实物观察：煅烧鹿角松质骨颗粒为疏松的有序无机多孔材料，见图1A所示。在与胶原复合交联后，可见大量胶原有机质填充于煅烧鹿角松质骨支架中，见图1B所示，且复合支架材料具有良好的可塑性和结构稳定性，其中胶原有机质的负载干质量比例达28.5%。

扫描电镜观察：低倍镜下可见煅烧鹿角松质骨呈多孔互穿网络结构，孔隙互相连通，大孔孔径为500 μm，小孔孔径为30 μm，具有良好的骨传导性，且有大量胶原有机质填充于松质骨颗粒孔隙内，见图2A；高倍镜下可见胶原纤维负载在松质骨表面，见图2B，表明有机质的负载并没有影响煅烧鹿角松质骨的传导性。



2.2   煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的官能团表征   用傅里叶变换红外光谱检测煅烧鹿角松质骨颗粒、Ⅰ型胶原蛋白与煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架3种材料的主要官能团组成，光谱结果见图3所示。结果显示，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架存在位于1 540，1 243 cm-1的峰，其为胶原蛋白中酰胺(-CONH2)官能团的特征峰；另外，位于1 040，962 cm-1的峰为无机质中PO43-的特征峰，3 571 cm-1为OH-的特征峰，1 460，1 413，891 cm-1处为CO32-的特征峰，表明无机质组成的松质骨材料上有效负载了胶原有机质。



2.3   实验动物数量分析    10只SD大鼠全部进入结果分析。
2.4   煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架植入骨缺损早期效果评价    图4为煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架和Bio-Oss/Collagen?胶原骨两种材料植入骨缺损后4周的组织学苏木精-伊红染色和Masson三色染色结果。苏木精-伊红染色显示，两种材料植入的骨缺损处均有新骨生成，但未完全愈合，植入材料周围可见成骨细胞，其中实验组材料周围成骨细胞明显增多，预示着其具有较强的新骨生成能力。Masson三色染色显示，两组材料周围有新生的规律排列的胶原纤维和不规则的骨髓腔，表明新生组织主要为未成熟的新生骨(蓝染)和纤维结缔组织。



2.5   煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架植入骨缺损晚期效果评价   图5为煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架和Bio-Oss/Collagen?胶原骨两种材料植入骨缺损后12周的组织学苏木精-伊红染色结果。结果显示，两组骨缺损均愈合良好，缺损边缘与新生骨完全融合，残留材料被新骨包绕；放大后进一步观察可见，实验组的新生骨结构致密，重塑程度更高，表明新生骨成熟程度更高，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料具备良好的骨传导性和骨再生修复作用。



2.6    煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的组织相容性    由颅骨缺损修复实验组织学观察结果可知，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架具有良好的组织相容性。

植骨修复是目前治疗临界尺寸骨缺损的主要手段[1]，虽然目前骨植入材料的研究热点集中在人工合成材料，以避免自体骨移植给患者带来的痛苦[2]，但是人工骨修复材料在临床上的应用范围仍然严重受限。对于复杂形状的骨缺损，除了良好的生物相容性和骨传导性之外，对材料的可塑性也有严格要求[3-6]。目前，临床上使用的可塑性骨充填材料仍然以小牛骨来源的异种骨和胶原蛋白复合材料为主[7-9]，其修复效果已被广泛接受，但其无机成分来源于被屠杀的小牛，存在动物伦理争议。因此，寻找一种安全有效、可重复获得且可以避免伦理问题的可塑性骨充填支架材料具有重要意义。

鹿角是哺乳动物中唯一能完整再生的身体器官之一，且生长速度快[10]，鹿角每年都会自然脱落，并不影响鹿的生存。研究显示鹿角骨的无机成分与人骨高度接近[11]，前期研究已成功制备出了鹿角松质骨经化学处理及高温煅烧后的新型无机骨植入材料——煅烧鹿角松质骨，并证实了其有效的骨缺损修复能力[12-13]。然而，单纯鹿角松质骨颗粒虽然保持了天然骨的无机结构而具备良好的骨传导性，但是在要求骨充填塑形时其应用受到限制。针对以上不足，此次实验提出将煅烧鹿角松质骨颗粒与高分子有机质通过化学交联制备复合支架材料，以提升材料性能。

Ⅰ型胶原是细胞外基质的主要成分，能够为细胞生长、增殖、分化和细胞之间的连接提供必要的强度、刚度和三维结构微环境[14-16]。通过使用 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺将胶原分子之间实现化学交联，并与煅烧鹿角松质骨颗粒复合，可以提高支架材料的强度和结构稳定性，更好地模拟天然的细胞外基质[17-19]。此次实验通过形貌和官能团表征，评价煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的可塑性和理化性能；通过大鼠颅骨全厚骨缺损的植入实验，评价煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的骨传导性、组织相容性和骨再生修复作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料制备及材料植入骨缺损动物模型的效果评价。
1.2   时间及地点   实验于2019年2-12月在北京大学口腔医院完成。
1.3   材料
1.3.1    主要材料、试剂与仪器    中年马鹿鹿角(吉林野生商贸有限公司，中国)；Bio-Oss/Collagen®胶原骨(Geistlich-Pharma，瑞士)；生理盐水、NaOH、PBS、醋酸、PBS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、戊巴比妥纳、无水乙醇、多聚甲醛、乙二胺四乙酸脱钙液(韦斯化学品有限公司，北京)；Ⅰ型胶原(30 kD，四川铭让生物科技有限公司，中国)；伊红(中杉金桥有限公司，北京)；Masson三色染色试剂盒(源叶生物科技有限公司，中国)；超净工作台(SHIMADZU，日本)；牙科种植机(桂林市啄木鸟医疗器械有限公司，中国)；马弗炉(合肥科晶材料技术有限公司，1 100 ℃微型箱式炉，中国)；扫描电子显微镜(ZEISS，Supra 55，德国)；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，Nicolet 8700，美国)。
1.3.2    实验动物    8周龄雄性SD大鼠10只，体质量200 g左右，购自北京大学口腔医学院实验动物中心，许可证号：SYXK(京)2016-0007。动物实验已通过北京大学医学部伦理委员会伦理审查。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。在对实验动物麻醉的条件下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   煅烧鹿角松质骨颗粒的制备   采用前期研究中煅烧鹿角松质骨颗粒的制备方法[10–12]。切除新鲜鹿角的皮质骨结构后，将鹿角主干的松质骨锯成1 cm×1 cm×1 cm大小的块体，用蒸馏水冲洗后依次经过体积分数为20%的NaOH溶液浸泡12 h、体积比为1∶3的三氯甲烷/无水甲醇混合溶液浸泡12 h、体积分数为30%双氧水浸泡6 h，每次更换液体时均将鹿角松质骨块体用流水冲洗2 min；然后将浸泡后的鹿角松质骨块体置于65 ℃恒温烘箱中干燥1-3 d；烘干后，将其置于马弗炉中加热煅烧，自室温以5 ℃/min的速率匀速升温至600 ℃煅烧6 h；煅烧结束后，以10 ℃/min的速率降温，待马弗炉降至室温后取出煅烧鹿角松质骨。将冷却后的块状煅烧鹿角松质骨粉碎、研磨，得到粒径为1.0-2.0 mm的煅烧鹿角松质骨颗粒。
1.4.2    煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的制备    将0.4 g的Ⅰ型胶原溶解于40 mL的0.5 mol/L醋酸溶液，得到质量分数为1%的Ⅰ型胶原溶液。将1 g煅烧鹿角松质骨颗粒完全浸没于Ⅰ型胶原溶液中，40 ℃条件下搅拌2 h，制得悬浮液。调整悬浮液的pH值为5.5-6.5，并加入0.8 g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和0.148 g的N-羟基丁二酰亚胺交联剂充分搅拌，室温下静置24 h后制得交联产物，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/胶原的质量比为2∶1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为4∶1。以PBS对交联产物进行多次清洗，用滤纸小心吸掉材料表面多余的溶液，置于-20 ℃环境中冷冻48 h，最后在-54 ℃的真空条件下冻干24 h，得到煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料。
1.4.3    煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架的理化性能表征    对材料进行喷金处理后，扫描电子显微镜下观察材料的表面形貌及内部结构。采用傅里叶变换红外光谱检测煅烧鹿角松质骨颗粒、胶原与煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料的主要官能团组成。
1.4.4     骨缺损植入动物实验  

大鼠颅骨临界尺寸缺损模型的构建：取10只SD大鼠，按30 mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠，麻醉后颅骨背部手术部位备皮、消毒、铺巾，在颅骨矢状缝位置作皮肤切口直达骨面，剥离骨膜暴露颅顶骨，利用5 mm外径环钻的牙科种植机在颅顶矢状缝两侧各制备一直径为5 mm的圆形全厚缺损，左侧缺损区植入0.2-0.25 g的Bio-Oss/Collagen®胶原骨(对照组)，右侧缺损区植入0.2-0.25 g的煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架(实验组)。术后分层缝合骨膜、皮肤，切口消毒，置于术后保温箱至苏醒，常规饲养。术后4，12周分别处死5只大鼠，取颅骨标本，40 g/L多聚甲醛固定，经去除皮肤肌肉组织后置于10%乙二胺四乙酸脱钙液中进行脱钙，制作厚度为5 μm的石蜡切片，脱蜡处理后进行苏木精-伊红和Masson三色染色。

苏木精-伊红染色：取术后4，12周脱蜡后的切片，首先经无水乙醇浸泡10 min，再经体积分数为95%，90%，80%，70%的乙醇梯度处理，每次3 min；蒸馏水洗去乙醇；苏木精染色5 min后，用体积分数为1%的盐酸浸泡1 min，流水冲洗后再用含氨水的蒸馏水(pH=8.7)浸泡5 min，流水冲洗5 min；然后用0.5%伊红水溶液染色5 min，流水冲洗2 min之后，再经体积分数为70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理30 min，后用中性树胶封固，光学显微镜下观察拍照。

Masson三色染色：取术后4周脱蜡后的切片，置于丽春红酸性品红染液中染色5 min，蒸馏水洗后置于1%磷钼酸1-3 min，然后直接入苯胺蓝液中5 min，流水冲洗，再经体积分数为70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察拍照。
1.5   主要观察指标   煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料的表面形貌、官能团组成，以及植入骨缺损后4，12周的组织学表现。

在以往采用异种骨、人工合成骨充填材料进行骨缺损修复的相关研究中[1，4，20]，骨粉材料为颗粒状，不易塑形且不能和缺损界面进行紧密贴合[15，21]。为满足临床复杂形状骨缺损修复尤其口腔中牙周骨组织修复的需求，已有大量研究专注于可塑性骨充填材料的研发[6，22-23]。

煅烧鹿角松质骨是一种新型异种骨植入支架材料，前期研究已证实其具有良好的骨缺损修复效能，在植入早期有良好的血管化作用，其在体外溶解释放的 Ca、P、Mg 等元素可明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化，且不存在免疫排斥和伦理问题，是一种优良的骨植入材料[11-13]。胶原交联是一种主要的胶原蛋白翻译后修饰的手段，在骨的生物学和生物力学特征中发挥重要作用[16，24-25]。已有大量研究通过复合胶原增强人工骨材料的生物活性和可塑性[14，15]，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺法是一种工艺简单、安全无毒的胶原交联改性方法，可提高胶原的形态稳定性，使胶原结构变得紧密有序，提高复合材料的机械强度[26]。有研究结果显示，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺作为化学交联剂制备的胶原支架，具有良好的力学性能和生物相容性[27-28]。

此次实验使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺法制备了煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料，结果表明，在宏观尺度上，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料可被塑形为规则的圆柱形，冻干后结构致密，表明其具有良好的可塑性，胶原负载可使煅烧鹿角松质骨颗粒满足不规则骨缺损修复的塑形要求；在微观尺度上，扫描电镜下可见煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料的无机成分呈有序多孔的网络结构，孔隙互相连通，胶原蛋白填充于松质骨颗粒孔隙内，表明煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架具有良好的骨传导性。前期研究也表明，与Bio-Oss®骨粉相比，煅烧鹿角松质骨颗粒与成人煅烧松质骨的官能团组成重合度更高，孔隙率和孔径大小也更接近[11]。此次实验红外光谱结果显示，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料中既有无机成分CO32-和PO43-的特征峰，又有胶原蛋白中酰胺(-CONH2)官能团的特征峰，由此可见，胶原蛋白被有效负载在煅烧鹿角松质骨的孔隙结构中，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架具备类似天然骨的结构和成分。

前期研究结果表明，煅烧鹿角松质骨颗粒在体外对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞具有良好的细胞亲和性[12]。此次实验在大鼠的颅骨缺损区植入煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架后，未观察到明显的免疫排斥反应，4周和12周的组织学表征未观察到炎性细胞浸润等炎症反应，骨缺损愈合状况良好，表明煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架具备良好的表面生物活性和组织相容性。这可能是由于胶原蛋白是构成生物体内细胞外基质的重要成分[15，29-31]，胶原与松质骨复合后能够为细胞生长、增殖、分化等行为提供仿生微环境[32-34]。由此可见，胶原改性能够改善复合材料的生物活性。

大鼠颅骨缺损区的组织学染色结果显示，术后4周时，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架组材料周围成骨细胞的聚集程度优于Bio-Oss/Collagen®胶原骨组，可能的原因是煅烧鹿角松质骨颗粒有利于早期新生血管生成[12]，从而为新骨生成提供了充分的营养物质。另外，与含有10%胶原蛋白的Bio-Oss/Collagen®胶原骨相比[35]，由28.5%Ⅰ型胶原组成的煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架具有更高比例的胶原负载量。由于胶原蛋白对细胞生长、组织修复和再生有重要作用[15，36-39]，因此含有更高比例胶原成分的煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架更有利于骨组织修复。植入12周时的组织学观察结果显示，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架组的骨缺损愈合良好，缺损边缘与新生骨完全融合，残留材料周围被新生骨包绕；与Bio-Oss/Collagen®胶原骨组相比，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架组的新生骨结构更致密，表明煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架组的新生骨成熟程度更高，这一优异性能可能与煅烧鹿角松质骨颗粒含有促成骨元素如Ca、Mg、Fe等相关[10]，后者能够改变植骨区微环境，从而调控骨髓间充质干细胞成骨向分化[37，40-43]。由此可见，煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料具备良好的骨传导性和骨再生修复作用。

综上，此次实验采用高温煅烧法和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺交联法制备出煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料，该支架材料不仅具有良好的可塑性，而且具有天然骨的多孔互通结构，在孔隙结构的无机质表面有胶原纤维负载。动物骨缺损植入实验证实了煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料具有良好的可塑性、骨传导性、组织相容性和优异的骨再生修复作用，可用于小范围不规则骨缺损的充填修复。此次实验不仅提升了煅烧鹿角松质骨的临床适用性，而且为今后可塑性骨缺损修复材料的优化和改性提供了参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
煅烧鹿角松质骨：是将新鲜鹿角去除皮质骨后，经过化学制剂对鹿角松质骨进行脱脂脱蛋白处理，采用600 ℃高温煅烧方法获得的一种天然无机骨充填材料，前期研究已经证实其具有良好的骨传导性能。
复合支架：由两种及以上不同的材料组合制备而成，如高分子聚合物和无机材料，被赋予了每种组分材料的优势，在组织工程的应用中往往兼具力学适配性和生物活性，能更好地促进功能性组织的再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

该文介绍了煅烧鹿角松质骨/胶原复合支架材料，它是采用高温煅烧法和EDC/NHS交联法，由煅烧鹿角松质骨颗粒和I型胶原蛋白合成的一种新型可塑性骨填充支架材料。实验结果表明该复合支架材料具有天然骨优异的多孔互通结构，并有胶原纤维负载在孔隙结构的无机质表面，它不仅具有良好的可塑性和临床适用性，而且具备优异的骨传导性、组织相容性和骨再生修复适配性，可作为小范围不规则骨缺损充填修复的临床替代材料。

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