负载木通皂苷D的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架修复骨缺损

doi:10.12307/2022.858

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
木通皂苷D：又称川续断皂苷IV，是从中药续断中提取出来的苷类化合物，为续断的主要活性成分之一，具有较明确的药理活性，具有促进成骨细胞的增殖与分化、提高成骨细胞活性与数量、促进基质钙化与骨痂生长等诸多作用，主要被用于治疗骨质疏松与促进骨折愈合，具有高效、廉价、毒副作用小等优点。同时，木通皂苷D还具有抗细胞凋亡、神经保护及心肌保护等药理作用。
壳聚糖：是甲壳素经脱乙酰化而成的产物，为自然界唯一的碱性多糖，具有抗菌及调节免疫等活性，可通过壳聚糖酶和氨基葡萄糖苷酶降解为葡萄糖，具有与细胞外基质相似的特征及良好的生物相容性、生物降解性、低毒性，使其在骨组织工程材料中备受关注，然而其存在机械性能弱和降解过快的缺点。因此，通常将壳聚糖与纳米羟基磷灰石复合制备支架材料，以增加其机械性能。

背景：木通皂苷D具有促进成骨细胞的增殖与分化、提高成骨细胞活性与数量、促进基质钙化与骨痂生长等诸多作用，主要被用于治疗骨质疏松与促进骨折愈合，将其应用于骨缺损修复的研究较少见。
目的：以纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架为载体，将包裹木通皂苷D的缓释微球负载于其中，观察其骨缺损修复作用。
方法：采用W/O/W方法制作包裹木通皂苷D的缓释微球，采用冷冻干燥方法制备负载包裹木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称缓释支架)与单纯的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称空白支架)，检测缓释微球与缓释支架的体外释药能力。将小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1分别接种于两种支架上，以单独培养的细胞为对照，分析细胞的黏附、增殖与分化情况。在24只成年新西兰大白兔双侧桡骨中段制造1.5 cm的骨缺损，分别植入空白支架与缓释支架，术后4，12周时进行大体观察、Micro-CT扫描影像学检查及组织学观察。
结果与结论：①包裹木通皂苷D的缓释微球与缓释支架均具有缓释作用，其中缓释支架的药物释放速率更加平稳、持久；②CCK-8实验显示，缓释支架上的细胞增殖速率快于空白支架、对照组(P < 0.05)；扫描电镜下可见，小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1覆盖在两组支架表面，其中缓释支架上的细胞数量要多于空白支架；③培养7，14 d时，缓释支架组的碱性磷酸酶活性、Runx2 mRNA表达高于空白支架组(P < 0.05)；培养第21天时，缓释支架组的骨桥蛋白、骨钙素蛋白表达量高于空白支架组(P < 0.05)；④影像学检查与组织学观察结果显示，术后4周时，缓释支架组材料周围可见大量的新生骨，其新生骨量明显多于空白支架组；术后12周时，缓释支架内部也可见大量的新生骨长入，空白支架内部仅见少量的新生骨长入，并且缓释支架组的材料残余明显少于空白支架组(P < 0.05)；⑤结果表明，负载木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架可提升体外成骨细胞的黏附、增殖与分化能力，提升纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的体内骨诱导能力。

https://orcid.org/0000-0002-7832-3446 (贠霄)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 木通皂苷D, 纳米羟基磷灰石, 壳聚糖, 支架, 骨生物材料, 骨缺损修复, 骨组织工程

Abstract: BACKGROUND: Akebia saponin D can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, increase the activity and quantity of osteoblasts, and promote matrix calcification and callus growth. Akebia saponin D is mainly used to treat osteoporosis and promote fracture healing, and its application in bone defect repair is rare.
OBJECTIVE: To observe bone defects repaired by loading the sustained-release microspheres containing Akebia saponin D onto the nano hydroxyapatite/chitosan scaffold.
METHODS: The sustained-release microspheres containing Akebia saponin D were prepared by W/O/W method. The nano hydroxyapatite/chitosan scaffold of sustained-release microspheres containing Akebia saponin D (hereinafter referred to as the sustained-release scaffold) and the simple nano hydroxyapatite/chitosan scaffold (hereinafter referred to as blank scaffold) were prepared by freeze drying method to evaluate the in vitro drug release ability of sustained-release microspheres and the scaffold. Mouse-derived preosteoblast MC3T3-E1 was seeded on two kinds of scaffolds to analyze cell adhesion, proliferation, and differentiation. Individually cultured cells were used as controls. A 1.5-cm bone defect was made in the middle of bilateral radius of 24 adult New Zealand white rabbits. Blank scaffold and sustained-release scaffold were implanted, separately. Gross observation, Micro-CT imaging examination, and histological observation were performed at 4 and 12 weeks after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Both the sustained-release microspheres and sustained-release scaffolds containing Akebia saponin D had sustained-release effects. The drug release rate of sustained-release scaffold was more stable and lasting. (2) CCK-8 assay demonstrated that the cell proliferation rate on the sustained-release scaffold was significantly faster than that on the blank scaffold and control groups (P < 0.05). Under the scanning electron microscope, mouse-derived preosteoblast MC3T3-E1 was covered on the scaffolds of the two groups, and the number of cells on the sustained-release scaffolds was more than that on the blank scaffolds. (3) At 7 and 14 days of culture, alkaline phosphatase activity and Runx2 mRNA expression were higher in the sustained-release scaffold group than those in the blank scaffold group (P < 0.05). At 21 days of culture, osteopontin and osteocalcin expression levels in the sustained-release scaffold group were higher than those in the blank scaffold group (P < 0.05). (4) The results of imaging and histological observation showed that at 4 weeks after operation, a large number of new bone were found around the materials in the sustained-release scaffold group, and the new bone mass was significantly higher than that of the blank scaffold group. At 12 weeks after operation, a large number of new bones grew in the sustained-release scaffold, while only a small amount of new bones was found in the blank scaffold, and the material residue in the sustained-release scaffold group was significantly lower than that of the blank scaffold group (P < 0.05). (5) These results verify that nano hydroxyapatite/chitosan scaffold of sustained-release microspheres containing Akebia saponin D can enhance the adhesion, proliferation, and differentiation of osteoblasts in vitro, and promote the osteoinductive ability of nano hydroxyapatite/chitosan scaffold in vivo.

Key words: Akebia saponin D, nano hydroxyapatite, chitosan, scaffold, bone biomaterials, bone defect repair, bone tissue engineering

中图分类号:

贠霄, 丁童, 杨卫强, 郭新军. 负载木通皂苷D的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4293-4299.

Yun Xiao, Ding Tong, Yang Weiqiang, Guo Xinjun. Nano hydroxyapatite/chitosan scaffold loaded with Akebia saponin D in bone defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(27): 4293-4299.

图/表（结果） 13

2.1 缓释微球的形貌、载药率与包封率扫描电镜下可见，实验制备了形态较规则的微球，且大小较均匀，见图2。包裹木通皂苷D的缓释微球的载药量与包封率分别为(15.38±0.59)%，(65.37±8.24)%。

2.2 缓释支架的形貌扫描电镜下可见，纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架内部呈疏松多孔的结构，空隙之间沟通良好，孔径在85-280 μm范围内，支架的表面可见附着的纳米羟基磷灰石与均匀分布的微球，微球形状规则，见图3。

2.3 微球与缓释支架的药物缓释检测由图4可见，缓释微球在前9 d的药物累计释放率较高，至第9天时累计释放率达到(55.37±5.29)%，9 d后药物释放较为平稳，至30 d时累计释放率已达到(89.92±6.31)%；缓释支架的药物释放趋势与包裹木通皂苷D的缓释微球相似，其在前6 d内的药物累计释放率较高，至第6天时达到(29.28±6.37)%，此后的药物释放率明显减慢且较平稳，至30 d时的累计释放率为(78.87±3.68)%。由此得出，缓释支架的药物释放速率更加平稳。

2.4 两种支架对细胞增殖与黏附的影响培养第1天时，3组细胞增殖无明显差异；随着培养时间的延长，3组细胞数量明显增加，其中缓释支架上的细胞数量明显多于空白支架、对照组(P < 0.05)，后两组细胞数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，图5。

扫描电镜下可见，小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1覆盖在两组支架表面，形态为梭形或多角形，细胞生长密集，其中缓释支架上的细胞数量要多于空白支架，具体情况见图6。

2.5 两种支架对细胞成骨分化的影响见表2，3。

培养第7，14天时，缓释支架组的碱性磷酸酶活性高于空白支架组(P < 0.05)，Runx2 mRNA表达高于空白支架组(P < 0.05)；培养第21天时，缓释支架组的骨桥蛋白与骨钙蛋白表达量高于空白支架组(P < 0.05)，见图7。

2.6 两种支架修复骨缺损实验结果
2.6.1 桡骨标本大体观察两组术后4，12周的桡骨标本大体观察，见图8。空白支架组术后4周时支架与宿主骨可见明显的界限，支架与骨缺损边缘结合不牢固，支架材料无明显降解；术后12周时支架与宿主骨之间的界限变得模糊，支架与宿主骨结合较紧密，材料中可见新生骨质，材料部分降解，见图8A、C。缓释支架组术后4周时支架与宿主骨的界限模糊，支架与骨缺损边缘结合较紧密，支架材料无明显降解；术后12周时骨缺损部位可见大量新骨长入，支架大部分已降解，见图8B、D。

2.6.2 桡骨标本影像学观察两组术后4，12周的桡骨影像学检查结果，见图9。空白支架组术后4周时可见植入的支架与宿主骨断端有明显界限，材料周围无明显骨痂形成，缺损部位密度较低；术后12周时植入的支架与宿主骨断端已无明显的界限，材料与宿主骨良好地整合，见图9A、B。缓释支架组术后4周时可见植入的支架与宿主骨部分整合，材料周围由高密度的骨痂包裹；术后12周时植入的支架与宿主骨基本整合完全，材料轮廓模糊不清，见图9C、D。统计学分析显示，缓释支架组术后4，12周的骨体积分数高于空白支架组(P < 0.05)，见图9E。

2.6.3 桡骨标本组织学分析见图10。

两组术后4，12周的桡骨标本苏木精-伊红染色结果，见图10A。苏木精-伊红染色显示：①空白支架组术后4周时材料周围可见少量的新生骨，材料中心区仅见纤维组织，未见明显新骨形成；术后12周时材料外可见大量新骨生成，新生骨与材料之间由大量纤维结缔组织填充，材料内可见部分新骨生成。②缓释支架组术后4周时在材料周围可见大量小梁状新生骨，新生骨周围环绕着大量的软骨细胞，材料中心区可见大量纤维组织，其中可见少量新生骨区域呈岛状分布；术后12周时材料与新生骨整合完全，材料内部可见大量新骨形成，纤维组织极少，材料已大部分降解。两组术后4，12周的桡骨标本Masson染色染色结果见图10B。Masson染色显示，缓释支架组术后4，12周蓝染的骨质量明显多于对应时间点的空白支架组。对两种染色结果进行统计学分析，缓释支架组术后4，12周的新骨生成量明显多于空白支架组(P < 0.05)，术后12周的材料残余量少于空白支架组(P < 0.05)，见表4。

2.7 支架材料生物相容性由细胞增殖实验与骨缺损修复实验可知，缓释支架具有良好的生物相容性。

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引言

因先天畸形、感染、创伤及肿瘤切除后所造成的大范围骨缺损，对局部的形态及功能造成严重影响，给患者带来了极大的损害。目前处理骨缺损的方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植与人工材料填充[1-3]，但这些方法均存在一定的缺陷，自体骨来源有限，同种异体骨存在免疫排斥与传播疾病的风险，人工材料无法完全模拟人体骨的微观结构与生物学特性。组织工程学是在生物、材料、工程、制造及医学科学进一步发展前提下形成的一门新兴学科，可在体内及体外制造出新的具备生物活性与功能的组织及器官，用以修复或替代病变的组织器官，具有巨大的发展潜力[4]。作为组织工程学的重要分支，骨组织工程学可在体外或是体内制造出具备天然人体骨特性的支架材料，促进骨缺损的修复[5]。骨组织工程的主要研究方向之一是在体外将细胞因子复合到支架载体材料上，然后植入病变部位，通过支架的桥接与传导作用及细胞因子的诱导与调控作用促进新骨的生成，完成病变部位的修复[6-7]。但是目前大多数的细胞因子提取过程复杂、价格昂贵、产率低下且存在潜在的毒性、致癌性，临床应用受限。近年来，研究者将目光投向了将中药与骨组织工程相结合，以用于修复骨缺损[8-10]。
木通皂苷D，又称川续断皂苷Ⅳ，是从中药续断中提取出来的苷类化合物，为续断的主要活性成分之一，具有较明确的药理活性，具有促进成骨细胞的增殖与分化、提高成骨细胞活性与数量、促进基质钙化与骨痂生长等诸多作用，主要被用于治疗骨质疏松与促进骨折愈合，具有高效、廉价、毒副作用小等优点。同时，木通皂苷D还具有抗细胞凋亡[11]、神经保护[12-13]、心肌保护等药理作用[14-15]。张志达等[16]的研究显示，木通皂苷D可提升糖皮质激素环境下骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性及成骨相关因子Runx2、骨钙素mRNA的表达量，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。此外，陈佩佩等[17]的研究显示，局部注射适宜浓度的木通皂苷D可有效促进压力侧牙周组织破骨细胞的分化，加快牙周改建，其效果与前列腺素E2相当。但是将木通皂苷D应用于骨缺损修复的研究较少见，并且以往的研究多采用灌胃给药方式，该给药方式需要在胃肠处被吸收，通过体循环到达骨缺损部位，药物起效时间较长，同时由于首过效应造成血药浓度的降低，影响药物的疗效。为此，实验以纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架为载体，将包裹木通皂苷D的缓释微球负载于其中，观察骨缺损修复作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备及随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年5月在新乡市中心医院完成。
1.3 材料小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1(上海谷研实业有限公司)。
1.3.1 主要试剂与仪器木通皂苷D(上海佰世凯化学科技有限公司)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(85/15，深圳聚合生化科技有限公司)；聚乙烯醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；壳聚糖(西安百川生物科技有限公司)；纳米羟基磷灰石(武汉华翔科洁生物技术有限公司)；扫描电镜(TRLM785，北京天瑞博源科技有限公司)；胎牛血清(赛业生物科技有限公司)；α-MEM培养基(南京森贝伽生物科技有限公司)；Prime Script™RT-PCR反转录盒(北京麦瑞博生物科技有限公司)；Micro-CT扫描(杭州越波生物科技有限公司)。
1.3.2 实验动物 24只成年新西兰大白兔，雄性，购自河南后羿生物工程股份有限公司，许可证号SYXK(豫)2019-0004。实验方案经新乡市中心医院伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 制作包裹木通皂苷D的缓释微球应用W/O/W方法制作包裹木通皂苷D的缓释微球[18]，具体方法为：分别称取300 mg的木通皂苷D与600 mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，置入2 mL体积比为3∶1的二氯甲烷哈二口恶烷混合溶剂中，超声作用下使药物完全溶解，记为溶液1。将4 g的聚乙烯醇置入300 mL水中(100 ℃)，搅拌制备聚乙烯醇溶液，冷却至室温，加水400 mL，配制浓度1%的聚乙烯醇溶液。将溶液1缓慢加入1%聚乙烯醇溶液中，2 000 r/min高剪切乳化1 min，随后150 r/min搅拌3 h。过滤后收集微球，置于400 mL含0.55%泊洛沙姆188的20%乙醇溶液中，低速搅拌60 min，过600目筛后以水清洗3次，转移至培养皿中冻干。复溶10 mg微球，采用紫外分光度法检测其载药率及包封率[19]。包封率=(药总量-上清中药含量)/药总量；载药量=(药总量-上清中药含量)/(载体总量+药总量-上清中药含量)。
1.4.2 制作骨修复支架利用冷冻干燥方法制备负载包裹木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称缓释支架)[20-21]，具体方法为：分别称取0.1 g的壳聚糖与0.1 g的纳米羟基磷灰石，置入10 mL 0.1 mol/L乙酸溶液中，在80 ℃环境中200 r/min磁力搅拌60 min，冷却至室温；称取10 mg的包裹木通皂苷D的缓释微球，置入壳聚糖与纳米羟基磷灰石混合溶液中，200 r/min磁力搅拌60 min，随后将溶液置于模具中，真空冷冻干燥后4 ℃保存。采用相同的原理制备单独的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(以下简称空白支架)。扫描电镜下观察支架的微观形貌。
1.4.3 微球与缓释支架的体外药物缓释检测称取1 mg的包裹木通皂苷D的缓释微球，置于4 mL的PBS中，在37 ℃条件下置于摇床中以100 r/min的速率持续震荡，每3 d收集一次上清液2 mL，同时补充2 mL新鲜的PBS，采用紫外分光度法检测上清液中木通皂苷D的含量。同理，将缓释支架置入4 mL的PBS中，在37 ℃条件下置于摇床中以100 r/min的速率持续震荡，每3 d收集一次上清液2 mL，同时补充2 mL新鲜的PBS，采用紫外分光度法检测上清液中木通皂苷D的含量。应用前将支架以紫外灯双面照射灭菌30 min。
1.4.4 支架对细胞增殖与黏附的影响取小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1，置于含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基中培养。每2 d换液一次，观察细胞融合至接近长满时弃去培养基，用PBS清洗2次后胰酶消化，加入培养基制备浓度为5×107 L-1的细胞悬液。将500 µL细胞悬液分别滴加至空白支架与缓释支架表面，以单独培养的细胞为对照。培养的第1，3，7天，采用CCK-8法检测细胞增殖[22]。培养7 d后，吸弃原培养基后用PBS清洗3次，2.5%戊二醛固定后再用PBS清洗3次，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金膜，扫描电镜下观察细胞黏附情况。
1.4.5 支架对细胞成骨分化的影响将小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1分别接种于空白支架与缓释支架表面，加入成骨诱导培养基，每2 d换液一次。培养第7，14天时，利用碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。培养第7，14天时，抽提细胞RNA，检测RNA的浓度与纯度，利用Prime Script™RT-PCR反转录盒反转录合成cDNA，反应体积为10 µL。以反转录所得 cDNA 作为模板，用不同引物序列进行扩增。PCR 扩增条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s，40个循环，结果采用2-ΔΔCt法分析数据，分析各组 Runx2 mRNA表达水平。Runx2上游引物，5’-GGC CGT GGT GGT GGA GTT AA-3’，下游引物5’-TCT CCT GGC TCT CTT TGG AA-3’；GAPDH上游引物，5’-GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3’，下游引物，5’-CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG-3’。培养第21天时，利用ELISA 酶联免疫吸附实验检测骨桥蛋白与骨钙蛋白表达量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.6 建立骨缺损模型与分组干预取24只成年新西兰大白兔，静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)，消毒双侧前肢，切开皮肤与皮下组织，显露桡骨中段，利用电锯制造双侧桡骨1.5 cm的骨缺损，选择一侧植入空白支架，另一侧植入缓释支架，缝合各层皮肤、肌肉，见图1。术后3 d给予肌注抗生素，术后4，12 周处死取材，进行大体观察。

影像学观察：取桡骨标本，进行Micro-CT扫描，扫描参数：电压为80 kV，电流为0.5 mA，层厚为48 µm，分辨率为48 µm，角度为180°，测量骨缺损部位骨体积分数。
组织学观察：完成影像学检查后，将桡骨标本置于体积分数4%甲醛中固定24 h，流动水冲洗干净后梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理后脱钙处理72 h，石蜡包埋，制作100 µm的石蜡切片，分别进行苏木精-伊红染色、Masson染色，光镜下观察。①苏木精-伊红染色：将切片置入二甲苯脱蜡10 min，随后置入梯度乙醇中脱水，置入蒸馏水5 min，浸入苏木精染色中5 min，蒸馏水冲洗后盐酸乙醇分化3 s，再次蒸馏水冲洗，浸入伊红染液中2 min，置入梯度乙醇中脱水，二甲苯透明后中性树脂封固。②Masson染色：将切片置入二甲苯脱蜡10 min，随后置入梯度乙醇脱水，自来水冲洗，放入重铬酸钾浸泡过夜并用自来水冲洗；浸入铁苏木精染液3 min，盐酸乙醇溶液分化后充分水洗；浸入丽春红品红染色5 min，自来水冲洗，磷钼酸水溶液处理3 min；苯胺蓝染色5 min，1%冰醋酸浸润；再次依梯度脱水，二甲苯透明后以中性树胶封固。利用Image J 软件计算新生骨组织体积比与支架残余。
1.5 主要观察指标空白支架与缓释支架对小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1黏附、增殖与分化的影响，以及两种支架修复骨缺损的作用。
1.6 统计学分析采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

讨论

壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化而成的产物，为自然界唯一的碱性多糖，具有抗菌及调节免疫等活性，可通过壳聚糖酶和氨基葡萄糖苷酶降解为葡萄糖，具有与细胞外基质相似的特征及良好的生物相容性、生物降解性、低毒性[23]，使其在骨组织工程材料中备受关注，然而其存在机械性能弱和降解过快的缺点[24-28]。因此，通常将壳聚糖与纳米羟基磷灰石复合制备支架材料以增加其机械性能。纳米羟基磷灰石是一种生物活性陶瓷，其结构与人体正常骨组织相近，具有促进骨传导及成骨的作用。纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架已被证明可支持干细胞的增殖和成骨分化，在骨缺损动物模型中可增强骨愈合[29-31]。实验利用冷冻干燥方法制备了负载包裹木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架，体外实验显示该缓释支架可较平稳地缓慢持续释放木通皂苷D，在骨缺损部位保持较长时间的作用浓度，为骨缺损的修复提供良好的条件。细胞与材料之间的相互所用一直是研究的重要领域，这种相互作用包括材料对细胞增殖、分化与黏附的调控[32-34]。实验结果显示，纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架有利于小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1的增殖、黏附与向成骨分化，与以往的研究结果一致；而支架负载包裹的木通皂苷D缓释微球后，小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1的增殖数量与黏附明显增加，并且碱性磷酸酶活性、Runx2 mRNA表达与骨桥蛋白、骨钙素蛋白表达量均明显提升，提示木通皂苷D在其中发挥了重要作用，证实木通皂苷D可促进成骨细胞的增殖、黏附与分化，并提升其活性，为将其应用于体内实验打下了良好的基础。
为了评价缓释支架修复骨缺损的能力，作者将其应用兔桡骨缺损模型中，同时与空白支架进行对比，从而判断其作用骨替代材料的可行性。临界骨缺损是不同通过动物自身骨形成而自发愈合的最小骨缺损，很早之前就有大量实验对临界骨缺损范围进行了研究，证明兔桡骨骨缺损修复临界值应大于1.4 cm[35-37]，因此，实验在成年新西兰大白兔桡骨中段制造1.5 cm的骨缺损符合临界骨缺损的要求；另外，制作了双侧桡骨缺损，将空白支架与缓释支架各植入其中一侧来观察骨修复效果，避免了动物个体差异对实验结果的影响。实验结果显示，两种支架植入兔桡骨缺损后均可不同程度地促进新骨生成，经过一定的时间均可实现材料与宿主骨的良好整合，也证明了材料的良好生物相容性与骨传导能力。影像学检查与组织学观察结果显示，术后4周时，缓释支架材料周围可见大量的新生骨，其新生骨量明显多于空白支架组，如此早期诱导植入物周围骨再生的能力可保证其与宿主骨的快速整合，对于防止植入支架的松动具有重要的意义；术后12周时，缓释支架内部也可见大量的新生骨长入，而空白支架内部仅见少量的新生骨长入，证实缓释支架不仅可以作为生物支架诱导体外成骨细胞的增殖与分化，还可以作为植入物诱导新生骨组织长入材料内部，显著提高材料的骨诱导能力，促进材料周围与内部的大量新骨生成，促进骨缺损修复。同时实验中还发现，缓释支架术后12周的降解能力强于空白支架，降解材料的区域由新生骨组织填充，有利于缺损部位的骨改建与髓腔的再通。此次实验中缓释支架具有良好的骨修复能力，主要取决于：材料自身具有良好的生物相容性与骨传导能力，具有与天然骨相似的空间结构及无机成分，有利于新生骨组织与血管的长入及代谢产物的排出；支架中木通皂苷D的持续释放促进了成骨细胞的增殖与分化活性，提供了良好的骨再生局部微环境。但是实验也存在一定的不足，将负载木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架应用于骨损伤处，未设置单独的未载药聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球对照组，尚不能确切地说明木通皂苷D的促成骨作用，将在进一步的实验中证实；另外，实验未设置灌胃给药组，对于木通皂苷D局部应用于骨缺损部位是否优于灌胃给药仍有待进一步的实验证明。
综上实验结果可得，负载木通皂苷D缓释微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架可提升体外成骨细胞的粘黏附、增殖与分化能力，提升纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的体内骨诱导能力，在骨组织工程中具有一定的应用前景。但是关于木通皂苷D最适宜的负载量与作用机制仍需深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程