选择性瞬变感受器电位蛋白V4激动剂GSK1016790A对轴突再生的影响

doi:10.12307/2022.574

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3903-3907.doi: 10.12307/2022.574

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

选择性瞬变感受器电位蛋白V4激动剂GSK1016790A对轴突再生的影响

秦绪祯1，马进进1，李梅梅2，王星然2，谢计乐2，赛吉拉夫1，2

1苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2020-11-30 接受日期:2021-01-16 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 赛吉拉夫，特聘教授，博士生导师，苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000
作者简介:秦绪祯，男，1994年生，黑龙江省鹤岗市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事骨与神经再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81571189，81772353)，项目负责人：赛吉拉夫；国家重点研究发展计划(2016YFC1100203)，项目负责人：赛吉拉夫；江苏省创新创业计划，项目负责人：赛吉拉夫

Effect of transient receptor potential vanilloid 4 agonist GSK1016790A on axonal regeneration

Qin Xuzhen1, Ma Jinjin1, Li Meimei2, Wang Xingran2, Xie Jile2, Saijilafu1, 2

1First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2020-11-30 Accepted:2021-01-16 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Saijilafu, Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Qin Xuzhen, Master candidate, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81571189, 81772353 (to Saijilafu); National Key Research and Development Plan, No. 2016YFC1100203 (to Saijilafu); Innovation and Entrepreneurship Plan of Jiangsu Province (to Saijilafu)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
GSK1016790A：是一种有效的选择性瞬变感受器电位蛋白V4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)通道激动剂。在人胚肾细胞中，GSK1016790A可以诱发Ca2+流入并提高细胞内Ca2+浓度。
背根神经节：脊髓背根相连的膨胀半透明结节，由感觉神经细胞组成，接收传入的感觉神经冲动，将它们传送到脊髓。

背景：选择性瞬变感受器电位蛋白V4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)激动剂GSK1016790A能够在短时间内激活TRPV4蛋白，表现为Ca2+内流，而蛋白表达量不变。但是在培养过程中，GSK1016790A会使HeLa细胞膜表面TRPV4表达降低，这一现象对神经再生是否产生影响仍不清楚。
目的：探究TRPV4激动剂GSK1016790A在不同时期内对神经元轴突再生的影响。
方法：取6-8周龄ICR小鼠背根神经节，经过胶原酶和胰酶处理使细胞充分解离，进行背根神经节细胞培养。在培养初期加入GSK1016790A刺激2 h后去除激动剂继续培养3 d，或者加入GSK1016790A持续处理3 d；空白对照组不进行任何处理。采用免疫印迹法检测TRPV4蛋白表达以及轴突再生相关蛋白表达，同时进行TUJ1和TRPV4免疫荧光染色，观察轴突分叉数目、轴突再生长度、细胞存活数变化。
结果与结论：①与空白对照组相比，GSK1016790A刺激神经细胞2 h后，TRPV4蛋白变化无明显差异(P > 0.05)；而刺激神经细胞3 d后TRPV4表达明显降低(P < 0.05)；②与空白对照组相比，GSK1016790A刺激神经细胞2 h后，轴突分叉数目及轴突长度无明显差异(P > 0.05)；而刺激神经细胞3 d后轴突分叉数目及轴突长度均明显增加(P < 0.05)；③与空白对照组相比，GSK1016790A刺激神经细胞2 h或3 d后，细胞存活率均无明显改变；④与空白对照组相比，GSK1016790A刺激神经细胞3 d后，PTEN蛋白表达降低(P < 0.05)，神经轴突再生显著，这一过程可能经抑制PTEN蛋白表达介导的。
缩略语：选择性瞬变感受器电位蛋白V4：transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4

https://orcid.org/0000-0003-2290-9808 (赛吉拉夫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 选择性瞬变感受器电位蛋白V4, GSK1016790A, 背根神经节, 神经再生, 轴突, PTEN蛋白

Abstract: BACKGROUND: The transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) agonist GSK1016790A can activate TRPV4 protein and induce Ca2+ influx in a short time, while its expression remains unchanged. However, during culture, the decreased expression of TRPV4 on HeLa cell membrane surface was induced by GSK1016790A. Whether the phenomenon had an effect on neural regeneration is still not clear.
OBJECTIVE: To explore the effect of TRPV4 agonist GSK1016790A on axonal regeneration in different periods.
METHODS: The dorsal root ganglion cells of ICR mouse at 6-8 weeks were treated by collagenase and trypsin for cell culture. In the 2-hour group, the agonist GSK1016790A was added at the initial stage of culture and the cells were treated for 2 hours and the culture was continued for 3 days. The 3-day group was treated with the agonist GSK1016790A for 3 days. The blank control group did not undergo any treatment. The TRPV4 protein expression and axon regeneration related protein expression were examined by western blot assay. TUJ1 and TRPV4 immunofluorescence staining was performed simultaneously. Number of axon branches, length of axon regeneration, and number of cell survival were counted.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the blank control group, there was no significant difference in TRPV4 protein changes after GSK101 stimulated nerve cells for 2 hours (P > 0.05); while the expression of TRPV4 decreased significantly after nerve cells were stimulated for 3 days (P < 0.05). (2) Compared with the blank control group, after GSK1016790A stimulated nerve cells for 2 hours, there was no significant difference in the number of axon branches and axon length (P > 0.05); after stimulating nerve cells for 3 days, the number of axon bifurcations and axon length were increased significantly (P < 0.05). (3) Compared with the blank control group, there was no significant change in cell survival rate after GSK1016790A stimulated nerve cells for 2 hours or 3 days. (4) Compared with the blank control group, after GSK1016790A stimulated nerve cells for 3 days, the expression of PTEN decreased (P < 0.05), and the regeneration of nerve axons was significant. This process may be mediated by inhibiting the expression of PTEN protein.

Key words: transient receptor potential vanilloid 4, GSK1016790A, dorsal root ganglion, nerve regeneration, axon, PTEN protein

中图分类号:

秦绪祯, 马进进, 李梅梅, 王星然, 谢计乐, 赛吉拉夫. 选择性瞬变感受器电位蛋白V4激动剂GSK1016790A对轴突再生的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3903-3907.

Qin Xuzhen, Ma Jinjin, Li Meimei, Wang Xingran, Xie Jile, Saijilafu. Effect of transient receptor potential vanilloid 4 agonist GSK1016790A on axonal regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3903-3907.

图/表（结果） 5

2.1 GSK101刺激神经细胞2 h与3 d对TRPV4蛋白表达的影响在非损伤和损伤情况下，GSK101刺激背根神经节细胞2 h后TRPV4蛋白表达量与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；刺激3 d后TRPV4蛋白表达量降低，与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 GSK101刺激非损伤组神经细胞2 h与3 d对神经轴突再生的影响在非损伤组中，GSK101刺激背根神经节细胞2 h后神经轴突再生情况与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；应用GSK101刺激背根神经节细胞3 d后，轴突生长优于空白对照组且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 GSK101刺激非损伤组神经细胞2 h与3 d对神经细胞存活率及轴突数目的影响在非损伤组中，GSK101刺激2 h或3 d对背根神经节细胞存活均无明显影响(P > 0.05)；3 d组次级轴突数目高于空白对照组且差异有显著性意义(P < 0.05)，而2 h组次级轴突数目与空白对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，说明2 h内应用GSK101对神经再生并无明显影响，而刺激3 d对神经生长有一定的促进作用，见图3。

2.4 GSK101刺激损伤组神经细胞2 h与3 d对神经轴突再生的影响在损伤组中，GSK101刺激背根神经节细胞2 h后神经轴突长度与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；应用GSK101刺激背根神经节细胞3 d后，轴突长度明显增加，与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示该激动剂可能通过非损伤再生途径激活轴突再生，见图4。

2.5 GSK101刺激非损伤组神经细胞2 h与3 d对轴突再生相关蛋白表达的影响 GSK101刺激非损伤组背根神经节细胞2 h后STAT3、C-JUN、ATF3、PTEN蛋白与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；刺激3 d后STAT3、C-JUN、ATF3蛋白表达与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，而PTEN蛋白表达与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示该激动剂可能通过抑制PTEN蛋白表达进而促进神经再生，见图5。

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引言

选择性瞬变感受器电位蛋白V4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)是一种广泛分布于细胞膜表面的温度和机械感受器，对细胞的功能至关重要[1]。作为TRP家族的一员，TRPV4最初由于其温度感受作用而被研究，后来发现TRPV4在不同组织中可以感受不同的机械刺激，如血流剪切力、膀胱压力、肺动脉压力，并可进一步调节血管、膀胱或者肺部的生理状态，成为近年热门的研究对象[2-5]。为了更加深入研究TRPV4在不同组织中的作用，改变TRPV4状态的药物必不可少。4α-PDD是TRPV4的特异性激动剂，在各个系统中被广泛应用，然而相关文献报道4α-PDD在神经系统中对感觉神经元的TRPV4没有选择性，仅有5%的细胞被特异性激活，这在一定程度上限制了对TRPV4在神经系统中的作用研究[6-7]。目前广泛使用的TRPV4激动剂GSK1016790A(GSK101)具有效价高、作用范围广等优点。该药物可以特异性激活神经系统的TRPV4，并在10 nmol/L浓度下可以快速引发由TRPV4通道激活导致的Ca2+内流以发挥效用[7-8]。有研究表明，神经细胞表面TRPV4蛋白通过PI3K途径介导Ca2+内流，而神经轴突损伤也可以上调PI3K，暗示了GSK101激活TRPV4与轴突再生可能存在相关性[9-10]。此外，长时间应用GSK101会导致TRPV4的表达降低，这一现象是否存在于神经系统？对神经再生产生何种影响[11]？为解答这些问题，该实验研究了GSK101在刺激神经细胞的不同时间跨度下，对神经细胞TRPV4表达量和轴突再生的影响，并通过轴突损伤模型确认PI3K途径在这一过程中的角色，最后通过验证神经再生领域的几种常见分子，试图探究GSK101对神经轴突再生影响的分子机制[12-15]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外原代细胞实验，细胞分子机制变化数据采用独立样本t 检验。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年11月在苏州大学附属第一医院南区骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄ICR雌/雄小鼠30只，雌雄不限，体质量25-35 g，饲养于苏州大学独墅湖校区SPF级动物房，许可证号：SCXK(苏)2017-0006，动物实验均遵照苏州大学实验动物饲养和使用指南。
1.3.2 实验试剂胶原酶A(Roche，瑞士)；胎牛血清(BI公司，以色列)；MEM培养基(Hyclone，美国)；层粘连蛋白、多聚-D-赖氨酸、青霉素/链霉素、叠氮化钠(Sigma-Aldrich，美国)；胰酶(Life Technology，美国)；RIPA buffer、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；SDS(北京索莱宝科技有限公司，中国)；显影液(Thermo公司，美国)；吐温20(国药集团化学试剂有限公司，中国)；MOWIOL(北京海德创业生物科技有限公司，中国)；多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；Tris(Amresco公司，美国)；脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，中国)；甲醇、多聚甲醛、无水乙醇、无菌去离子水(国药集团化学试剂有限公司，中国)；兔抗TRPV4抗体(Abcam，英国)；小鼠抗C-JUN抗体(Cell Signaling Technology，美国)；小鼠抗PTEN抗体(Santa Cruz，美国)；小鼠抗神经元特异性β-tubulin 抗体(TUJ1)抗体(Sigma-Aldrich，美国)；兔抗GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，美国)；TRPV4激动剂GSK1016790A(Selleck，中国)。
1.3.3 实验器材超净工作台(ESCO，新加坡)；正置荧光显微镜(ZEISS公司，德国)；超高灵敏化学发光成像仪(Bio-Rad，美国)；细胞爬片(苏州世泰实验器材有限公司，中国)；高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)；超纯水仪、细胞培养箱、24孔板(Thermo Fisher Scientific，美国)；pH仪(上海市仪电科学仪器股份有限公司，中国)；水平摇床(上海旻泉仪器有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组实验分为坐骨神经损伤组、非损伤组，并根据GSK101处理时间不同，两组内各设置2 h组、3 d组、空白对照组。损伤组、非损伤组小鼠的背根神经节随机接受GSK101处理不同时间，并设置空白对照组。
1.4.2 坐骨神经损伤随机选取10只ICR小鼠制备坐骨神经损伤模型，麻醉后将大腿外侧毛发剃净，消毒后沿股骨剪开皮肤，分离股外侧肌，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段剪去约5 mm，其余20只小鼠不造模。
1.4.3 获取小鼠背根神经节取上述坐骨神经损伤3 d和非损伤ICR小鼠，颈椎脱臼处死后取出脊柱，充分暴露脊柱两侧肌肉，用镊子将椎板轻轻取下，暴露与脊髓相连的背根神经节，用显微剪将背根神经节完整取下后(不包含相连的神经纤维)，放入事先备好的盛有MEM培养基的1.5 mL离心管中，将离心管放入冰盒上，按照24孔板每孔需1个背根神经节获取背根神经节数量。
1.4.4 背根神经节神经元细胞培养将获取的背根神经节放入含胶原酶(1 g/L)的MEM培养基中，水浴加热至37 ℃，1.5 h后更换为胰酶(1×)消化15 min，然后吸出胰酶，加入含体积分数为10%胎牛血清的MEM培养基，清洗3次，终止胰酶消化；用1 mL移液枪将背根神经节充分吹散后离心(700 r/min，6 min)，弃上清，将细胞转移至15 mL离心管中，加入含体积分数为5%胎牛血清、0.1%氟尿苷和0.1%双抗的MEM培养基重悬。将事先包被有多聚-D-赖氨酸(100 mg/L)和层粘连蛋白(10 mg/L)混合物(PL10)的无菌细胞爬片在37 ℃恒温孵育2 h后取出，吸去PL10，用无菌0.01 mol/L PBS清洗3次，加入细胞悬液500 μL，空白对照组不进行任何处理培养3 d，2 h组在加入10 nmol/L GSK101干预2 h后换为无药物MEM培养基培养3 d，3 d组加入10 nmol/L GSK101干预3 d。
1.4.5 神经元免疫荧光染色将培养结束的神经细胞从培养箱取出，吸去培养基，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min，吸出多聚甲醛溶液，0.01 mol/L PBS清洗3次，加入2%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h，将细胞爬片反扣在滴有30 μL 2%牛血清白蛋白溶液配置的TRPV4、TUJ1一抗溶液中(1∶1 000)孵育1.5 h，0.01 mol/L PBS清洗，加入二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，洗净二抗后使用抗荧光淬灭剂进行封固。
1.4.6 神经元计数、轴突长度、细胞荧光强度将染色后的细胞爬片放置在正置荧光显微镜下，使用AxioVision 4.72软件进行拍摄，使用Image J(1.8.0，USA)软件分析细胞轴突长度及荧光强度，轴突长度超出胞体2倍的神经元将纳入统计分析，每组统计100个神经元，重复3次。
1.4.7 蛋白免疫印迹及定量分析培养结束后使用RIPA将神经元细胞裂解，参照BCA蛋白浓度试剂盒测定细胞浓度，将蛋白浓度稀释至等浓度后加入20%的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加热变性(95 ℃，5 min)，在8%的SDS-PAGE凝胶中加入等体积的蛋白样品，在110 V电压下电泳约60 min(条带若未完全分离则适当延长电泳时间)，之后在250 mA恒流条件下转膜2 h，将转好后的PVDF膜加入5%脱脂牛奶封闭液室温封闭1 h，加入含STAT3、C-JUN、PTEN、ATF3、TRPV4一抗(1∶1 000)的封闭液4℃孵育过夜，洗净PVDF膜后加入与一抗对应属性的二抗(1∶1 000)孵育1 h，洗净二抗后加入ECL显影液进行显影，使用Image Lab 5.2.1软件进行蛋白定量分析，检测再生相关分子蛋白(STAT3、C-JUN、PTEN、ATF3、TRPV4)的表达，重复3次。
1.5 主要观察指标 ①轴突长度变化、神经细胞存活数及轴突分支数目；②神经细胞TRPV4荧光强度变化；③STAT3、C-JUN、PTEN、ATF3、TRPV4蛋白表达量变化。
1.6 统计学分析数据结果以平均值±标准误表示，使用GraphPad Prism 5.0软件分析，用独立样本t 检验确定组间是否有差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

已有研究表明，当小鼠体内GSK101浓度超过1 μmol/L时，会导致脑部海马体CA2/3区神经元的存活数量大量减少，表明高浓度的GSK101具有神经毒性[16]。但是，在实验过程中观察到GSK101刺激神经细胞3 d会使TRPV4蛋白表达发生较为明显的降低，而细胞存活无明显差异。因此，GSK101在应用浓度不显著减少存活神经元数量的前提下，依旧可以保持其良好的生物学效应。
大量研究表明，GSK101可以瞬时激活TRPV4，引发Ca2+内流并导致一系列细胞效应。因此，通过检测Ca2+电流变化可以确定TRPV4通道变化[17-19]。尽管GSK101具有调控神经系统的功能，但GSK101在神经系统功能方面的研究仍然较少。在一篇关于激活TRPV4介导Ca2+内流的文献中阐明，神经系统中TPRV4通过PI3K-PKC途径介导Ca2+的内吞作用[9]，同时也有研究表明TRPV4通过下调PI3K/Akt信号传导途径诱导细胞凋亡[16]，暗示TRPV4可能与PI3K途径相关。PI3K信号通路是参与神经损伤修复的重要分子途径[10]。研究表明，坐骨神经损伤后可以引起神经再生相关蛋白表达改变，如p-STAT3、C-MYC。该研究发现，将损伤后的神经细胞应用GSK101刺激3 d与刺激2 h相比，神经细胞的再生长度同样存在明显差异，推测该药物可能通过影响非损伤后修复神经的相关蛋白促进再生，如STAT3、PTEN、C-JUN、ATF3等[12]。若假设成立，则应避开与其相关的分子实验，以免产生干扰。另外，GSK101在其他组织中引起Ca2+内流是通过TRPV4介导的通道运输，并无分子改变[20-21]。该研究发现，GSK101可能通过降低PTEN蛋白表达促进轴突再生，而pten是近年来发现的轴突再生相关基因，敲除后激活PI3K/AKT通路的下游效应分子mTOR，其中mTORC1激活S6K1和4EBP1，控制细胞的生长、增殖和存活[14，22-24]。
此外，该激动剂长期应用可以促进少突胶质前体细胞的增殖而不影响其分化，但少突胶质前体细胞是形成轴突外髓鞘的关键物质，对轴突再生起着关键作用[25-26]。该实验并未对神经细胞进行纯化，所培养的细胞包含少突胶质前体细胞，未对其进行深入研究。此外，实验发现不同批次的小鼠背根神经节中TRPV4蛋白表达量存在明显差异，所以，选取的是同批次小鼠，以便尽可能降低实验误差。
实验仍存在一些不足之处：首先，不同种类的神经细胞对该药物的敏感性可能是不同的，该研究只探究了背根神经节神经元对该药物的反应，没有探究对其他种类神经元的作用。此外，只选取了常见的非损伤后促进神经再生相关蛋白作为研究对象，并不能代表全部。
该研究探究了GSK101对神经系统轴突再生的影响，结果表明2 h内应用不会引起TRPV4蛋白表达改变，应用3 d则会使蛋白表达降低。激活效率较4α-PDD有着明显提高，且长期使用会降低PTEN蛋白表达[7]。该研究证实了通过药物直接降低TRPV4可以促进神经再生，为临床治疗神经损伤提供了新的切入点，期待未来发明一种可以长期应用的高效TRPV4激动剂，以便科研人员进行神经方面的深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

选择性瞬变感受器电位蛋白V4激动剂GSK1016790A对轴突再生的影响

Effect of transient receptor potential vanilloid 4 agonist GSK1016790A on axonal regeneration

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