自噬相关基因Rubicon缺失可抑制心脏细胞衰老

doi:10.12307/2022.573

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3897-3902.doi: 10.12307/2022.573

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

自噬相关基因Rubicon缺失可抑制心脏细胞衰老

何帆，来帅威，张沙沙，董凡，Amber Naz，Haniya Mazhar，贺林，朱洪新

上海交通大学Bio-X研究院，遗传发育与精神神经疾病教育部重点实验室，上海市 200240

收稿日期:2021-04-07 接受日期:2021-05-21 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 朱洪新，副研究员，上海交通大学Bio-X研究院，遗传发育与精神神经疾病教育部重点实验室，上海市 200240
作者简介:何帆，男，1993年生，甘肃省兰州市人，汉族，2021年上海交通大学毕业，硕士，主要从事心血管疾病生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81974024)，项目负责人：朱洪新；上海市自然科学基金(16ZR1418200)，项目负责人：朱洪新

Autophagy-related gene Rubicon deficiency inhibits cellular senescence in the heart

He Fan, Lai Shuaiwei, Zhang Shasha, Dong Fan, Amber Naz, Haniya Mazhar, He Lin, Zhu Hongxin

Bio-X Institutes, Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders, Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Received:2021-04-07 Accepted:2021-05-21 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Zhu Hongxin, Associate researcher, Bio-X Institutes, Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders, Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
About author:He Fan, Master, Bio-X Institutes, Key Laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders, Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81974024 (to ZHX); the Natural Science Foundation of Shanghai, No. 16ZR1418200 (to ZHX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Rubicon基因：Rubicon(RUN domain and Beclin1 interacting protein)是自噬相关蛋白，是最初研究Beclin1相互作用蛋白时发现的细胞自噬抑制性蛋白。Rubicon可与Beclin1和Uvrag结合抑制自噬途径以及吞噬作用。Rubicon基因是编码Rubicon蛋白的基因，是一个细胞自噬负调控基因。
p53基因：是一种抑癌基因，是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。p53基因分为野生型和突变型两种，其产物也有野生型和突变型。野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用；突变型p53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。

背景：心脏衰老是心脏疾病的主要危险因素之一，而细胞衰老是心脏衰老的主要机制，在衰老相关心脏疾病中起重要作用。作者前期工作发现自噬相关基因Uvrag缺失促进小鼠心脏细胞衰老，Rubicon是Uvrag的抑制性互作蛋白，其对小鼠心脏细胞衰老的作用尚不明确。
目的：探讨Rubicon基因对心脏细胞衰老的影响。
方法：使用15月龄野生型小鼠、Rubicon基因缺失小鼠、Uvrag基因缺失小鼠作为观察对象，其中Uvrag基因缺失小鼠作为阳性对照。采用荧光定量PCR检测小鼠心脏组织衰老相关分泌表型相关因子mRNA表达变化，苏木精-伊红染色、天狼猩红染色、衰老相关β-半乳糖苷酶染色进行心肌组织学观察，蛋白免疫印迹检测小鼠心脏组织p53和p16蛋白表达量。实验方案经上海交通大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①苏木精-伊红染色和天狼猩红染色结果显示，Rubicon基因缺失改善了衰老过程中心肌细胞重塑及心脏纤维化；②衰老相关β-半乳糖苷酶染色发现，Rubicon基因缺失小鼠心脏衰老细胞较野生型对照组显著减少(P < 0.05)；③荧光定量PCR结果表明，Rubicon基因缺失小鼠心脏白细胞介素1β、白细胞介素6、转化生长因子β和Ⅲ型胶原α1链、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达量较野生型对照组显著下调(P < 0.05)；④免疫印迹结果显示，Rubicon基因缺失导致心脏组织衰老调控关键基因p53表达较野生型对照组显著降低(P < 0.05)；⑤提示Rubicon基因缺失可显著抑制小鼠心脏细胞衰老并延缓心脏衰老，Rubicon是潜在的抑制心脏细胞衰老、抗心脏衰老及衰老相关心脏疾病的靶分子。
缩略语：衰老相关分泌表型：senescence-associated secretory phenotype，SASP

https://orcid.org/0000-0002-0860-1455(何帆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: Rubicon, 细胞衰老, 心脏衰老, 衰老相关分泌表型, p53, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Cardiac aging is the major risk factor for heart diseases. Cellular senescence is the key mechanism of cardiac aging, which plays an important role in age-related heart disease. Our previous work has shown that deletion of autophagy-related gene Uvrag promotes cellular senescence in the heart. Rubicon is an inhibitory interacting partner of Uvrag. However, the function of Rubicon in cellular senescence in the heart remains unknown.
OBJECTIVE: To determine the effect of Rubicon gene on cellular senescence in the heart.
METHODS: Wild type and Rubicon-deficient mice at 15 months of age were utilized. Uvrag-deficient mice were applied as observation objects. Uvrag-deficient mice of the same age were used as positive controls. Fluorescence quantitative PCR was used to detect changes in mRNA expression of senescence-related secreted phenotype-related factors in mouse heart tissue. Hematoxylin-eosin staining, Sirius red staining, and senescence-associated β-galactosidase staining were performed to observe myocardial histology. Western blot assay was conducted to measure the expression of p53 and p16 protein in the mouse heart. The protocols were approved by the Animal Experiment Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining and Sirius red staining demonstrated that Rubicon deficiency ameliorated myocardial cell remodeling and cardiac fibrosis during aging. (2) Senescence-associated β-galactosidase staining displayed that Rubicon-deficient mice had significantly fewer senescence-associated β-galactosidase-positive cells in hearts from Rubicon-deficient mice than in control mice (P < 0.05). (3) Fluorescence quantitative PCR results suggested that expression of interleukin 1β, interleukin 6, transforming growth factor β, type III collagen α1 chain, and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 mRNA in hearts was significantly decreased in Rubicon-deficient mice than that in control mice (P < 0.05). (4) Western blot assay results showed that p53 protein abundance, a key protein regulating cellular senescence, was significantly lower in hearts from Rubicon-deficient mice than in control mice (P < 0.05). (5) It is indicated that Rubicon deficiency obviously inhibits cellular senescence in the heart and delays cardiac aging. Rubicon is a potential target for the treatment of cardiac aging and age-related heart disease.

Key words: Rubicon, cellular senescence, cardiac aging, senescence-associated secretory phenotype, p53, mice

中图分类号:

何帆, 来帅威, 张沙沙, 董凡, Amber Naz, Haniya Mazhar, 贺林, 朱洪新. 自噬相关基因Rubicon缺失可抑制心脏细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3897-3902.

He Fan, Lai Shuaiwei, Zhang Shasha, Dong Fan, Amber Naz, Haniya Mazhar, He Lin, Zhu Hongxin. Autophagy-related gene Rubicon deficiency inhibits cellular senescence in the heart[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3897-3902.

图/表（结果） 6

2.1 Rubicon基因表达情况此次研究所用基因敲除小鼠利用PB转座子插入干扰基因表达得到，为全身敲除小鼠[27，29]。提取各组小鼠心脏组织，利用免疫印迹法检测各组小鼠Rubicon基因表达情况。结果显示Rubicon基因缺失小鼠检测不到Rubicon蛋白目的条带，见图1，表明PB转座子插入成功干扰了Rubicon基因的表达，Rubicon基因缺失小鼠心脏中没有Rubicon基因表达。

2.2 Rubicon基因缺失改善心脏细胞衰老引起的细胞重塑形态学上心脏衰老通常表现为心肌肥厚和心脏纤维化增多[31]，细胞水平表现为单个心肌细胞增大，胶原积聚增加。在此次研究中，发现与野生型对照相比，Uvrag基因缺失导致小鼠单个心肌细胞横截面积显著增大，心肌纤维化显著增多，与作者之前的报道一致[28]。而与野生型对照相比，Rubicon基因缺失小鼠心肌细胞横截面积显著减小，见图2；心肌纤维化程度显著减轻，见图3，提示Rubicon基因缺失改善了小鼠心脏衰老过程中的细胞重塑。

2.3 Rubicon基因缺失减少小鼠心脏衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞衰老相关β-半乳糖苷酶是应用最广泛的细胞衰老标志物[32]，因此首先利用β-半乳糖苷酶染色检测Rubicon基因缺失对心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞的影响。结果显示，与野生型对照组相比，Uvrag缺失导致心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞显著增多，而Rubicon基因缺失小鼠心脏左心室组织衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞相较野生型对照组显著减少，见图4，表明Rubicon基因缺失抑制心脏细胞衰老。

2.4 Rubicon基因缺失降低心脏SASP因子表达分泌SASP因子是衰老细胞的一个重要特征，也常用作细胞衰老的标志物[33]。利用荧光定量PCR方法检测Rubicon基因缺失对心脏组织SASP因子表达的影响，结果显示15月龄Rubicon基因缺失小鼠心脏白细胞介素1β、白细胞介素6、转化生长因子β和Ⅲ型胶原α1链mRNA表达较野生型对照组显著下调；C-C基序趋化因子2 mRNA表达与野生型对照组无显著差异，此外，15月龄Rubicon基因缺失小鼠组织基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达量较相应野生型对照组显著下调，而基质金属蛋白酶组织抑制因子2、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的mRNA表达量无显著变化。以上结果表明Rubicon基因缺失抑制心脏SASP因子表达，见图5。

2.5 Rubicon基因缺失对细胞衰老调控蛋白p53和p16表达的影响 p53-p21及p16-pRb信号通路是两个主要的调控细胞衰老的信号通路，因此p53和p16是常用的衰老标志物。为了研究Rubicon基因缺失对心脏细胞衰老的影响，使用免疫印迹方法检测小鼠心脏组织中p53与p16的蛋白表达量。结果显示15月龄Rubicon基因缺失小鼠心脏p53蛋白表达量较野生型对照组显著下调，而Rubicon基因缺失对小鼠心脏p16蛋白表达无影响，见图6。这些证据进一步支持Rubicon基因缺失抑制心脏细胞衰老。

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引言

心血管疾病是导致人类过早死亡和致残的主要原因，其发病率在全球呈上升趋势[1]。心脏衰老是心血管疾病主要的独立危险因素。随着老龄化人口的增多，心血管疾病发病率也相应不断增加。细胞衰老是心脏衰老的主要机制，心脏衰老细胞累积是心脏结构和功能异常的主要因素，在心血管疾病发病和预后中均起着重要作用[2]。
细胞衰老是一种稳定的细胞代谢保持活跃但细胞周期停滞的状态[3]。细胞衰老的主要特点是细胞形态改变，细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶含量升高[4]，炎症因子、趋化因子和基质金属蛋白酶类等衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)表达上调[5]，衰老发生主要调控基因p53和p16表达上调等[6-7]。在动物模型中，选择性清除衰老细胞可以逆转年龄相关心脏疾病的病理变化。如在小鼠中清除衰老心脏细胞可以抑制心脏衰老表型[8]。在另一小鼠心脏自然衰老模型中，用药物ABT263清除衰老心肌细胞能够减少老年小鼠心脏纤维化，改善老年小鼠心脏舒张功能[9]。因此靶向清除衰老细胞将成为延缓心脏衰老和治疗年龄相关心脏疾病的重要手段[10]。寻找抗心脏衰老的靶分子对于心脏衰老的治疗具有重要意义。
细胞自噬(macroautophagy)是一种细胞内溶酶体降解系统。自噬可以通过清除毒性蛋白聚集物、受损线粒体、有害的活性氧化物及细胞内感染性病原体起到保护细胞的作用[11]。细胞自噬在维持细胞内稳态和预防广泛疾病如神经退行性疾病[12-13]、肝脏疾病和心力衰竭中起关键作用[14-17]。研究表明细胞自噬对细胞衰老也起着重要作用，但在不同的条件下细胞自噬对细胞衰老可以有不同的影响。细胞自噬既可以促进细胞衰老[18-19]，也可以抗细胞衰老[19-20]。
Rubicon(RUN domain and Beclin1 interacting protein)是自噬相关蛋白，是最初研究Beclin1相互作用蛋白时发现的细胞自噬抑制性蛋白[21]。Rubicon可与Beclin1和Uvrag结合抑制自噬途径以及吞噬作用[22-23]。Rubicon是PI3KC3的亚基，是负向调控自噬体成熟所必需的蛋白，并且在PI3KC3亚复合物中优先与Uvrag结合[24]，干扰Uvrag和C-Vps之间的相互作用从而抑制自噬小体成熟[25]。目前已有研究表明Rubicon基因缺失可通过激活细胞自噬来延长线虫和果蝇寿命，并能改善小鼠肾脏和神经年龄相关表型[26]。并且在作者前期的工作中已发现Rubicon抑制细胞自噬的主要互作蛋白Uvrag缺失小鼠的心脏细胞自噬受到阻断，细胞凋亡和炎症增加出现心功能下降和年龄相关心肌病[27]。进一步的研究发现Uvrag基因缺失促进小鼠心脏细胞衰老[28]。但Rubicon基因对心脏细胞衰老的作用尚不明确。此文主要利用Rubicon基因缺失小鼠研究Rubicon对心脏细胞衰老的作用。作者发现Rubicon基因缺失抑制小鼠心脏细胞衰老并延缓心脏衰老，Rubicon是潜在抗心脏衰老及衰老相关心脏疾病的靶分子。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计平行对照动物实验，两组数据间平均值比较采用Student’s t检验，多组数据间平均数比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点于2019年6月至 2020 年 12 月在上海交通大学生命科学技术学院 Bio-X 中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物实验用野生型小鼠和Rubicon基因缺失纯合子小鼠由Rubicon杂合子雄鼠(8周龄)与Rubicon杂合子雌鼠(8周龄)交配获得，Uvrag基因缺失纯合子小鼠由Uvrag杂合子雄鼠(8周龄)与Uvrag杂合子雌鼠(8周龄)交配获得，均由复旦大学发育生物学与分子医学研究所提供。
研究所用的野生型小鼠、Rubicon基因缺失小鼠和Uvrag基因缺失小鼠遗传背景均为FVB/NJ，具体信息分别见文献[27，29]，其中Uvrag基因缺失小鼠作为阳性对照。实验小鼠在无特殊病原(SPF级)条件下饲养，并保证12 h灯光/12 h黑暗(光照：07：00-19：00，黑暗：19：00-次日07：00)的人工模拟自然环境，小鼠在鼠笼中有充足活动空间，可以自由获取食物和水，培养过程中饮食饮水状况良好。此次研究中涉及的小鼠实验均严格遵守国际研究委员会指导准则。

将繁殖得到的野生型小鼠、Uvrag缺失纯合子小鼠、Rubicon缺失纯合子小鼠各取5只雄性小鼠平行饲养到15月龄。由于小鼠性别及生育情况会对小鼠心脏衰老产生影响[30]，所以此次研究中所用小鼠均为无生育史的雄性小鼠。

1.3.2 试剂研究中所用试剂见表1。

1.4 方法
1.4.1 小鼠基因型鉴定各组14 d龄小鼠剪鼠尾提取DNA，用引物PB、GL和GR通过常规PCR扩增，电泳分离PCR扩增产物，最后通过观察PCR扩增条带判断小鼠Rubicon基因存在情况，确定小鼠基因型。引物序列见表2。

1.4.2 组织学方法
小鼠解剖与取材：向野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠腹腔注射肝素和麻醉剂三溴乙醇，待深度麻醉后，打开胸腔解剖心脏，置预冷的Kreb溶液中清洗血液并去除多余的血管和结缔组织，用Kimwipes将水吸干并称质量。然后将小鼠心脏心房和右心室去除，将左心室分成两半置于液氮中，而后转移至-80 ℃冰箱保存。
苏木精-伊红染色：取所得野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏左心室最大横切面连续石蜡切片脱蜡复水后，用苏木精染液染色10 min，清水冲洗后于0.5%盐酸溶液中浸泡10 s，再次清水冲洗后于0.1%氨水中浸泡1 min，然后再次清水冲洗后用乙醇梯度脱水，最后使用伊红染色原液染色30 s，再脱水和二甲苯透明后用中性树胶封固，于光学显微镜下观察并拍照。
天狼猩红染色：取所得野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag缺失纯合子小鼠心脏左心室最大横切面连续石蜡切片脱蜡和复水后，使用天狼猩红染液避光染色1 h，使用乙酸溶液清洗2次后脱蜡复水再利用中性树脂封固，于光学显微镜下观察并拍照。
衰老相关β-半乳糖苷酶染色：取所得野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏左心室最大横切面连续冰冻切片，加入β-半乳糖苷酶染色固定液于室温固定15 min，使用PBS冲洗后加入染色工作液于37 ℃烘箱中染色过夜，然后再次PBS冲洗后70%甘油封固。最后在光学显微镜下观察并拍照。
1.4.3 组织总RNA提取及荧光定量PCR 称取约30 mg野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏左心室组织并提取总RNA。检测浓度后每个样本取500 ng总RNA用于cDNA合成，然后将cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，此次研究使用Gapdh为内参。荧光定量PCR引物序列见表3。

1.4.4 Western blot 称取小鼠心脏左心室组织约30 mg并提取小鼠心脏组织蛋白并检测浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转膜，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入一抗于4 ℃孵育过夜。使用TBST缓冲液洗膜后加入二抗于室温孵育1 h，最后再用TBST缓冲液洗膜后加入显影液显色。将所得结果拍照并定量分析。
1.5 主要观察指标 ①野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心肌组织变化；②野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞；③野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏衰老相关分泌表型因子表达；④野生型小鼠、Rubicon基因缺失纯合子小鼠和Uvrag基因缺失纯合子小鼠心脏细胞衰老调控蛋白p53、p16表达。
1.6 统计学分析用GraphPad Prism 8和Image J软件统计分析数据。均数用 x±s表示，两组数据间平均值比较采用Student’s t检验，多组数据间平均数比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

细胞衰老的特征包括形态扁平、体积增大、SASP因子表达增多、细胞周期调控蛋白p53或p16表达上调及衰老相关β-半乳糖苷酶活性增强等。此次研究中Uvrag基因敲除小鼠单个心肌细胞横截面积较野生型小鼠显著增大，SASP因子表达增多，p53表达上调及衰老相关β-半乳糖苷酶活性增强，表明Uvrag基因敲除促进心脏细胞衰老，这与作者之前的报道一致[28]；而Rubicon基因缺失小鼠单个心肌细胞横截面积则较野生型对照显著减小，提示Rubicon能够抑制心肌细胞衰老。心脏细胞除心肌细胞外还有成纤维细胞、起搏细胞、内皮细胞及平滑肌细胞等，Rubicon基因缺失对心脏其他类型细胞衰老的作用将来需要进一步分析。衰老细胞在pH值为6时会表达具有高酶活性的衰老相关β-半乳糖苷酶，因为它在静止或分化的细胞中无法检测[32]，所以经常用来检测细胞衰老情况。此次研究中发现Rubicon基因缺失小鼠衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞较野生型对照组显著减少，进一步证实Rubicon缺失能够抑制心脏细胞衰老。此外，与野生型对照小鼠相比，Rubicon基因缺失小鼠心脏组织白细胞介素1β、白细胞介素6、转化生长因子β、Ⅲ型胶原α1链和基质金属蛋白酶组织抑制因子1等衰老相关分泌表型表达显著下降。衰老相关分泌表型能够通过旁分泌方式促进临近细胞衰老，因此Rubicon缺失通过下调衰老相关分泌表型阻断细胞衰老向周围传播可能是其抑制心脏细胞衰老的重要途径。
p53与p16是介导细胞衰老发生及维持细胞衰老的关键信号分子。p53可以抑制细胞周期依赖激酶，在衰老细胞周期阻滞中发挥重要作用；p53也可抑制Parkin介导的线粒体自噬，加剧线粒体功能障碍，促进细胞衰老[34]。通过靶向Drp1/Parkin/PINK1信号通路改善线粒体功能可以抑制心肌细胞衰老[35]。此次实验结果显示，Rubicon基因缺失小鼠心脏组织p53蛋白表达量显著下降，但p16蛋白表达量无显著变化(图6)，提示Rubicon基因缺失对心脏细胞衰老的延缓作用主要通过p53信号通路介导。
已有许多研究表明细胞衰老加速与细胞自噬减少有关，促进自噬可能具有有效的抗衰老作用[36]。例如，自噬相关基因beclin1的一种敲入性突变可以破坏Beclin1-Bcl-2相互作用激活自噬，从而延长小鼠寿命[37]。此外，有研究表明抑制mTOR可以激活自噬从而延长小鼠寿命，并减轻年龄相关疾病[38]。鉴于Rubicon是Uvrag的抑制性互作蛋白，Rubicon基因缺失可能通过促进Uvrag活性增强细胞自噬，进而抑制心脏细胞衰老。由于线粒体功能障碍是促进心肌细胞衰老的关键特征[39-40]，作者之前的研究发现Rubicon基因缺失可以促进线粒体自噬从而改善线粒体质量，进而改善阿霉素诱导的心脏毒性[41]。因此Rubicon基因缺失也可能是通过线粒体自噬改善线粒体质量，从而抑制心肌细胞衰老。
最近有研究表明，Rubicon基因敲减能够延长线虫和果蝇的寿命；此外，Rubicon基因敲除小鼠肾脏间质纤维化减少及大脑α-突触核蛋白积累减少[26]。尽管上述研究未检测衰老相关心脏结构和功能变化，但Rubicon基因缺失显著改善器官衰老和作者的研究结果一致。
细胞衰老是心脏衰老的主要机制，心脏衰老主要表现为心肌肥厚、纤维化增加及心功能下降。此次研究发现15月龄Rubicon基因缺失小鼠单个心肌细胞横截面积显著减少，心脏纤维化显著减少，提示Rubicon基因缺失可以通过抑制心脏细胞衰老从而延缓心脏衰老。此次研究中没有检测Rubicon缺失对小鼠心脏功能的影响，但Rubicon基因缺失极有可能通过抑制细胞衰老影响老龄小鼠心功能，在未来的研究中将评价Rubicon基因缺失对不同年龄阶段小鼠心功能的影响。此外，此次研究中所用小鼠为全身敲除小鼠，其他组织器官Rubicon基因缺失在衰老过程中是否对心脏细胞衰老及心脏衰老产生影响？此外，在心脏多种细胞类型中，衰老相关分泌表型主要来自于哪种细胞？哪种或哪些细胞在Rubicon抑制心脏衰老过程中起主要作用？这些问题可以通过特定类型细胞特异性Rubicon敲除小鼠解决。
结论：此次研究发现Rubicon基因缺失显著抑制小鼠心脏细胞衰老并延缓心脏衰老。Rubicon是潜在的抑制心脏细胞衰老及抗心脏衰老及衰老相关心脏疾病的靶分子。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

自噬相关基因Rubicon缺失可抑制心脏细胞衰老

Autophagy-related gene Rubicon deficiency inhibits cellular senescence in the heart

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