热敏灸手少阳三焦经可改善银屑病样大鼠模型的皮损病变

doi:10.12307/2022.838

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (35): 5602-5606.doi: 10.12307/2022.838

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热敏灸手少阳三焦经可改善银屑病样大鼠模型的皮损病变

陈楚，欧阳厚淦，齐艳喆，朱绪映，王姿

江西中医药大学中医学院，江西省南昌市 330004

收稿日期:2021-10-30 接受日期:2021-12-07 出版日期:2022-12-18 发布日期:2022-05-17
通讯作者: 欧阳厚淦，博士，教授，江西中医药大学中医学院，江西省南昌市 330004
作者简介:陈楚，女，1995年生，江西省赣州市人，汉族，江西中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合基础专业研究。
基金资助:
江西省自然科学基金面上项目(20202BABL206143)，项目负责人：欧阳厚淦；江西省教育厅科技项目重点课题(GJJ201213)，项目负责人：欧阳厚淦

Heat-sensitive moxibustion at the Sanjiao meridian of hand-Shaoyang in psoriatic rats

Chen Chu, Ouyang Hougan, Qi Yanzhe, Zhu Xuying, Wang Zi

College of Traditional Chinese Medicine, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China

Received:2021-10-30 Accepted:2021-12-07 Online:2022-12-18 Published:2022-05-17
Contact: Ouyang Hougan, MD, Professor, College of Traditional Chinese Medicine, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
About author:Chen Chu, Master candidate, College of Traditional Chinese Medicine, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (General Program), No. 20202BABL206143 (OHG); the Science and Technology Project of the Education Department of Jiangxi Province, No. GJJ201213 (OHG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
筋膜：即皮下结缔组织，属于三焦焦膜的一部分。三焦焦膜是一个有形的脏器，本质为人体内遍布胸腔、腹腔的一张大网膜。
热敏灸：又称热敏悬灸，属于针灸的一种，使用时不用针、不接触人体，无伤害、无不良反应，属于临床针灸替代疗法；会出现透热、扩热、传热、局部不(微)热远部热和表面不(微)热深部热、非热觉等现象。

背景：临床以及前期研究发现热敏灸治疗银屑病效果良好，但具体机制尚未明确。
目的：探讨热敏灸对银屑病样大鼠的影响及其机制。
方法：选取60只8-10周龄健康SD大鼠，随机分为空白组15只、模型组15只、治疗组30只。除空白组外，其余各组大鼠背部和手少阳三焦经所循行的皮肤进行银屑病皮损造模，建模成功后，治疗组于每日同一时间对手少阳三焦经外关穴进行热敏灸治疗，每次40 min，连续7 d，根据每日艾灸过程中尾温的变化情况分为热敏灸组15只与艾灸组15只。对各组大鼠进行银屑病皮损面积及严重程度(PASI)评分，采用Western blot检测大鼠外关穴皮肤和筋膜中JAK3、STAT3、p-JAK3以及p-STAT3的蛋白表达。
结果与结论：①艾灸组、热敏灸组银屑病皮损面积及严重程度评分均低于模型组(P < 0.05)，热敏灸组银屑病皮损面积及严重程度评分低于艾灸组，但差异无显著性意义(P > 0.05)；②与模型组相比，艾灸组大鼠外关穴处筋膜中p-JAK3、p-STAT3蛋白表达显著降低(P < 0.05)，艾灸组大鼠外关穴处皮肤中p-JAK3蛋白表达显著降低(P < 0.05)； ③与模型组相比，热敏灸组大鼠皮肤和筋膜中JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白表达均显著降低(P < 0.05)；④与艾灸组相比，热敏灸组外关穴筋膜中STAT3蛋白表达显著降低(P < 0.05)；⑤结果表明，艾灸和热敏灸可改善银屑病样大鼠皮损病变，抑制皮损炎症，其中热敏灸的治疗效果在一定程度上优于艾灸，其机制可能与抑制STAT3通路信号转导有关。
缩略语：银屑病皮损面积及严重程度指数：psoriasis area and severity index，PASI

https://orcid.org/0000-0002-1807-1849 (陈楚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 热敏灸, 筋膜, 银屑病, STAT3, 信号通路, 艾灸, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Heat-sensitive moxibustion is confirmed to be effective in the treatment of psoriasis, but the specific mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of heat-sensitive moxibustion on psoriasis rats and its mechanism.
METHODS: Sixty healthy Sprague-Dawley rats aged 8-10 weeks were randomly divided into blank control group (n=15), model group (n=15), and treatment group (n=30). Except for the blank group, animal models of psoriatic lesions were made on the back and the skin along the Sanjiao meridian of hand-Shaoyang. After successful modeling, the treatment group was treated with heat-sensitive moxibustion at Waiguan point of the Sanjiao meridian of hand-Shaoyang at the same time every day, 40 minutes once, for 7 continuous days. The treatment group was subdivided into heat-sensitive moxibustion group (n=15) and moxibustion group (n=15) according to the changes of tail temperature in the daily moxibustion process. After treatment, the rats in each group were scored by the psoriasis area and severity index (PASI), and after treatment, the protein expressions of JAK3, STAT3, p-JAK3, and p-STAT3 in the skin and fascia of Waiguan point were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The PASI scores in the moxibustion group and heat-sensitive moxibustion group were lower than that in the model group, while the PASI score in the heat-sensitive moxibustion group was lower than that in the moxibustion group and there was no significant difference between groups. Compared with the model group, the protein expressions of p-JAK3 and p-STAT3 in the fascia of Waiguan point were significantly decreased (P < 0.05), and the protein expression of p-JAK3 in the skin of Waiguan point was also significantly reduced in the moxibustion group (P < 0.05). Compared with the model group, the protein expressions of JAK3, STAT3, p-JAK3, and p-STAT in the fascia and skin of Waiguan point were significantly decreased in the heat-sensitive moxibustion group (P < 0.05). Compared with the moxibustion group, the protein expression of STAT3 in the fascia of Waiguan point was significantly reduced in the heat-sensitive moxibustion group (P < 0.05). To conclude, both moxibustion and heat-sensitive moxibustion can improve the skin lesions of psoriatic rats and inhibit the inflammation of psoriasis. Furthermore, heat-sensitive moxibustion has a better efficacy than moxibustion, and its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signal pathway.

Key words: heat-sensitive moxibustion, fascia, psoriasis, STAT3, signal pathway, moxibustion, rat

中图分类号:

陈楚, 欧阳厚淦, 齐艳喆, 朱绪映, 王姿. 热敏灸手少阳三焦经可改善银屑病样大鼠模型的皮损病变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5602-5606.

Chen Chu, Ouyang Hougan, Qi Yanzhe, Zhu Xuying, Wang Zi. Heat-sensitive moxibustion at the Sanjiao meridian of hand-Shaoyang in psoriatic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(35): 5602-5606.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 SPF级雌性SD大鼠60只全部进入结果分析，实验过程中无死亡。
2.2 各组大鼠的皮损程度每日观察大鼠皮肤变化。空白组大鼠皮肤无红斑、鳞屑等银屑病典型症状出现，模型组大鼠备皮区皮肤在造模后的第2天开始出现白色鳞屑、浸润性红斑症状和角质层增厚等典型症状，同时少数大鼠伴有出血点，随着造模时间的延长，症状慢慢加重，在第7天达到顶峰；与模型组比较，艾灸组和热敏灸组大鼠的症状较轻，主要表现为皮肤红斑、鳞屑较少，见图1。

根据PASI评分标准进行评分，与空白组比较，模型组大鼠PASI评分显著上升(P < 0.05)；与模型组比较，艾灸组和热敏灸组大鼠PASI评分均显著降低(P < 0. 05)，艾灸组与热敏灸组之间差异无显著性意义，见表1。

2.3 各组大鼠外关穴筋膜的JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3蛋白表达与空白组比较，模型组大鼠外关穴筋膜中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3 蛋白表达显著升高(P < 0.05)。与模型组比较，艾灸组大鼠外关穴筋膜中p-STAT3、p-JAK3蛋白表达显著降低(P < 0.05)，热敏灸组大鼠外关穴筋膜中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3蛋白显著降低(P < 0.05)；与艾灸组相比，热敏灸组外关穴筋膜中STAT3蛋白表达显著降低(P < 0.05)，见图2。

2.4 各组大鼠外关穴皮肤中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3蛋白表达与空白组比较，模型组大鼠外关穴皮肤中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3 蛋白表达显著增加(P < 0.05)；与模型组相比，艾灸组大鼠外关穴皮肤中p-JAK3蛋白表达显著降低(P < 0.05)，其余蛋白无统计学意义；与模型组相比，热敏灸组大鼠外关穴皮肤中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，见图3。

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引言

银屑病是一类慢性皮肤病，由于角质细胞的过度增生而发展[1-2]，皮肤损伤的疼痛、糟糕的身体形象给患者带来严重的身体和心理创伤[3-4]。调查显示，全球银屑病患者估计有3 000万到6 500万人[5-6]。研究发现艾灸对于银屑病有良好的治疗作用[7]。热敏灸是一种以出现热敏现象为得气标准的灸法，通过对相关腧穴的热刺激产生特异性的艾灸反应[8]。三焦学说起源已久，清代唐容川[8]认为“焦即油膜”是起源于两肾之间的膜样结构；陈潮祖教授提出“膜腠三焦说”，认为三焦为筋膜结缔组织和组织间隙[9]；姚荷生教授认为，三焦是人体内遍布胸腔、腹腔的一张大网膜。在前期研究中，作者发现筋膜结缔组织可能与热敏灸信号有一定联系[10]，基于此，该实验选取艾灸穴位——外关穴的皮肤以及筋膜进行研究，并且在非手少阳三焦经循行部位皮肤——背部皮肤造模进行观察对比，探讨当艾灸外关穴时背部皮损是否也会得到改善。

在银屑病发展中，信号通路是重要调节位点，当皮肤受到感染时，会产生表皮抗原进而激活抗原细胞，而抗原细胞的活化会引起某些细胞因子的表达，导致角质形成细胞异常增殖，刺激细胞信号转导分子引起炎症反应，最终导致皮肤病变[11]，其中JAK/STAT信号通路在细胞内信号转导中起重要作用，是免疫介导的炎症性疾病病理状态下的重要信号通路[12]，也是与银屑病关系密切的传导通路之一。JAK3广泛分布于活化的T细胞中，并与银屑病关系密切，STAT作用于JAK的下游。研究发现在银屑病皮损组织中STAT3水平显著升高，通过诱导寡核苷酸消除STAT3功能可以抑制小鼠银屑病样的发病甚至逆转病变[13]。基于以上内容，该实验探讨热敏灸对银屑病样大鼠STAT3信号通路的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照分组动物实验，多组间数据比较采用方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD法。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至 2021年9月在江西中医药大学中医学院科研平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8-10周龄SPF级雌性SD大鼠60只，体质量180-220 g，由江西中医药大学动物实验中心提供，动物合格证编号为SCXK(赣)2018-0003，在温度、湿度合适的动物房内饲养1周，每3 d更换垫料，每日喂养新鲜饮用水及饲料。实验方案经江西中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理批准号：JZLLSC20210073。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂艾条(南阳市宛北艾绒厂)；5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司)；白凡士林(山东利尔康医疗科技股份有限公)；BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪)；PMSF(北京索莱宝科技有限公司)；组织裂解液(康为世纪)；磷酸酶抑制剂(康为世纪)；GAPDH抗体(Proteintech)；STAT3、p-STAT3、JAK3抗体(美国CST公司)；p-JAK3抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；生物素标记的山羊抗兔二抗
(Proteintech)；牛血清蛋白(北京索莱宝科技有限公司)；PVDF转印膜(德国默克Millipore公司)；ECL化学发光试剂盒(康为世纪)。
1.3.3 实验仪器 Multiskan G01510 酶标仪(美国 THERMO公司)；Chemic Dox XR+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(北京君意华鑫科技有限公司)。
1.4 实验方法将大鼠随机分为模型组15只、空白组15只和治疗组30只，根据高扬等[14]的方法对大鼠进行造模，将背部中央区域约2 cm×2 cm面积和手少阳三焦经循行路线区域毛发脱去，并按照0.05 g/cm2 涂抹药膏，其中空白组大鼠在备皮区涂抹凡士林乳膏，模型组、治疗组大鼠涂抹5%咪喹莫特乳膏，1次/d，共涂抹7 d。最后一只大鼠涂抹2 h后，对治疗组外关穴进行艾灸治疗，在治疗7 d内大鼠尾温波动>1℃为热敏灸组，尾温波动≤1 ℃为艾灸组[15]，每次40 min，1次/d，共7 d，在7 d治疗过程中，有15只大鼠实现热敏化，归为热敏灸组，其余15只未达到敏化状态的则为艾灸组。若在造模期间大鼠脱毛区长出毛发，则重复除毛。在艾灸治疗的第8天，麻醉后脱颈椎处死各组大鼠，采集各组大鼠外关穴筋膜和皮肤做后续检测。

1.5 主要观察指标
1.5.1 银屑病皮损面积及严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)评分从造模第1天开始，根据PASI评分标准[16]，每天对大鼠造模区皮肤评分：采用5分制(0：无症状；1：轻微程度；2：中度；3：重度；4：极其严重)，红斑、鳞屑、肥厚3项评分之和即为PASI总分。
1.5.2 Western blot检测皮肤和筋膜中STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3蛋白的表达加入含PMSF和磷酸酶抑制剂的组织裂解液冰上提取筋膜和皮肤总蛋白，使用BCA定量法检测蛋白浓度；然后加入至10% SDS-PAGE溶解并转移到PVDF膜，5% 牛血清白蛋白于37 ℃摇床封闭PVDF膜2 h，加入STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3 及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜；第2天，在摇床上TBST清洗膜3次，每次10 min，加入二抗37 ℃孵育1.5 h，TBST清洗膜3次，每次10 min；通过化学发光检测对印迹进行可视化，目标条带采用Image Lab凝胶图像软件分析，以目标条带值/GAPDH条带值为目的蛋白的相对表达量。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件分析数据，采用prism8.0软件作图。数据以x±s表示，多组间数据比较采用方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD 法；方差不齐者用Tamhane’s T2检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经通过江西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

银屑病是一种由免疫介导的炎症性红斑鳞状慢性皮肤病，具有角质形成细胞不受控制增殖的特点[17]，其发病因素有很多，如环境因素、细菌感染等，目前无治愈特效药。中医对于银屑病的研究最早见于《诸病源候论》[18]，并且在治疗上具有独特优势。在中药治疗方面上有麻黄[19]、雷公藤多苷等[20]；中医特色疗法如走罐[21]、刺络拔罐等[22]。

目前针灸治疗银屑病也取得一定进展。针灸能双向调节细胞机体状态，影响皮损处微循环，刺激组织新陈代谢，以取得阴阳平和、内外兼治的效果。针灸在治疗银屑病时具有用药负担轻、毒副作用少的优点。蒋岚[23]发现针刺联合中药对于寻常型头皮银屑病血燥证、血瘀证患者有较好的效果，可改善头皮皮疹严重程度和全身症状体征，并改善皮损区微血管功能状态。马瑜婕[24]发现艾灸能有效改善血瘀证斑块型银屑病患者症状。热敏灸是指腧穴热敏化，当患者腧穴皮肤受到艾热刺激时，会产生透热、扩热、传热、局部不(微)热远部热和表面不(微)热深部热、非热觉等状态，这能显著增加疗效，体现了“灸之要，乃是气至而有效”；并完善和发展了“刺之要，气至而有效”的针灸理论[8]。姚荷生教授认为，三焦是一个有形的脏器，本质为人体内遍布胸腔、腹腔的一张大网膜[25]，手少阳三焦经其腑在三焦；而银屑病的病灶在皮肤与皮下结缔组织，属于三焦焦膜的一部分。在中医基础理论中，三焦为元气之别使，手少阳三焦经为多气少血之经络，外关穴为手少阳三焦经的络穴、与阳维脉相通的八脉交会穴，是临床泻热效穴；气为血之帅，治血先调气，艾灸外关穴可调气治血治疗三焦热极，这与大多数学者赞同的银屑病治疗思路——从血热论治相契合[26]。在银屑病与三焦焦膜关系的探讨中，作者所在团队前期研究发现热敏灸通过改变皮下筋膜及其成分[27]，从而影响其构成，激活MAPK信号通路。此外前期也进行了银屑病大鼠皮肤和筋膜病理学研究，热敏灸处理后的大鼠筋膜胶原纤维密集，呈波浪型排列。

Th细胞在银屑病的发病机制中起关键作用[28]，研究发现无论在体外和体内，在缺乏STAT3的情况下，Th17细胞分化能被消除[29-30]。STAT3最近已成为银屑病、银屑病样炎症发展和发病机制的关键信号通路，而STAT3主要被JAK受体激酶磷酸化激活[31]。STAT3及其激活的JAK激酶在银屑病的发生、发展和进展中的核心作用已被大量文献证实，并且STAT3是影响角质形成细胞和Th17细胞分化的重要因子[17，32-33]。

为了研究热敏灸是否通过抑制STAT3信号在银屑病中影响Th17细胞，该研究在咪喹莫特诱导的皮肤损伤中，通过Western blot检测外关穴皮肤和筋膜中STAT3和JAK3磷酸化增加，与模型组比较，热敏灸组大鼠皮肤和筋膜中磷酸化和非磷酸化2种形式的这些蛋白水平均显著降低(P < 0.05)；而艾灸组大鼠筋膜中的磷酸化蛋白表达显著降低(P < 0.05)，非磷酸化蛋白则无统计学意义；皮肤中只有p-JAK3显著降低(P < 0.05)，其余无统计学意义，这表明在抑制STAT3信号通路上热敏灸效果优于普通艾灸；热敏灸可能通过抑制或阻断STAT3信号通路的分子机制来抑制Th17细胞的活性；银屑病样模型大鼠背部皮损经过热敏灸治疗后，银屑病症状减轻，这提示灸信号可能通过遍布全身的筋膜传导到本不在手少阳三焦经循行路线的背部，以达到治疗银屑病的目的，其中的具体机制需要进一步研究。

实验的局限性：①每日由作者进行PSAI评分并记录数据，存在着自身的主观局限性；②热敏灸人为悬灸治疗可能存在个体灸量的差异性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

热敏灸手少阳三焦经可改善银屑病样大鼠模型的皮损病变

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