2.1   实验动物数量分析   小鼠每组纳入10只，共5组；大鼠每组纳入6只，共4组(因为小鼠实验证明高剂量组疗效更好，大鼠实验酸枣仁提取物只设计了用药高剂量组)。全部进入结果分析，无脱失。
2.2   药物对小鼠体长的影响   用药25 d后，酸枣仁提取物高剂量组小鼠体长明显大于空白对照组(P < 0.01)，酸枣仁提取物高剂量组小鼠体长大于低剂量组(P < 0.01)，阳性对照组体长明显长于对照组(P < 0.05)，抑制剂组由于一直灌胃药物，只有最后3 d使用了抑制剂，其体长也明显长于空白对照组(P < 0.05)，见表2。



2.3   药物对血清生长激素和脑组织5-HT2AR的影响    酸枣仁提取物高剂量组小鼠血清生长激素水平明显高于空白对照组和抑制剂组(P < 0.01，P < 0.01)，酸枣仁提取物高剂量组小鼠血清生长激素水平高于低剂量组(P < 0.01)，阳性对照组小鼠血清生长激素水平明显高于空白对照组和抑制剂组(P < 0.01，P < 0.01)，抑制剂组小鼠血清生长激素水平与空白对照组无差异。与抑制剂组相比，酸枣仁提取物高剂量组、阳性对照组、空白对照组脑组织5-HT2AR水平均有所降低(P < 0.01)，见表3。



2.4   给予酸枣仁提取物后对大鼠慢波睡眠的影响   酸枣仁提取物组和阳性对照组慢波睡眠期时长均大于空白对照组(P < 0.01，P < 0.01)，也大于抑制剂组(P < 0.05，P < 0.05)；药物对异相睡眠时期无影响；酸枣仁提取物组和阳性对照组总睡眠期由于慢波睡眠期间的延长，也大于空白对照组(P < 0.01，P < 0.01)，同时大于抑制剂组(P < 0.05，P < 0.05)；从而造成觉醒期酸枣仁提取物组和阳性对照组小于空白对照组(P < 0.01，P < 0.01)，同时小于抑制剂组(P < 0.05，P < 0.05)，见表4。



2.5   基因芯片筛选酸枣仁提取物组和对照组差异表达的miRNAs   筛选出表达上调的miRNAs有420个，表达下调的miRNAs 453个。其中符合差异倍数≥1.5、P < 0.05的差异表达miRNAs共16个，表达上调13个，表达下调3个。获得符合要求的差异表达的miRNA，见图1及表5。







2.6   生物信息学网站预测与芯片筛选的调控5-HT2AR的优选miRNA   由于给药后小鼠体长增长时5-HT2AR低表达，所以观察影响5-HT2AR表达并在酸枣仁提取物组中上调的miRNAs。结果miRNADB网站预测mmu-miR-34a-5p可以调控5-HT2AR表达，与芯片法筛选结果相同。作者用RNAhybrid网站筛查结果显示mmu-miR-34a-5p与5-HT2AR有很好的结合性。
2.7   qRT-PCR法验证mmu-miR-34a-5p在酸枣仁提取物组和对照组之间的差异表达   RNA的纯度结果显示，A260 nm/A280 nm比值介于1.8-2.0之间，说明提取的RNA合格。qRT-PCR结果显示酸枣仁提取物组mmu-miR-34a-5p的表达水平较空白对照组明显升高(P < 0.05)，见表6。

[1] 杨小莉,刘潇肖,白宝玉.身高的心理效应及其内在机制[J].心理科学进展,2017,25(5):857-865. [2] 谢艳,张云芳,宁桃丽,等.酸枣仁提取物调控cAMP-PKA通路促进小鼠体长增长及大鼠慢波睡眠的机制研究[J].上海中医药杂志, 2021,55(5):77-83. [3] LUO H, SUN SJ, WANG Y, et al. Revealing the sedative-hypnotic effect of the extracts of herb pair Semen Ziziphi spinosae and Radix Polygalae and related mechanisms through experiments and metabolomics approach. BMC Complement Med Ther. 2020;20(1):186-188. [4] GUO X, LI H, FENG H, et al. Quality analysis of Ziziphi Spinosae Semen extracts based on high performance liquid chromatography quantitative fingerprint and ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry quantification. Chin J Biochem Mol Biol. 2021; 39(9):989-997. [5] DU C, YAN Y, SHEN C, et al. Comparative pharmacokinetics of six major compounds in normal and insomnia rats after oral administration of Ziziphi Spinosae Semen aqueous extract. J Pharm Anal. 2020;10(4):385-395. [6] LI LB, KIM YW, WANG YH, et al. Methanol extract of semen Ziziphi Spinosae attenuates ethanol withdrawal anxiety by improving neuropeptide signaling in the central amygdala. BMC Complement Altern Med. 2019;19(1):147.  [7] YAN Y, LI Q, DU HZ, et al. Determination of five neurotransmitters in the rat brain for the study of the hypnotic effects of Ziziphi Spinosae Semen aqueous extract on insomnia rat model by UPLC-MS/MS. Avian Res. 2019;17(7): 551-560. [8] 黄婉仪, 张又祥. miRNA在中枢神经系统发育中的作用机制及临床应用研究进展[J]. 国际医药卫生导报,2021,27(4):625-627. [9] WANG Y, YANG L,CHEN T, et al. Anovel LncRNAMCM3AP-AS1 promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targetingmiR-194-5p/FOXA1axis. Mol Cancer. 2019;18(1):28. [10] 张小琴,朱智显,蔡虎志,等.长链非编码RNA-微小RNA-信使RNA调控轴在高血压靶器官损害中的作用机制[J].中华高血压杂志,2021,29(1):18-24. [11] ZHANG J, HE W, ZHENG D, et al. ExosomalmiR1184 derived from mesenchymal stem cells alleviates cisplatinassociated acute kidney injury. Mol Med Rep. 2021;24(5):124-127. [12] WANG Q, SUN H, WEN D, et al. Ultrasensitive electrochemical detection of miRNA based on polymerization signal amplification. Talanta. 2021;23(5):744-745. [13] XUE Y, GUO Y, YU M, et al. Monodispersed Bioactive Glass Nanoclusters with Ultralarge Pores and Intrinsic Exceptionally High miRNA Loading for Efficiently Enhancing Bone Regeneration. Adv Health Mat. 2021; 10(8):e2101616. [14] 武华红,李阳,郭佳运,等.基于初潮时骨龄预测女童初潮后身高剩余生长潜力的横断面调查[J].中国循证儿科杂志,2021,16(2):99-103. [15] NONAKA K, MURATA S, NAKANO H, et al. Association of Low Bone Mass with Decreased Skeletal Muscle Mass: A Cross-Sectional Study of Community-Dwelling Older Women.  Healthcare. 2020;8(3):77-78. [16] 赵心田,何晶晶,房爱萍,等.蛋白质摄入对男孩身高影响的调查研究[J].中国食物与营养,2021,27(8):5-8. [17] ZHUANG J, NING H, WANG M, et al. Downregulated fat mass and obesity-associated protein inhibits bone resorption and osteoclastogenesis by nuclear factor-kappa B inactivation. Onkourologiâ. 2021;8(7):13-15. [18] 肖潇. 短链非编码RNA的输运及功能[D]. 南京:南京大学,2019. [19] 王军, 姜利明, 皮杨威,等. 脊髓损伤后血清miRNA-21表达与损伤程度的相关性分析[J]. 中国实验诊断学,2021,25(2):264-267. [20] 张飞鹏. 影响青少年身高生长因素分析[J]. 西安文理学院学报:社会科学版,2011,14(1):92-93. [21] 肖爱,吴艳红,江霞.早期干预在身高矮偏离儿童中的作用[J].中国现代医生,2021,59(17):57-59. [22] ARAB-ZOZANI M, KHEYRANDISH S, RASTGAR A, et al. A Systematic Review and Meta-Analysis of Stature Growth Complications in β-thalassemia Major Patients. Ann Glob Health. 2021;87(1):48. [23] 宋逸,闫晓晋,张京舒,等.1985-2014年中国汉族18岁青少年身高长期趋势的性别差异变化中华流行病学杂志,2021,42(5):801-806. [24] 丁亚,董磊,崔西龙,等.可调节式骨科手术架在强直性脊柱炎伴脊柱后凸畸形矫形中的应用[J].中国脊柱脊髓杂志,2021,31(1):91-94. [25] 朱欢叶,李波,简月奎,等.选择性置钉固定在青少年特发性脊柱侧弯矫形中的研究进展安徽医药, 2019,23(7): 1277-1280. [26] 杨华清,夏和桃,彭爱民,等.不同类型延长器在胫骨延长术治疗双小腿不等长及身材矮小症的效果比较[J].中国临床康复,2006, 10(32):23-26. [27] HAJZADEH G, GHAEMI N, HADJZADEH MA, et al. The Effects of Gonadotropin-Releasing Hormone Analog and a Combination of Gonadotropin-Releasing Hormone Analog and Recombinant Human Growth Hormone on Adult Height in Girls with Early Puberty. Adv Biomed Res. 2019;8:57.  [28] SPRINCHUK NA. Assessment of somatotropic function in children with syndrome of biologically inactive growth hormone against a background of clonidine and insulin stimulation tests. Int J Endocrinol. 2019;15(2):148-151. [29] NATALIIA S, OLENA B. Influence of recombinant growth hormone treatment on the state of pituitary-thyroid and pituitary-adrenal systems in children with syndrome of biologically inactive growth hormone. Med Sci. 2019;2(5):19-22. [30] BRIGANTE G, RICCETTI L, LAZZARETTI C, et al. Abacavir, nevirapine, and ritonavir modulate intracellular calcium levels without affecting GHRH-mediated growth hormone secretion in somatotropic cells in vitro. Mol Cell Endocrinol. 2019;48(2):37-44. [31] 李桂梅,王倩. 重组人生长激素治疗对儿童甲状腺功能和骨骼的影响[J]. 实用儿科临床杂志,2011,26(20):1546-1548. [32] 刘甜,刘世平,谢坤霞,等. 重组人生长激素在矮小儿童生长方面的应用进展[J]. 世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2021, 21(18)125-126,129. [33] 姚海波. 重组人生长激素注射液联合注射用曲普瑞林治疗68例青春期非生长激素缺乏身材矮小患儿的短中期随访研究[J]. 中国药物与临床,2019,19(6): 957-959. [34] 张涤清 李明. Ghrelin对骨及软骨生长作用研究进展[J]. 国际骨科学杂志,2010,31(1):45-46. [35] BRIGHT GM, FIERRO-RENOY JF. A rationale for the treatment of short stature in children with the combination of recombinant human growth hormone (rhGH) and recombinant human insulin-like growth factor-I (rhIGF-I). Growth Horm IGF Res. 2020;52:101318. [36] RICHMOND E, ROGOL AD. Treatment of growth hormone deficiency in children, adolescents and at the transitional age. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2016;30(6):749-755.  [37] THORNTON PS, MANIATIS AK, AGHAJANOVA E, et al. Weekly Lonapegsomatropin in Treatment-Naive Children With Growth Hormone Deficiency: The Phase 3 heiGHt Trial. J Clin Endocrinol Metab. 2021;106(11):3184-3195. [38] GRIMBERG A, ALLEN DB. Growth hormone treatment for growth hormone deficiency and idiopathic short stature: new guidelines shaped by the presence and absence of evidence. Curr Opin Pediatr. 2017;29(4):466-471.  [39] PALTOGLOU G, DIMITROPOULOS I, KOURLABA G, et al. The effect of treatment with recombinant human growth hormone (rhGH) on linear growth and adult height in children with idiopathic short stature (ISS): a systematic review and meta-analysis. J Pediatr Endocrinol Metab. 2020;33(12):1577-1588. [40] HOU L, LIANG Y, WU W, et al. Comparison of the efficacy and safety of recombinant human growth hormone in treating idiopathic short stature and growth hormone deficiency in children. Growth Horm IGF Res. 2020;53-54:101331. [41] BERTELLONI S, MASSART F, MICCOLI M, et al. Adult height afterspontaneous pubertal growthor GnRHanalog treatment ingirls withearlypuberty: ameta-analysis. Eur J Pediatr. 2017; 176(6):697-704.

[1]	项鑫健, 柳 芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶 越, 赵政男, 赵 宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	周洪琴, 吴丹丹, 杨 琨, 刘 琪. 传递特定miRNA的外泌体可调控成骨并促进成血管[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1107-1112.
[3]	范建超, 徐派的, 韩永丽, 文彩玉珠, 张红星, 潘小丽. 电针足三里对功能性消化不良模型大鼠内脏高敏感性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 663-668.
[4]	莫伟彬, 黄天昌, 曾智伟, 燕林博. 葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 736-741.
[5]	徐 静, 严永敏, 蔡梦洁. miR-373下调转化生长因子βⅡ型受体表达抑制肝星状细胞活化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 756-761.
[6]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[7]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[8]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[9]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨 生, 季 平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[10]	刘雅普, 苏圆圆, 刘 祺, 杨 舟, 李 榕, 黄祖成, 黄志平, 吴晓亮, 朱青安. 三羟乙基芦丁对大鼠颈脊髓损伤的抗氧化应激作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(36): 5868-5874.
[11]	林家煜, 黄惠斌, 梁 波, 陈丽君. 高强度间歇运动肥胖大鼠鸢尾素、瘦素、脂联素和内脏脂肪的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5583-5588.
[12]	陈 楚, 欧阳厚淦, 齐艳喆, 朱绪映, 王 姿. 热敏灸手少阳三焦经可改善银屑病样大鼠模型的皮损病变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5602-5606.
[13]	耿 欢, 罗振东, 孙芳园, 孟佳磊, 马宇慧, 雷 鸣. 电针足三里减轻脓毒症模型大鼠心肌损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5614-5619.
[14]	刘丹妮, 孙光华, 周桂娟, 刘红雅, 周 君, 谭金曲, 黄夏荣, 彭 婷, 封蔚彬, 罗 敷. 电针水沟、百会穴对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质神经元凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5620-5625.
[15]	徐怡馨, 王一鑫, 李永明. 鼻阻塞模型大鼠下颌骨自噬水平的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(35): 5633-5638.

随着生活水平不断提高，人们普遍认为身高较高者有更多机遇、更受重视，一些特殊职业，如空乘、体育、播音主持、模特专业等，对身高也有一定要求。还有研究表明，身高会影响人们的社会知觉、人格、择偶行为和心理健康水平[1]。作者前期研究发现酸枣仁提取物(市售，含皂甙3%-5%，市场名称为酸枣仁皂甙，实为提取物，天然酸枣仁中含皂甙0.1%-0.04%；是由酸枣仁粉末用60%-70%乙醇回流提取3次，2 h/次，然后浓缩喷雾干燥而成)可以通过提高小鼠脑组织Gi/o蛋白的表达，通过cAMP-PKA途径提高5-羟色胺1A受体(serotonin 1A receptor，5-HT1AR)在脑内的表达水平和活性，还可延长慢波睡眠，进而促进生长激素的分泌，发挥促进骨骼增长的生物学效应[2-7]；同时发现药物会降低5-羟色胺2A受体(serotonin 2A receptor，5-HT2AR)在脑组织中的表达。5-HT2AR与5-HT1AR同为5-羟色胺受体，也是目前关注较多的5-羟色胺受体，5-HT2AR作为蛋白质也受microRNA(miRNA)调控。作者进一步对酸枣仁提取物调控靶向5-HT2AR促进骨骼增长的miRNA进行了筛选研究。

miRNA是一类存在于动植物体内的内源性非编码单链小分子RNA，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用[8]。miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关，miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。很多报道将之形象地称为miRNA对mRNA的海绵吸附作用[9-13]，因此机体也可以通过影响miRNA的表达对5-HT2AR的表达水平进行调控。作者此次筛选由酸枣仁提取物调控5-HT2AR引起与普通小鼠身长差异有显著性意义的小鼠差异表达的miRNA，进一步为今后多靶点调控骨骼增长提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，计量资料比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2020年12月在河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)医学实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   雄性昆明种小鼠60只，SPF级，25 d龄，体质量15-17 g，动物许可证号SCXK(豫)2010-0002；SD大鼠24只，SPF级，雌雄各半，体质量200-240 g，动物许可证号SCXK(豫)2015-0001，均由河南省实验动物中心提供。动物饲养环境温度20-24 ℃，湿度50%-70%，12 h明暗交替，噪声< 50 dB。实验方案经河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)动物实验伦理委员会批准，批准号：KY2019-004-05。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   药物与试剂   酸枣仁提取物，由陕西斯诺特生物技术有限公司提供(批号：201406)；酸枣仁皂甙A(纯度>98%，批号：A0274)，购于中国食品药品检定研究院，以上药物使用时药物用纯净水溶解；5-HT2AR阻断剂M100907(美国SIGMA公司，货号：M3324)；小鼠5-HT2AR ELISA试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号：201510)；RNA提取液(武汉谷歌生物科技有限公司，货号：G3013)；三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818)；异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：80109218)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218)；HyPureTM Molecular Biology Grade Water(HyClone公司，货号：SH30538.02)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司，货号：#K1622)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche公司，货号：04913914001)。
1.3.3   仪器   荧光定量PCR仪(ABI公司，美国，型号：Stepone plus)；超微量分光光度计(Thermo公司，美国，型号：NanoDrop2000)；台式高速冷冻型微量离心机(DragonLab公司，美国，型号：D3024R)；酶标仪(Labsystems Multiskan MS，芬兰，352型)；超微量核酸蛋白浓度测定仪(Thermo Fisher，美国，型号：nanodropone)；基因芯片微阵列扫描仪(Agilent，美国，型号：SureScan)。
1.4   方法   
1.4.1   酸枣仁提取物促进小鼠骨骼增长及对血清生长激素和脑组织5-HT2AR表达的影响   选取同时期出生的10胎昆明种小鼠，每胎5只，每胎的5只按随机数字表法分到空白对照组、酸枣仁提取物高、低剂量组(以下简称高、低剂量组)、阳性对照组和5-HT2AR选择性抑制剂组(以下简称抑制剂组)，以规避遗传因素的影响，每组10只。5组小鼠给药前测量原始体长(从头部最顶端到小鼠臀尾交接处)，测量结果显示各组差异无显著性意义(P > 0.05)。各组小鼠适应环境1周后开始灌胃，1次/d；空白对照组灌胃去离子水；高、低剂量组每日灌胃酸枣仁提取物混悬液0.32 mg/g及0.16 mg/g；阳性对照组灌胃酸枣仁皂甙A标准品溶液0.013 mg/g；抑制剂组灌胃酸枣仁提取物水溶液(高剂量0.32 mg/g)，最后3 d给予5-HT2AR阻断剂M100907侧脑室注射[10 μg/(只·d)]。灌胃后第25天用直尺测定小鼠体长，精确到1 mm。

用浸泡乙醚的棉球三四个，放入烧杯中，将小鼠放入烧杯内，盖上培养皿做为盖子，一两分钟即可麻倒小鼠。麻醉小鼠后眼眶取血，自然凝固20 min后离心取上清液；取脑组织，称质量，加入9倍PBS，冰浴上匀浆，以离心半径3 000 r/min离心20 min，收集上清液，采用ELISA试剂盒测定血清生长激素水平和脑组织5-HT2AR水平。

1.4.2   酸枣仁提取物对大鼠慢波睡眠的影响   选用头部稍大的SD大鼠饲养1周适应环境后，按随机数字表法分为空白对照组、酸枣仁提取物组、阳性对照组、抑制剂组，后3组均按照体表比以小鼠酸枣仁提取物高剂量组、阳性对照组和抑制剂组用药剂量换算而来，每组6只。用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，颅顶脱毛后沿矢状线切开，暴露颅骨并打孔，在枕叶和颞叶放置电极记录脑电，将电极导线连接于微型插座上，用自凝牙托水拌牙托粉固定，术后给予大鼠青霉素肌内注射预防感染。大鼠恢复1周后，开始记录脑电并存于微机硬盘上，共记录6 h。分析时，将脑电复原，以每15 s为一单位，采用WXL睡眠自动分析系统判断慢波睡眠时长，慢波睡眠时期的特征为：脑电波频率变慢，成同步化，α波减少，“梭形”波消失，出现θ波，最后出现高振幅的δ波。计算6 h内觉醒期、慢波睡眠期、异相睡眠期及总睡眠期时长，连续记录3 d，取平均值。4组动物慢波睡眠时长进行统计差异无显著性意义后开始灌胃给药。空白对照组灌胃去离子水；酸枣仁提取物组按照0.22 mg/g灌胃酸枣仁提取物水溶液；阳性对照组灌胃酸枣仁皂甙A标准品0.009 mg/g；抑制剂组灌胃酸枣仁提取物的同时，每天给予5-HT2AR阻断剂M100907侧脑室注射，70 μg/只，1次/d，于灌胃第3天开始，末次灌胃及注射30 min后，同样记录脑电，分析用药后4组大鼠睡眠情况。
1.4.3   药物引起骨骼增长的小鼠与普通小鼠脑组织差异表达miRNAs的筛选   选择出生25 d左右、来自于同一时期10胎的昆明种小鼠，雄性，每胎2只，每胎的2只随机分为空白对照组和用药组，每组10只。测量原始体长，统计无差异下，适应环境饲养1周，然后空白对照组正常饲养，酸枣仁提取物组每日灌胃酸枣仁提取物混悬液0.320 mg/g，25 d后测量2组小鼠体长，统计两组小鼠平均体长有无统计学差异。挑选酸枣仁提取物组体长最长和空白对照组体长最短的来源于同一胎的原4对小鼠，麻醉后取其脑组织(小鼠死亡后10 min内取材并保存好)，组织块以PBS清洗干净，每50 mg组织加2 mL左右 Trizol溶液彻底匀浆裂解组织样品，操作在冰上进行。芯片法检测差异表达的miRNAs，Agilent小鼠miRNA微阵列目录来源于miRBase数据库v21.0(https://www.mirbase.org/)。靶向1 881个小鼠的miRNAs，样品标记和芯片杂交根据Agilent miRNA Microarray Systemwith miRNA Complete Labeling and Hyb Kit实验方案(Agilent Technology)执行，具体步骤为：①来自每个样品的miRNA在T4 RNA ligase作用下用Cyanine 3-pCp标记；②标记产物浓缩干燥后用水重溶；③芯片杂交；④杂交芯片被洗涤，固定并扫描(Agilent Microarray Scanner(part number G2505C)。收集所有用药组倍数变化值(FC)≥1.5，且P值≤0.05的差异表达miRNAs，建立差异表达miRNAs库。
1.4.4   利用生物学网站预测与5-HT2AR结合的miRNAs   在miRNADB网站(http://mirdb.org/)预测可以调控5-HT2AR的miRNAs，与芯片法筛选的miRNAs取交集。同时在RNAhybrid网站中(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)输入筛选的miRNA和5-HT2AR的基因序列，预测两者结合位点。通过结合的能量和碱基配对情况，确定两者的结合力强度和结合位点。
1.4.5   以5-HT2AR为靶基因的miRNA的qRT-PCR验证   采用Trizol试剂一步法提取小鼠脑组织细胞总RNA，并用紫外分光光度计测定提取的RNA浓度及通过A260 nm/A280 nm比值检测RNA的纯度。按照miScript ⅡRT Kit反转录试剂盒说明书进行操作，以提取的RNA为模板反转录成cDNA。用所得cDNA为模板进行qRT-PCR，引物序列见表1。每个标本都用U6做内参照，反应体积20 μL，反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；59 ℃，50 s；共40个循环。 

1.5   主要观察指标   直尺测量小鼠体长；ELISA法检测血清生长激素及脑组织中5-HT2AR表达水平；基因芯片法检测脑组织差异表达的miRNA；插入脑电极法观察大鼠各睡眠时相。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经河北医科大学生物统计学专家审核。以EXCEL录入数据，SPSS 22.0软件进行统计分析。药物对小鼠体长、生长激素和5-HT2AR的影响采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法；qRT-PCR法验证差异表达的miRNA用两独立样本的t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣的种子，功能为养肝、宁心、安神、敛汗，具有镇静、催眠作用。作者的前期研究发现酸枣仁提取物可以促进小鼠体长增长，其作用为引起脑组织5-HT1AR表达上调进而促进了5-HT1AR与5-羟色胺的结合，从而促进了慢波睡眠，引起生长激素分泌增多。进一步研究发现，酸枣仁提取物可以调控5-HT2AR的表达，且5-HT2AR的高表达会竞争性抑制5-HT1AR与5-羟色胺的结合，抑制生长激素的分泌。酸枣仁提取物降低5-HT2AR的表达也直接促进了5-HT1AR与5-羟色胺的结合，而5-HT2AR作为一种蛋白受miRNA调控，因此作者进一步研究酸枣仁提取物是否通过干预miRNA而调控5-HT2AR的表达丰度。对酸枣仁提取物灌胃后小鼠差异表达的miRNAs进行筛选，其中符合差异倍数≥1.5、P < 0.05上调的miRNA共13个，下调的miRNA有3个。由于小鼠给予酸枣仁提取物后5-HT2AR较空白对照组呈现低表达趋势，所以作者关注上调的miRNAs，经过生物信息学网站筛选，将目标确定为miR-34a-5p；而且对miR-34a-5p在酸枣仁提取物组和空白对照组中的表达进行了qRT-PCR检测，证明其确实在酸枣仁提取物组表达升高。

由于生物体的骨骼增长70%-75%受到父母双方基因的影响，25%-30%受到后天环境及各种因素的干扰[14-17]，所以作者为了尽量避免父辈基因对实验的干扰，特别选取了来自同一时期同一胎的小鼠分在各个组，规避遗传干扰的风险；而且几次预实验发现这种干预也确实降低了组间的离散程度。

此次研究在观察药物促进小鼠体长实验中设立了酸枣仁提取物高、低剂量组，结果发现高剂量组促进小鼠体长的作用明显，为了减少实验的复杂性，在给予大鼠药物观察对慢波睡眠的影响及筛选药物引起差异表达的miRNA时，均选取了高剂量酸枣仁提取物；且大鼠的给药剂量是按照小鼠给药剂量通过体表比换算的。

miRNA是一类存在于动植物体内、大小为21-25 nt的内源性非编码单链小分子RNA，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用。miRNA通常靶向1个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达[18]。人类基因组中存在超过1 000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因[19]。miRNA不仅可以作为治疗疾病的手段，由于其极低的表达量可以通过PCR实验扩增，所以可以作为疾病诊断的早期诊断物，因此对于miRNA的研究意义重大。

目前促进非疾病性矮小青少年身高增长主要有以下几种方法[20-21]：①营养的补充：即在青少年生长期补充适量的蛋白质、钙、磷、维生素等；②多接受阳光照射：可促进新陈代谢，对维生素D的合成与钙的吸收有促进作用，从而加速骨的生长发育；③体育锻炼和劳动；④药物治疗：目前的药物治疗大多都是外用激素促进身高的增长；⑤针灸、理疗等；⑥骨科矫形肢体延长术：此种方法患者痛苦大，而且手术延伸操之过急会使骨不愈合，必须重新接骨，使得骨比原来更短[22-23]。其中前3条都是父母经常运用的，且青少年学习比较紧张，多晒太阳和进行体育锻炼就显得心有余而时间不足；药物治疗使用生长激素会升高血糖[24-30]，且价格昂贵，针灸、理疗耗费时间，学生们一般无法长时间进行；骨科延长术更不建议使用。因此，对目前的青少年而言，能够促进身高增长的有效且无害的方式似乎只有从营养上补充而已，仅此一项，手段单一。研究证明，生长激素和雄激素都促进骨骼生长[31-40]，但雄性激素虽可以短期见效，却可致骨骺提前闭合，骨龄增加，导致青少年提前停止生长[41]，因此，人体身高的决定性因素还是生长激素，而利用毒副反应小的中药提取物通过改善睡眠促进身高的增长无异是一种简单易行的方法，且其作用为提高了miR-34a-5p的表达，从而下调了对于慢波睡眠延长有负调控作用的5-HT2AR，这为今后用miRNA治疗骨骼增长提供了可能性，且其方法简单直接地给予前体既可，同时也为身材矮小者在未出现趋势前即可进行诊断提供了帮助。此次研究为今后探索促进骨骼增长的方向提供了新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
骨骼增长：此文的骨骼增长是指长骨及脊柱的生长，会促进人体及动物的身高增长。促进身高增长主要有两种手段，一是促进骨的更快生长，包括以中医药疗法，激素疗法、针灸、穴位按摩等；再一个手段是延迟骨骺的闭合，给骨更多的生长时间。此文涉及的是中药疗法通过调控miRNA，抑制5-羟色胺2A受体的表达，从而延长慢波睡眠，促进生长激素分泌，进而促进骨的生长，是一种基本无毒副作用的方法。
MicroRNA (miRNA)：是一类内生的、长度为20-26个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类1/3的基因，miRNA最重要的一个功能是在动植物中以负调控方式参与转录后基因表达调控。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

(1)目前大部分医疗机构都是以直接注射生长激素的方式促进骨骼增长，存在升高血糖等副作用。我们的研究通过基本无毒副作用的中药促进生长激素分泌的方式促进了骨骼增长。 

(2)药物发挥作用的生物学机制为调控了脑组织miRNA的表达，从而降低了5-HT2AR的丰度，以失去竞争抑制的方式促进了5-羟色胺与5-HT1AR的结合，从而延长了慢波睡眠，促进了生长激素的分泌，促进了骨骼增长。目前，国内尚没有中药通过调控脑组织miRNA的表达促进骨骼增长的报道。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要