默 MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞 HEK-293T增殖及凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3838-3844.

Zhang Yi, Wu Daoqiu, Tang Hongting, Li Mengxing, Liu Honglin, Chen Zhongliang, Li Qinshan. Effect of MKRN1 silencing on proliferation and apoptosis of human embryonic kidney cells HEK-293T[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3838-3844.

图/表（结果） 4

2.1 四环素诱导MKRN1沉默的载体构建结果 shRNA PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，条带位置显示在100 bp左右，表明成功扩增3条shRNA序列，见图1A；胶回收后经EcoRⅠ及XhoⅠ双酶切，见图1B；以及对载体p-Tripz进行双酶切，见图1C；胶回收酶切后的shRNA及载体pTripz后，进行连接、转化后挑菌进行菌落PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示sh1，sh2，sh3均与载体p-Tripz连接成功，见图1D；送菌液至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，sh1-1至sh1-4，sh2-1，sh2-2，sh2-4，sh3-1测序结果与设计的shRNA序列一致，见图1E。以上结果说明sh1，sh2，sh3序列均成功连入载体。

2.2 四环素诱导的稳定表达敲减MKRN1的HEK-293T细胞的构建选取测序正确的sh1，sh2，sh3菌液摇菌提取质粒后进行慢病毒包装，72 h后HEK-293T细胞的荧光表达分别达到50.0%，40.0%，30.0%，见图2A，表明shRNA载体成功转进HEK-293T细胞。收集强力霉素诱导表达的48，72 h的病毒上清液，用浓缩后的病毒液感染HEK-293T细胞，感染48 h后HEK-293T的荧光表达约为50.0%，见图2B，待HEK-293T细胞汇合度达到90.0%进行嘌呤霉素筛选，筛选至荧光表达90.0%以上后进行敲减效率验证。以上结果表明慢病毒成功感染目的细胞。

2.3 RT-qPCR以及Western blot检测四环素诱导HEK-293T细胞敲低MKRN1的敲减效率
2.3.1 RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，sh1号序列MKRN1的mRNA水平明显下调(P < 0.001)，sh2以及sh3号序列敲减效果不明显，见图3A。
2.3.2 Western blot 结果与RT-qPCR结果一致，与对照组相比，sh1号序列MKRN1的蛋白表达水平明显下调(P < 0.001)，sh2，sh3号序列敲减效果不明显，见图3B，故选取sh1号序列进行后续实验，用shMKRN1表示。Tet-on诱导表达系统的特点是当不存在强力霉素时，基因的表达被抑制；而当存在强力霉素时，目的基因能够得到表达。所以用不含强力霉素的完全培养基培养已经稳定表达沉默MKRN1的HEK-293T细胞，且传代3次以上，提取蛋白检测MKRN1的蛋白表达情况，见图3C，实验分为对照+强力霉素组、shMKRN1+强力霉素组、单独的对照组以及shMKRN1组，结果显示，与对照组比较，在shMKRN1组，不用强力霉素进行诱导时，MKRN1的蛋白表达得到回复(泳道2，4)；且1 mg/L的强力霉素对MKRN1的蛋白表达无明显影响(泳道1，3)。以上结果表示，研究成功构建Tet-on慢病毒系统介导的稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞。

2.4 沉默MKRN1可抑制HEK-293T细胞增殖且促进其凋亡通过集落形成实验检测细胞增殖活力，结果显示沉默MKRN1可明显抑制HEK-293T细胞的增殖(P < 0.05)，见图4A。且通过Western blot检测了在HEK-293T细胞中沉默MKRN1表达后的细胞增殖相关蛋白指标及凋亡相关蛋白指标，发现增殖细胞核抗原的表达减少(P < 0.05)，见图4B；抗凋亡蛋白Bcl2的表达减少(P < 0.05)，促凋亡蛋白BAX的表达水平增加(P < 0.01)，Bcl2/BAX的比值减低(P < 0.01)，见图4C。以上结果说明在HEK-293T细胞中，沉默MKRN1可抑制其增殖，且能够促进其发生凋亡。

参考文献

[1] DAS AT, TENENBAUM L, BERKHOUT B. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther. 2016;16:156-167.
[2] GOSSEN M, FREUNDLIEB S, BENDER G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268:1766-1769.
[3] MATHIAS H, NIELS H, RAINER L, et al. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnology. 2010;10(1):81.
[4] SUN Y, CHEN X, XIAO D. Tetracycline-inducible Expression Systems: New Strategies and Practices in the Transgenic Mouse Modeling. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica. 2010;39(004):235-246.
[5] MONTERO-MOLINA S, ARREDONDO-ESPINOZA E, SOLÍS-ESTRADA J, et al. Molecular Cloning and Transient Expression of Recombinant Human PPARγ in HEK293T Cells Under an Inducible Tet-on System. Mol Biotechnol. 2019;61:427-431.
[6] ZHOU Z, TAO Z, LEE CG, et al. Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling.Semin Cell Dev Biol. 2002;13(2):121-128.
[7] ADHIKARY S, MARINONI F, HOCK A, et al. The ubiquitin ligase HectH9 regulates transcriptional activation by Myc and is essential for tumor cell proliferation. Cell. 2005;123(3):409-421.
[8] HAJIKHEZRI Z, DARWEESH M, AKUSJÄRVI G, et al. Role of CCCH-Type Zinc Finger Proteins in Human Adenovirus Infections. Viruses. 2020; 12(11):1322.
[9] ZHU J, ZHAO C, ZHUANG T, et al. RING finger protein 31 promotes p53 degradation in breast cancer cells. Oncogene. 2016;35(15):1955-1964.
[10] WANG XW, WEI W, WANG WQ, et al. RING finger proteins are involved in the progression of barrett esophagus to esophageal adenocarcinoma: a preliminary study. Gut Liver. 2014;8(5):487-494.
[11] LEE EW, LEE MS, CAMUS S, et al. Differential regulation of p53 and p21 by MKRN1 E3 ligase controls cell cycle arrest and apoptosis. EMBO J. 2009;28(14):2100-2113.
[12] KO A, SHIN JY, SEO J, et al. Acceleration of gastric tumorigenesis through MKRN1-mediated posttranslational regulation of p14ARF. J Natl Cancer Inst. 2012;104(21):1660-1672.
[13] BAI X, YANG H, PU J, et al. MKRN1 Ubiquitylates p21 to Protect against Intermittent Hypoxia-Induced Myocardial Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:9360339.
[14] LEE EW, KIM JH, AHN YH, et al. Ubiquitination and degradation of the FADD adaptor protein regulate death receptor-mediated apoptosis and necroptosis. Nature Commun. 2012;3:978.
[15] LEE MS, JEONG MH, LEE HW, et al. PI3K/AKT activation induces PTEN ubiquitination and destabilization accelerating tumourigenesis. Nature Commun. 2015;6:7769.
[16] GRAY TA, HERNANDEZ L, CAREY AH, et al. The Ancient Source of a Distinct Gene Family Encoding Proteins Featuring RING and C3H Zinc-Finger Motifs with Abundant Expression in Developing Brain and Nervous System. Genomics. 2000;66(1):76-86.
[17] KIM JH, PARK SM, KANG MR, et al. Ubiquitin ligase MKRN1 modulates telomere length homeostasis through a proteolysis of hTERT. Genes Dev. 2005;19(7):776-781.
[18] CASSANDRI M, SMIRNOV A, NOVELLI F, et al. Zinc-finger proteins in health and disease. Cell Death Discov. 2017;3:17071.
[19] SINGH JK, VAN ATTIKUM H. DNA double-strand break repair: Putting zinc fingers on the sore spot. Semin Cell Dev Biol. 2021;113:65-74.
[20] LAMBERT SA, JOLMA A, CAMPITELLI LF, et al. The Human Transcription Factors. Cell. 2018;172:650-665.
[21] GRAY TA, HERNANDEZ L, CAREY AH, et al. The ancient source of a distinct gene family encoding proteins featuring RING and C(3)H zinc-finger motifs with abundant expression in developing brain and nervous system. Genomics. 2000;66:76-86.
[22] FERREIRA MV, CABRAL ET, COROADINHA AS. Progress and Perspectives in the Development of Lentiviral Vector Producer Cells. Biotechnol J. 2021;16:e2000017.
[23] NALDINI L, BLÖMER U, GALLAY P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996; 272:263-267.
[24] SANBER KS, KNIGHT SB, STEPHEN SL, et al. Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production. Sci Rep. 2015;5:9021.
[25] ELSNER C, BOHNE J. The retroviral vector family: something for everyone. Virus Genes. 2017;53:714-722.
[26] 张岩松, 陈丽娇, 张婷,等. 基因治疗的研究进展[J]. 中国细胞生物学学报,2020,42(10):1858–1869.
[27] Zhang J, Chen L, Zhang J, et al. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Comput Struct Biotechnol J. 2019;17:1171-1177.
[28] TOMOHIKO U, HIROYUKI Y, NAOTO M, et al. Single-Construct Polycistronic Doxycycline-Inducible Vectors Improve Direct Cardiac Reprogramming and Can Be Used to Identify the Critical Timing of Transgene Expression. Int J Mol Sci. 2017;18(8):1805.
[29] SANCHEZ G, LINDE SC, COOLON JD.Genome-wide effect of tetracycline, doxycycline and 4-epidoxycycline on gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2020;37:389-396.
[30] YAO F, WALKER PD, MACKENZIE RG. A Tet-on system for DRD1-expressing cells. PLoS One. 2013;8:e72681.
[31] WISHART JA, HAYES A, WARDLEWORTH L, et al. Doxycycline, the drug used to control the tet-regulatable promoter system, has no effect on global gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2005;22(7):565-569.
[32] 王晓, 朱君, 吴亮,等. Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2015,33(1):25-28.
[33] 丁晓琛, 乔一桓, 姜勋亮,等. 四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2020,41(5):690-695.
[34] CARDANO M, TRIBIOLI C, PROSPERI E. Targeting Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) as an Effective Strategy to Inhibit Tumor Cell Proliferation. Curr Cancer Drug Targets. 2020;20(4):240-252.
[35] LUO Y, WANG Q, TIAN P, et al. Highly expressed CHAF1A and PCNA are positively associated with malignancy of cervical squamous cell carcinoma. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2017;33(12):1696-1701.
[36] ZHANG K, CHEN L, ZHANG Z, et al. Ubiquitin-like protein FAT10: A potential cardioprotective factor and novel therapeutic target in cancer. Clin Chim Acta. 2020;510:802-811.
[37] LALIER L, CARTRON PF, JUIN P, et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis. Apoptosis. 2007;12(5):887-896.
[38] LI YN, NING N, SONG L, et al. Derivatives of deoxypodophyllotoxin induce apoptosis through Bcl-2/Bax proteins expression. Anticancer Agents Med Chem. 2021;21(5):611-620.

引言

基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗癌症、遗传性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病，基因的过表达和沉默是研究基因功能的重要手段。但基因治疗的应用可能会因转基因产品的不良作用或脱靶效应而复杂化。因此，掌握开启和关闭转基因表达或调节表达水平的能力可能会显著提高基因治疗方法的安全性[1]。研究者们开发出了许多种类的可诱导表达系统，由GOSSEN等[2]发现并改造的四环素调控(Tet-on)系统尤其受关注，该调节系统通过添加四环素(tetracycline，Tet)或其衍生物如强力霉素(doxycycline，DOX)激活目的基因的表达。当环境中不存在强力霉素时，目的基因不被表达；而当存在强力霉素时，目的基因能够得到表达[3-4]。四环素诱导表达系统是应用最广泛的诱导表达系统之一[5]。四环素系统可在多种培养细胞和转基因小鼠中对基因表达进行紧密、可逆、定量、时间和空间调控[6]。
MKRN1(makorin ring finger protein 1)基因位于7号染色体长臂，编码长度为482个氨基酸的蛋白质，在不同物种间高度保守[7]。它是E3泛素连接酶RING-Finger结构域家族的成员，又名RNF61，具有E3泛素连接酶的功能环指结构域[8]。
RING E3泛素连接酶已被证实与多种重要的细胞生物学过程的调节有关，当其表达失调时有助于多种人类疾病的发生发展，包括恶性肿瘤[9-10]。目前越来越多的研究显示MKRN1与多种肿瘤密切相关：LEE等[11]的研究发现，敲减MKRN1的表达可以抑制人骨肉瘤细胞U2OS及人非小细胞肺癌细胞H1299细胞的增殖，并促进其发生凋亡。KO等[12]的研究发现，沉默MKRN1可以抑制胃癌细胞AGS及小鼠胚胎成纤维细胞MEF的增殖。BAI等[13]的研究发现抑制MKRN1的表达可增加慢性间歇性缺氧(IH)诱导的心肌细胞凋亡。LEE等[14]研究发现MKRN1 可以泛素化修饰fas相关蛋白的死亡结构域(FADD)从而阻止细胞的凋亡和坏死。LEE 等[15]研究发现MKRN1能够泛素化修饰磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)从而促进肿瘤的发展。综上所述，MKRN1可能是一个重要的肿瘤相关蛋白，但MKRN1影响肿瘤细胞生长的机制尚不明确，当前研究MKRN1在细胞中的生物学功能及其影响细胞生长的机制尤为重要。
故该研究拟构建四环素诱导表达MKRN1-shRNA慢病毒表达载体，通过荧光显微镜观察转染效率，采用实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后HEK-293T细胞内MKRN1的mRNA及蛋白表达水平，并初步探讨沉默MKRN1基因后，对HEK-293T增殖、凋亡的影响，旨在为进一步深入研究MKRN1基因的生物学功能奠定实验基础，为研究MKRN1的功能及作用提供科学的方法及理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年12月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心及贵州医科大学医学检验学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株人胚胎肾细胞HEK-293T细胞购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
1.3.2 药品、试剂及仪器 DMEM培养基、2.5 g/L胰蛋白酶、青霉素/链霉素混合液购自Gibco公司；胎牛血清购自BI公司；RIPA蛋白裂解液、5倍浓缩的蛋白上样缓冲液购自北京普利莱基因技术有限公司；蛋白酶抑制剂(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、氨苄青霉素、凝聚胺(polybrene)、1%结晶紫染料购自北京索莱宝科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate，BCA)蛋白定量试剂盒、Lip 2000、限制性内切酶、Tet-pTripz-puro质粒购自美国 Thermo Fisher 公司；病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G 来自中国科学院昆明动物研究所；大肠杆菌感受态DH-5α、T4 DNA连接酶、SYBR Premix Ex Taq、RNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、6×DNA上样缓冲液购自日本TaKaRa公司；ECL发光液、PVDF膜、15 mL超滤管购自美国Merck Millipore公司；强力霉素购自美国Selleck公司；兔抗人Bcl2相关X蛋白(bcl2 associated X protein，BAX)抗体、兔抗人B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)单克隆抗体和兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体、增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体购自Cell Signaling Technology公司；MKRN1抗体购自美国bethyl公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购自Bioworld公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；RT-qPCR、shRNA引物的合成及质粒测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。Quantinovo Q5 实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司；酶标仪、ChemiDoc成像仪、Western blot所需器材购自Bio Rad公司；倒置显微镜购自尼康公司；细胞培养耗材购自Corning公司。
1.4 实验方法
1.4.1 shRNA的设计 shRNA序列通过http://katahdin.csh1.org/siRNA/RNAi.cgi?type=shRNA平台获取。
引物设计为Forword：5’-CAG AAG GCT CGA GAA GGT ATA TTG CTG TTG ACA GTG AGC G-3’；Reverse：5’-CTA AAG TAG CCC CTT GAA TTC CGA GGC AGT AGG CA-3’。共选取3条shRNA，

序列为见表1。

1.4.2 载体构建及鉴定
(1)PCR扩增体系：见表2。PCR条件：94 ℃ 1 min，25 X(94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s)，75℃ 10 min，4 ℃ hold。

(2)酶切体系：见表2。

(3)连接：取5 μL Solution I、3 μL p-Tripz、2 μL shRNA 于 PCR 管中(16 ℃连接过夜)。
(4)转化：取20 μL 感受态细胞DH-5α，加入连接产物10 μL，冰上静置30 min，42 ℃热激90 s，迅速放回冰上，加入无氨苄青霉素培养基摇床200 r/min 37 ℃摇菌1 h；取摇好的菌4 000 r/min 1 min浓缩菌液，弃上清400 μL，重悬菌液涂板，放37 ℃培养箱培养过夜；第2天挑取单个菌落进行菌落PCR。
(5)菌落PCR：见表2。PCR条件：95 ℃ 10 min，36 X(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，4 ℃ hold。根据菌落PCR结果挑取阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4.3 细胞培养人胚胎肾细胞HEK-293T采用完全培养基培养(体积分数10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM培养基)；细胞培养于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中；均用2.5 g/L的胰蛋白酶消化实验细胞。细胞汇合率达到80%-90%时传代。
1.4.4 慢病毒包装及生产将对数生长期的HEK-293T细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，重悬于新鲜培养基中，以1×109 L-1细胞浓度铺至100 mm培养皿中，次日待细胞汇合度达60%-70%时，利用Lip2000进行病毒包装。在500 μL无血清无双抗DMEM中加入30 μL Lip2000，取另外3个EP管，将shRNA(sh1，sh2，sh3)、pSPAX、pMD2.G 分别以2∶1∶1的比例加入500 μL无血清无双抗DMEM中，静置5 min 后将质粒加入lip2000中静置15 min，静置后立即加入HEK-293T细胞的培养基中，37 ℃培养6-8 h后换含有1 mg/L强力霉素的完全培养基15 mL，于第2天收取病毒上清(即包装病毒后48 h)，同时再加入15 mL含有1 mg/L强力霉素的完全培养基，次日收取病毒上清(即包装病毒后72 h)，最终分别得到 shRNA1，shRNA2，shRNA3的病毒液各30 mL；后续用1 500 r/min 3 min离心病毒上清液，取离心后上清于0.45 μm滤膜过滤，将滤液吸入超滤管中3 000 r/min离心20 min，至终体积为500 μL，将其分为5份冻存于-80 ℃冰箱。
1.4.5 建立基于四环素诱导系统的稳定表达沉默MKRN1的HEK-293T细胞将对数生长期的HEK-293T细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，重悬于新鲜培养基中，以6×108 L-1细胞浓度铺至60 mm 培养皿中，次日待细胞汇合度达60%-70%时，分别向对应的培养皿中加入sh1，sh2，sh3病毒液、终质量浓度5 mg/L的polybrene以及3 mL完全培养基，感染6-8 h后换含有1 mg/L强力霉素的完全培养基，感染48 h后观察细胞荧光表达，根据荧光表达以及细胞汇合度进行嘌呤霉素筛选，从而得到由Tet-on慢病毒系统介导的稳定沉默MKRN1基因的HEK-293T细胞。

1.4.6 RT-qPCR检测MKRN1 mRNA表达取对数生长期的HEK-293T对照组细胞及敲减MKRN1组细胞(分别为sh1，sh2，sh3)，提取总RNA后反转录为cDNA后进行RT-qPCR。RT-qPCR引物序列见表3。

1.4.7 Western blot 检测蛋白表达取对数生长期的HEK-293T对照组细胞及敲减MKRN1组细胞(分别为sh1，sh2，sh3)，用预冷PBS洗涤3次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用细胞刮刮取培养皿上细胞，超声破碎细胞后，12 000 r/min离心20 min后取上清对所提取的蛋白进行定量测定，用等量的蛋白上样电泳，待蛋白分离后进行转膜、封闭，将PVDF膜分别与兔抗MKRN1抗体、兔抗BAX抗体、兔抗Bcl2抗体、兔抗增殖细胞核抗原抗体以及兔抗GAPDH抗体(均1∶1 000)在4 ℃孵育过夜后，TBST洗涤3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温摇床孵育1 h后，TBST洗涤4次，每次5 min，在膜上加入ECL发光液后于成像仪显影，以GAPHD作为参照，ImageJ软件分析。
1.4.8 集落形成实验检测细胞的集落形成能力取对数生长期的HEK-293T对照组细胞及稳定沉默MKRN1组细胞 (命名为shMKRN1)，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按照每孔500个接种于6孔板中，待细胞生长12 d后(中途每隔三四天换液)，弃去原有培养基，PBS洗涤3次，用甲醇固定，1%结晶紫进行染色，最后用PBS洗去多余的染液，晾干后拍照保存，以> 50个细胞的集团作为一个集落，统计形成的集落数量。
1.5 主要观察指标 ①四环素诱导MKRN1沉默的载体构建结果；②四环素诱导的稳定表达敲减MKRN1的HEK-293T细胞的构建；③四环素诱导HEK-293T细胞敲低MKRN1的敲减效率；④沉默MKRN1对HEK-293T细胞增殖及凋亡的影响。
1.6 统计学分析利用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，以 P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经贵州医科大学公共卫生学院杨敬源教授审核。

讨论

MKRN1是无内含子MKRN基因家族的源基因，从无脊椎动物到脊椎动物，该基因具有高度的序列保守性[16]。它是一种锌指蛋白(Zinc Finger Proteins)，最初被鉴定为hTERT的E3连接酶[17]。锌指蛋白构成了人类蛋白质组的重要组成部分，因此它们能够执行非常多样化的生物功能[8]。现已有多种锌指蛋白被证明参与染色质重塑、转录激活/抑制、DNA修复、凋亡调节、细胞增殖和分化[18-20]。研究表明，MKRN1是一种E3连接酶，由于其能够诱导p53、p21和p14ARF降解，被认为是细胞周期和凋亡的重要调控因子[12]。MKRN1在大多数人体组织中都有表达，如心脏、大脑、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺[21]，但其对组织细胞的影响及功能亟待阐明。因此，此次研究成功构建的沉默MKRN1的慢病毒重组载体对于后续研究MKRN1的生物学功能提供了良好的基础。
基因治疗的目标是将遗传物质注入靶细胞、组织或器官，从而治愈或改变疾病的进展[1]。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。慢病毒载体是目前临床试验中使用最多的载体之一[22]。慢病毒载体转导增殖和非增殖细胞的能力，以及它们通过基因组整合提供的长期表达，使它们成为几种基因治疗的首选载体[23]。慢病毒载体具有可以感染非分裂期细胞、感染效率高、容纳外源性基因片段大，免疫反应小、被浓缩成高滴度、可以长期表达等显著优点[24-26]。四环素诱导体系现已在分子生物学领域及转基因控制中得到广泛应用[27-28]。四环素诱导基因表达系统具有自己的独特优势，首先原核来源的TetR与TetO的结合特异性高，哺乳动物细胞中没有类似的DNA靶向序列，所以四环素系统调控特异性高，并且宿主基因不受到影响，适合于体内外的各种基因表达的调控，因此，当在真核生物系统中使用时，它很少有脱靶效应[29]；其次四环素系统具有可逆性，在去除诱导剂后可使系统关闭，也可反复加入诱导剂，多次启动诱导反应[30]。而且，四环素系统的诱导药物为四环素或强力霉素，四环素作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，是对人体较为安全的一种药物，并且在四环素系统中低剂量的四环素就可调节基因的表达，所以不会对动物或细胞产生强毒性；强力霉素是小分子脂溶性抗生素，具有可透过细胞膜、诱导效率高、对细胞毒性作用小等优点，且 WISHART等[31]对酵母进行的研究报告称，使用强力霉素既不会导致表型效应，也不会对基因的整体表达产生影响[32]。
利用siRNA介导的基因沉默由于是瞬时表达，持续时间短，因此不适用于操作周期较长的实验，如集落形成实验、动物实验等。所以，现采用shRNA来抑制基因的表达已经被广泛用于肿瘤学及分子生物学研究中，但细胞中某些重要基因被沉默后，可能导致细胞无法存活。因此，常规的基因沉默方法不能满足后续的基因生物功能的研究以及动物实验对细胞数量的需求[33]。此次研究采用的Tet-on慢病毒载体系统能够规避上述缺点，既能够长期稳定沉默目的基因，且减少脱靶效应，又能够可逆地调控目的基因的表达。实验通过四环素诱导系统构建了沉默泛素连接酶MKRN1的慢病毒重组载体，并建立了稳定表达沉默MKRN1蛋白的HEK-293T细胞，且敲减效率在mRNA水平及蛋白水平上均达到70%以上。实验发现，在HEK-293T细胞中，1 mg/L的强力霉素对MKRN1的蛋白表达无明显影响，且当在稳定沉默MKRN1的HEK-293T 细胞中撤去强力霉素诱导，MKRN1的蛋白表达得到回复。并通过克隆形成实验发现，在抑制MKRN1表达后，HEK-293T细胞的增殖活力受到抑制。由于细胞增殖相关蛋白指标增殖细胞核抗原参与DNA的复制，在细胞的增殖不受抑制时，其大量表达[34]。且研究发现增殖细胞核抗原在恶性肿瘤中呈异常表达，且与肿瘤的恶性程度呈正相关[35]。BAX和Bcl2是细胞凋亡通路的必需因子，BAX能够诱导细胞凋亡，而Bcl2发挥抑制细胞凋亡的作用[36]。且Bcl2/BAX的比值被认为是调控细胞凋亡的开关，当比值上升时，具有抑制凋亡的作用，而比值下降时，能够诱导细胞发生凋亡[37-38]。因此，此次研究通过Western blot检测增殖细胞核抗原及凋亡相关蛋白指标BAX、Bcl2发现，在HEK-293T细胞中沉默MKRN1后，增殖细胞核抗原表达减少，BAX表达增加，Bcl2表达下降，Bcl2/BAX的比值下降。这些结果说明抑制MKRN1的表达可以抑制HEK-293T细胞的增殖，且能够促进HEK-293T细胞的凋亡。但此次研究还有所欠缺，MKRN1是通过何种机制参与HEK-293T细胞增殖，MKRN1是否存在新的泛素化底物从而影响HEK-293T细胞的增殖尚未可知，后续将进行更深一步的研究。此次研究构建的稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞为后续寻找E3泛素连接酶MKRN1可能的新底物以及研究其影响细胞生长的机制提供了基础。
结论：该研究成功构建Tet-on系统介导的沉默泛素连接酶MKRN1的慢病毒重组载体，获得稳定沉默MKRN1基因的人胚胎肾细胞HEK-293T，初步发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞的增殖能力下降且能够促进其凋亡，为后续研究MKRN1的生物学功能及其影响细胞生长的机制提供了实验基础与细胞基础，也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

沉默 MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞 HEK-293T增殖及凋亡的影响

Effect of MKRN1 silencing on proliferation and apoptosis of human embryonic kidney cells HEK-293T

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[1]	张永强, 潘凤, 孙鹏, 谭明辉, 轩留明, 王勤章. Gja1基因重组慢病毒对糖尿病豚鼠膀胱病变模型中缝隙连接蛋白43蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1161-1165.
[2]	欧航君, 赵广建, 潘裕佳, 龚才伟, 赵权威, 刘大男. 构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体抑制内皮细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 216-222.
[3]	汪畅, 孙帅, 陈晓涛, 张晓莉. 慢病毒介导沉默Smad2基因对人牙髓干细胞成骨向分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(19): 2999-3004.
[4]	朱琳, 郭世武, 刘锦波, 邹红军. miR-29a调控水通道蛋白4抑制过氧化氢诱导的星形胶质细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(19): 2993-2998.
[5]	马雯晴, 张惠荣, 刘辉, 董丽丽, 杨眷娣. 敲低NIPBL基因调控小鼠骨髓间充质干细胞向软骨的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1477-1483.
[6]	谢梦生, 龙燕鸣, 李晓捷. 慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1528-1533.
[7]	曾裕威, 黄闯, 魏建国, 段东明, 王簕. 利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3968-3973.
[8]	唐蜜, 秦臻, 韦正新, 倪鸣, 柴小康. 敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2985-2990.
[9]	杨爽, 闫景龙. 软骨细胞分化过程中SOX9的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2279-2284.
[10]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[11]	王向, 韦朝俊, 王尧, 潘裕佳, 刘大男. 构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5670-5675.
[12]	石淑娟, 李诚, 乔凌燕, 杨槟伊, 李堂. 构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5682-5687.
[13]	郑维蓬, 胡伟坚, 赵国源, 魏合伟, 刘治军, 万雷, 陈胜, 廖志浩. 补肾健脾活血方含药血清干预过表达、沉默Beclin-1基因的MC-3T3-E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4650-4655.
[14]	戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.
[15]	冼国炎, 陈蔚深, 张紫机, 叶勇裕, 潘柏祺, 郑霖力, 盛璞义. 利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 84-89.