钙敏感受体可影响持续性肺动脉高压新生模型小鼠的肺血管重塑

doi:10.12307/2022.539

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2708-2712.doi: 10.12307/2022.539

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钙敏感受体可影响持续性肺动脉高压新生模型小鼠的肺血管重塑

朱亚平1，李翔1，陈志文1，刘莹1，赵文卓1，马克涛2，谷强1

1石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；2石河子大学医学院，新疆维吾尔自治区石河子市 832000

收稿日期:2020-12-24 修回日期:2021-03-03 接受日期:2021-10-11 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 谷强，博士，主任医师，副教授，石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆维吾尔自治区石河子市 832000
作者简介:朱亚平，女，1990年生，甘肃省金塔县人，汉族，石河子大学在读硕士，主要从事新生儿持续性肺动脉高压相关基础及治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金 (81560257)，项目负责人：谷强

Calcium-sensitive receptors influence pulmonary vascular remodeling in neonatal mice with persistent pulmonary hypertension

Zhu Yaping1, Li Xiang1, Chen Zhiwen1, Liu Ying1, Zhao Wenzhuo1, Ma Ketao2, Gu Qiang1

1Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-12-24 Revised:2021-03-03 Accepted:2021-10-11 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Gu Qiang, MD, Chief physician, Associate professor, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shehezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhu Yaping, Master candidate, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shehezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560257 (to GQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
钙敏感受体：是经典的G蛋白偶联受体，通过一系列信号转导通路影响细胞的病理生理功能。钙敏感受体不仅在维持机体钙和其他金属离子的稳态中发挥重要作用，而且也参与激素分泌调节、离子通道激活、基因表达、细胞分化、增殖及凋亡等过程。
小凹蛋白：是构成细胞质膜小凹结构的核心蛋白，可与多种信号分子结合形成复合体，调控信号分子的活性状态，进而控制细胞的跨膜信号转导，参与细胞的生命活动，如细胞增殖、细胞内吞、胆固醇运输、细胞膜组装及信号转导等。

背景：课题组早期研究结果显示在新生小鼠持续性肺动脉高压模型中钙敏感受体的表达上调，在钙敏感受体激动剂组该上调趋势更加明显，而在钙敏感受体抑制剂组有所下降。
目的：探讨钙敏感受体在低氧诱导的持续肺动脉高压新生小鼠肺血管重塑中的机制。
方法：将80只刚出生的C57BL/6小鼠随机平均分成4个组。其中，低氧组、低氧+激动剂组(以下简称激动剂组)和低氧+抑制剂组(以下简称抑制剂组)同时放置于低氧箱中(氧浓度为12%)，后2组分别每天1次腹腔内注射钙敏感受体激动剂GdCl3(16 mg/kg)或抑制剂NPS2390(1 mg/kg)；常氧组小鼠暴露在空气中，与低氧组一样每天注射等量的生理盐水，共注射14 d，第15天麻醉后取出小鼠心肺组织。显微镜下测量各组小鼠心室壁及肺血管壁的厚度、观察肺泡形态学变化；使用酶联免疫吸附实验检测B型钠尿肽水平；使用Western bolt和免疫组化检测小鼠肺组织中小凹蛋白1蛋白的表达和定位，并使用qRT-PCR检测小凹蛋白1 mRNA的表达。实验方案经石河子大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准(批准号为2018-172-01)。
结果与结论：①与常氧组比较，低氧14 d后低氧组小鼠肺小动脉血管壁增厚、右心室与左心室壁厚度比及B型钠尿肽水平增加，平均肺泡内衬间隔变宽、径向肺泡计数减少，Western bolt和qRT-PCR显示小凹蛋白1蛋白和mRNA表达上调(P < 0.05)；激动剂组变化更为显著(P < 0.05)；抑制剂组可逆转低氧所致的变化(P < 0.05)；②结果提示，钙敏感受体影响持续肺动脉高压新生小鼠肺组织血管的重塑，其作用机制可能与改变了小凹蛋白1的表达有关。

https://orcid.org/0000-0002-3454-1038 (朱亚平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 小凹蛋白1, 钙敏感受体, 血管重塑, 持续性肺动脉高压, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown the up-regulated expression of calcium-sensitive receptors in the neonatal mouse model of persistent pulmonary hypertension. The up-regulation trend is more obvious in the calcium-sensitive receptor agonist group, while the expression is declined somewhat in the calcium-sensitive receptor inhibitor group.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of calcium-sensitive receptors in pulmonary remodeling in neonatal mice with hypoxia-induced persistent pulmonary hypertension.
METHODS: Eighty newborn C57BL/6 mice were randomly divided into four groups. Mice in the hypoxic group, the hypoxic+agonist group (hereinafter referred to as agonist group), and the hypoxic+antagonist group (hereinafter referred to as antagonist group) were placed in a hypoxic chamber simultaneously (oxygen concentration 12%). In addition, the agonist and antagonist groups were given intraperitoneal injection of calcium-sensitive receptor agonist GdCl3 (16 mg/kg) and inhibitor NPS2390 (1 mg/kg) once a day respectively. Mice in the normoxia group were exposed to air and injected with the same amount of normal saline daily as that in the hypoxic group. After 14 days, heart and lung tissues were removed. The thickness of ventricular wall and pulmonary vascular wall was measured and alveolar morphology was observed. The level of B-type brain natriuretic peptide was determined by enzyme linked immunosorbent assay. Western blot and immunohistochemistry were used to detect the expression and localization of caveolin-1 protein in mouse lung tissue, and qRT-PCR was used to detect the expression of caveolin-1 mRNA. The study protocol was approved by the Experimental Animal Ethic Committee of the First Affiliated Hospital of Shihezi University School of Medicine (approval No. 2018-172-01).
RESULTS AND CONCLUSION: After 14 days of hypoxia, the wall thickness of small pulmonary arterioles in mice increased, and the thickness ratio of right ventricle to left ventricle and B-type brain natriuretic peptide level increased in the hypoxic group compared with the normoxia group. The average alveolar lining interval was widened and the radial alveolar count decreased in the hypoxic group compared with the normoxia group. Western blot and qRT-PCR results showed that the expression levels of caveolin-1 protein and mRNA were up-regulated hypoxic group compared with the normoxia group (P < 0.05). These changes were more significant in the agonist group (P < 0.05), while the inhibitor group reversed the changes caused by hypoxia (P < 0.05). To conclude, calcium-sensitive receptor affects the vascular remodeling in the lung of neonatal mice with persistent pulmonary hypertension, and the mechanism may be related to the changes in the caveolin-1 expression.

Key words: caveolin-1, calcium-sensitive receptor, vascular remodeling, persistent pulmonary hypertension, mouse

中图分类号:

朱亚平, 李翔, 陈志文, 刘莹, 赵文卓, 马克涛, 谷强. 钙敏感受体可影响持续性肺动脉高压新生模型小鼠的肺血管重塑[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2708-2712.

Zhu Yaping, Li Xiang, Chen Zhiwen, Liu Ying, Zhao Wenzhuo, Ma Ketao, Gu Qiang. Calcium-sensitive receptors influence pulmonary vascular remodeling in neonatal mice with persistent pulmonary hypertension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2708-2712.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠80只，分为4组，造模过程中，由于个体差异和对低氧及干预药物的耐受程度差异等因素，正常组死亡2只，其他3组各死亡3只，69只进入结果分析。
2.2 新生小鼠的基本情况常氧组在模型制作过程中反应灵敏；低氧组和激动剂组精神状况较差甚至出现不同程度的呼吸困难；抑制剂组与低氧组相比精神状况较好，呼吸困难症状不明显，但与常氧组相比略差。造模完成后，与对照组小鼠终末体质量及体质量增长率[(5.54±0.34) g，(11.70±1.25)%)]相比，低氧组[(3.54±0.16) g，(7.95±0.98)%]和激动剂组[(3.29±0.14) g，(6.90±1.01)%]明显下降(P < 0.05)；抑制剂组小鼠终末体质量及体质量增长率[(4.62±0.13) g，(9.04±1.02)%]较低氧组和激动剂组有所增长(P < 0.05)。见图1。

2.3 各组小鼠肺动脉血管壁厚度的变化肺组织切片苏木精-伊红染色结果显示：常氧组小鼠血管壁厚度较薄为(11.73±1.24)%，低氧组(21.78±1.59)%和激动剂组(30.35±2.91)%，血管壁厚度明显增厚、管腔变窄(P < 0.05)；而抑制剂组血管壁增厚度为(15.40±1.83)%，与低氧组、激动剂组相比有所减轻(P < 0.05)。见图2。

2.4 各组小鼠肺组织中肺泡形态、大小及肺泡化程度的变化肺组织切片苏木精-伊红染色结果显示：与常氧组小鼠肺泡内衬间隔比较，低氧组和激动剂组值明显增大[依次为(133.79±11.56)，(199.06±14.29)，(230.81±19.16) μm，P < 0.05)，提示肺泡破坏严重，单个肺泡体积增大；而抑制剂组小鼠肺泡内衬间隔值[(150.11±11.13)μm]较低氧组减小(P < 0.05)，提示肺泡破坏有所减轻；与常氧组小鼠径向肺泡计数相比，低氧组小鼠肺泡化程度降低，径向肺泡计数减小，激动剂组更甚[依次为(5.00±0.82)，(3.00±0.82)，(2.75±0.96)个，P < 0.05]，而抑制剂组较低氧组小鼠肺泡化程度有所增高，径向肺泡计数增大[(4.50±0.58)个，P < 0.05]。见图3。

2.5 各组小鼠右心室壁厚度及B型钠尿肽浓度比较
2.5.1 心脏切片显示低氧组小鼠右心室与左心室壁厚度比较常氧组明显增大(依次为0.43±0.02，0.31±0.05，P < 0.05)，提示右心室壁增厚；激动剂组小鼠右心室与左心室壁厚度进一步增大(0.57±0.04，P < 0.05)；抑制剂组(0.33±0.04)小于低氧组和激动剂组，提示右心室肥厚有所逆转(P < 0.05)，见图4A。
2.5.2 ELISA结果显示与右心室壁厚度相似，低氧组及激动剂组小鼠心脏组织中B型钠尿肽水平明显高于常氧组(依次为(684±13)，(712±15)，(504±12) ng/L，P < 0.05)，而给予抑制剂后B型钠尿肽水平明显下降[(537±12) ng/L，P < 0.05]，见图4B。

2.6 各组小鼠肺血管小凹蛋白1的表达免疫组化结果显示：小凹蛋白1主要分布于肺小动脉血管中。与常氧组肺动脉血管中小凹蛋白1表达平均积分吸光度值(0.174 1±0.004 8)相比，低氧组小凹蛋白1的表达(0.266 9±0.010 3)增多(黄色)(P < 0.05)；激动剂组(0.307 0±0.009 8)增多更加显著(褐色)(P < 0.05)；而抑制剂组(0.220 1±0.012 7)较低氧组的表达有所减少(P < 0.05)，说明激动钙敏感受体在低氧的基础上进一步上调了小凹蛋白1的表达，而钙敏感受体的抑制可以逆转低氧引起的这种上调，见图5。

2.7 各组小鼠肺组织中小凹蛋白1蛋白及mRNA的表达 Western Blot和qRT-PCR结果显示：低氧组小鼠小凹蛋白1蛋白相对表达量为(2.60±0.08)及mRNA相对表达量为(4.76±0.09)，较常氧组上调(P < 0.05)，激动剂组二者相对表达量上调更加显著(4.12±0.15，14.21±0.08，P < 0.05)；而抑制剂组小鼠小凹蛋白1蛋白及mRNA的相对表达量分别为(2.39±0.06，2.82±0.04)，较低氧组有所减少(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计随机设计，分组对照动物实验，方差分析，LSD检验或Tamhane’s T2检验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2020年9月在石河子大学医学院国家卫健委中亚高发病防治重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂和仪器主要试剂：QuantiNova SYBR Green qPCR荧光定量试剂盒(美国Fermentas公司)；氯化钆(GdCl3，美国Sigma公司)；兔抗小鼠小凹蛋白1单克隆抗体(美国Abcam公司)；山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物科技有限公司)；小凹蛋白1反转录试剂盒、钙敏感受体抑制剂NPS2390(德国R&D公司)；山羊抗兔二抗；TRIzol(美国Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠β-actin(内参)单克隆抗体、B型钠尿肽(BNP)酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。主要仪器： PCR扩增系统(美国Roche公司)；Image J影像分析及处理系统(美国国立卫生研究院)；低温离心分离机(美国Thermo Scientific公司)等。
1.3.2 实验动物从新疆维吾尔族自治区实验动物研究中心购买健康的SPF级C57BL/6小鼠80只，体质量18-22 g，许可证号：SCXK新2003-0001，雌雄以1∶1的比例合笼。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组及模型建立将80只刚出生的C57BL/6小鼠随机平均分成4个组：常氧组、低氧组、低氧+激动剂组(以下简称激动剂组)和低氧+抑制剂组(以下简称抑制剂组)。常氧组暴露于空气中；其余3组置于体积分数12%氧浓度的恒温恒湿低氧箱(APY-250)中，采用常压低氧的方法构建模型[8-9]。同时，药物干预组分别每天注射钙敏感受体激动剂GdCl3 16 mg/kg 或其抑制剂NPS2390 1 mg/kg，常氧组和低氧组以每日等量生理盐水替代，造模期间母鼠可在箱内自由进食水，共14 d。
1.4.2 各组小鼠体质量监测称量新生小鼠的体质量(初始体质量)，造模完成后(开始造模第15天)再次称量(终末体质量)，计算体质量增长率。
体质量增长率(RBWI)=(终末体质量-初始体质量)/ 初始体质量×100%。
1.4.3 标本采集称量终末体质量后给予8%七氟烷吸入诱导麻醉，并在操作过程中持续吸入3%浓度的七氟烷维持，沿左侧切开胸骨以暴露胸腔，取出心脏和肺组织，并保存在-80 ℃以备用。用体积分数4%的甲醛固定用于苏木精-伊红染色和免疫组化的心肺组织，浸泡24 h然后包埋在石蜡中。
1.4.4 心脏和肺组织形态学检测将包埋好的石蜡切片脱蜡处理后行苏木精-伊红染色，每组抽取10张心脏组织切片，并将其置于40倍显微镜下，随机选取8个视野测量左右心室室壁厚度，计算得出右心室与左心室壁厚度比(RV/LV)。同样的，将肺组织切片置于100倍的显微镜下，测量呼吸性细支气管中央与结缔组织隔膜之间的肺泡隔板个数[10]，计算径向肺泡计数(RAC)；以视野中心做十字交叉线，计算线上的肺泡间隔数，计算平均肺泡内衬间隔(MLI)[11]。将显微镜转化为400倍，测量外径20-99 μm、100-150 μm的肺动脉血管的外径和血管壁的厚度，计算血管壁的厚度在血管外径的比例。
血管壁厚度(WT，%)=(2×血管壁厚度)/ 血管外径×100%。
1.4.5 免疫组化检测肺组织血管中小凹蛋白1的表达将肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，然后用枸橼酸抗原加热修复，冷却至室温后用缓冲液冲洗，添加兔抗小鼠单克隆抗体小凹蛋白1(1∶500)，4℃孵育过夜。次日加入山羊抗兔IgG二抗(1∶500)，DAB显色，将载玻片干燥并置于显微镜下观察。使用Image J软件进行分析。
1.4.6 ELISA检测心脏组织中B型钠尿肽的水平将心脏组织研磨离心后取上清液，按试剂盒要求加样，注意加样时不要碰孔壁，封板后37℃温育30 min，弃去液体甩干，加洗涤液洗涤(30s×5次)后，加入酶标试剂，再次温育洗涤，加入显色剂A、B显色15 min后加入终止液终止反应，450 nm波长下测量各孔的吸光度(A值)。
1.4.7 Western Blot法检测肺组织中小凹蛋白1蛋白表达取肺组织上清液用于蛋白测定，制胶、加样(10%分离胶)，
70 V 2 h电泳直至溴酚蓝迁移到凝胶最下端，电泳完成。在80 V 1.5 h下完成电转，用脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗小鼠单克隆抗体小凹蛋白1(1∶1 000)，小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶1 000)4 ℃孵育16 h；膜洗涤完成后加入二抗，再次孵育2 h、洗膜，最后显色定影。用Image J软件进行分析。
1.4.8 qRT-PCR法检测肺组织中小凹蛋白1 mRNA的表达将研磨的肺组织中加入0.7 mL Trizol液静置，加入0.2 mL氯仿充分混匀，将其置于12 000 r/min的低温离心机中离心15 min，取上清液添加0.4 mL异丙醇再次离心30 min，弃去上清，加入0.3-0.5 mL的体积分数75%乙醇，吹打离心后将上清液丢弃，干燥后加入DEPC水反复吹打溶解总RNA，调整浓度，将总RNA从RNA反转到cDNA。将cDNA置于PCR八联管中以建立反应体系。小凹蛋白1 上游引物：5’-CGC ACA CCA AGG AGA TTG ACC TG-3’，下游引物：5’-TGC CGA AGA TCG TAG ACA ACA AG-3’，产物长度195 bp；MACT(内参)上游引物：5’-TTC CTT CTT GGG TAT GGA AT-3’，下游引物：5’-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3’，产物长度203 bp。条件是在95 ℃下预变性2 min；在95 ℃下变性30 s，在55℃下退火20 s，总循环40次。
1.5 主要观察指标 ①新生小鼠的基本情况；②各组小鼠肺动脉血管壁、右心室壁厚度的变化；③各组小鼠肺组织中肺泡形态、大小及肺泡化程度的变化；④各组小鼠右心室壁厚度及B型钠尿肽浓度比较；⑤各组小鼠肺血管小凹蛋白1的表达；⑥各组小鼠肺组织中小凹蛋白1蛋白及mRNA的表达。
1.6 统计学分析结果以x±s表示，组间差异采用方差分析，LSD法用于方差齐时的组间比较，Tamhane’s T2法用于方差不齐的情况。检验水准P=0.05。

讨论

此次研究以新生C57BL/6小鼠为实验对象，探讨持续性肺动脉高压模型血管重塑中钙敏感受体的表达变化对小凹蛋白1的作用。低氧引起的肺血管重塑是持续性肺动脉高压形成的关键因素[12]。慢性缺氧条件下，血管细胞(成纤维细胞和平滑肌细胞)增殖、抗凋亡和细胞外基质增生[13-14]。此次实验采用低氧诱导的方法构建疾病动物模型，将肺小动脉血管壁厚度百分比、右心室与左心室壁厚度比、B型钠尿肽水平作为量化血管重塑及右心室肥厚的指标[15-16]，结果显示低氧组上述指标明显增高，较常氧组相比均具有统计学意义，提示模型建造成功。
钙敏感受体是主要存在于哺乳动物体内的G蛋白偶联受体[17]。研究表明，钙敏感受体参与缺氧性肺动脉高压的肺血管损伤及肺血管重塑，而钙敏感受体抑制剂可一定程度上起到逆转作用[18-19]。作者所在的课题组也发现：与低氧组相比，钙敏感受体抑制剂组小鼠的精神状况好转，肺血管壁、右心室壁厚度减小，肺泡较完整、密度增加、内衬间隔减小，这些结果提示钙敏感受体的抑制可能减轻持续肺动脉高压的症状与病理改变，为治疗提供新的策略，其具体机制及信号通路一直是课题组研究的重点。
小凹蛋白1是细胞膜小凹(Caveolae)中非常重要的结构成分，参与了增殖、凋亡、分化及跨细胞吞噬等活动，与冠心病、肌营养不良、早老性痴呆及肿瘤等多种疾病密切相关[20-21]。研究发现，小凹蛋白1是内皮型一氧化氮合酶的负性调节因子，其支架结构域上的氨基酸残基与内皮型一氧化氮合酶结合使后者失活，一氧化氮合成受到抑制，导致肺动脉高压的形成[22]。此次研究通过免疫组化染色发现小凹蛋白1主要在肺动脉表达，同时结合Western blot和qRT-PCR结果：低氧组小凹蛋白1的表达高于常氧组，证实了小凹蛋白1的表达可能是肺动脉高压形成的促进因素之一。结合课题组前期研究结果[6]，此次实验进一步发现：与低氧组相比，激动剂组在促进钙敏感受体表达的同时小凹蛋白1表达也进一步增加，肺血管壁增厚；而抑制剂组在抑制钙敏感受体表达的同时下调了小凹蛋白1的表达，肺血管壁厚度减小。其原因可能是在低氧条件下，小鼠肺血管钙敏感受体表达上调，细胞中增高的Ca2+可激活酪氨酸激酶(Scr)，酪氨酸激酶是小凹蛋白1磷酸化和下游信号启动的关键上游效应因子，可使小凹蛋白1上的Tyr14位点磷酸化，从而导致内皮型一氧化氮合酶与小凹蛋白1的结合增加，内皮型一氧化氮合酶合成一氧化氮减少，一方面引起肺血管收缩效应增强、内皮细胞损伤；另一方面血管平滑肌细胞增殖、血管结构重塑，肺动脉高压形成[23-25]。
综上所述，小凹蛋白1在新生小鼠肺小动脉血管中有表达，低氧可上调小凹蛋白1的表达及活性，激动钙敏感受体则上调作用更加显著，引起血管结构重塑；相反，抑制钙敏感受体后小凹蛋白1的表达也下降，减轻了血管的重塑。小凹蛋白1的化学修饰与肺动脉高压发病机制相关，进一步的研究需要明确钙敏感受体对小凹蛋白1的具体调控机制，并确定小凹蛋白1是否可能作为肺动脉高压的诊断标志物和治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

钙敏感受体可影响持续性肺动脉高压新生模型小鼠的肺血管重塑

Calcium-sensitive receptors influence pulmonary vascular remodeling in neonatal mice with persistent pulmonary hypertension

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