局部应用霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖及迁移预防硬膜外纤维化

doi:10.12307/2022.256

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (16): 2551-2556.doi: 10.12307/2022.256

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局部应用霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖及迁移预防硬膜外纤维化

朱东明1，张振1，张杰2，颜连启3

1大连医科大学，辽宁省大连市 116044；2中南大学湘雅二医院，湖南省长沙市 410012；3苏北人民医院，江苏省扬州市 225001

收稿日期:2020-09-14 修回日期:2020-09-16 接受日期:2020-10-24 出版日期:2022-06-08 发布日期:2021-12-23
通讯作者: 颜连启，主任医师，硕士生导师，副教授，苏北人民医院关节外科中心，江苏省扬州市 225001
作者简介:朱东明，男，1995年生，安徽省淮南市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事骨科疾病的防治和研究。
基金资助:
江苏省医学创新团队课题(CXTDB2017004)，项目参与者：颜连启

Topical application of mycophenolate mofetil prevents epidural fibrosis by inhibiting the proliferation and migration of fibroblasts

Zhu Dongming1, Zhang Zhen1, Zhang Jie2, Yan Lianqi3

1Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; 2The Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410012, Hunan Province, China; 3Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2020-09-14 Revised:2020-09-16 Accepted:2020-10-24 Online:2022-06-08 Published:2021-12-23
Contact: Yan Lianqi, Chief physician, Master’s supervisor, Associate professor, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
About author:Zhu Dongming, Master candidate, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
Supported by:
the Jiangsu Provincial Medical Innovation Team, No. CXTDB2017004 (to YLQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞增殖：是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体，多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。
细胞迁移：也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程，是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

背景：研究发现，椎板切除术后的硬膜外纤维化主要由成纤维细胞增殖及迁移造成，而霉酚酸酯能够抑制成纤维细胞的增殖和迁移。
目的：探讨局部应用霉酚酸酯预防椎板切除术后硬膜外纤维化的作用及其可能机制。
方法：①细胞实验：分别以0，0.01，0.1，1，10，100 μmol/L的霉酚酸酯溶液处理成纤维细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞活性，选择较适宜的处理浓度进行后续的细胞实验。分别以0，0.1，1，10 μmol/L的霉酚酸酯溶液处理成纤维细胞24 h，EdU和细胞周期实验检测细胞增殖情况，划痕实验与transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力，Western blot检测细胞增殖相关蛋白(细胞核增殖抗原、Cyclin D1)与迁移相关蛋白(α-微管蛋白、黏着斑蛋白)的表达量。②动物实验：取48只成年SD大鼠，构建大鼠椎板切除模型，随机分4组：对照组将浸透生理盐水的棉片置于术后骨缺损区域，低、中、高浓度组分别将浸透2.5，5，10 g/L霉酚酸酯溶液的棉片置于术后骨缺损区域，术后4周取术区椎体进行组织学分析。
结果与结论：①细胞实验结果：CCK-8检测显示，霉酚酸酯呈浓度依赖性抑制成纤维细胞的活性；EdU实验显示，霉酚酸酯呈浓度依赖性抑制成纤维细胞的增殖；流式细胞仪检测显示，0.1 μmol/L的霉酚酸酯溶液使细胞周期停滞在G0/G1期；划痕实验与transwell实验显示，霉酚酸酯呈浓度依赖性抑制成纤维细胞的迁移能力；Western blot检测显示，霉酚酸酯呈浓度依赖性抑制成纤维细胞增殖相关蛋白与迁移相关蛋白的表达；②动物实验结果：组织学观察显示，随着霉酚酸酯浓度增加，术区纤维化组织中成纤维细胞数量与胶原生成逐渐减少；③结果表明，椎板切除术后局部应用霉酚酸酯可有效预防硬膜外纤维化的发生，可能是通过抑制成纤维细胞的增殖和迁移发挥作用。

https://orcid.org/0000-0001-7346-2167 (朱东明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 霉酚酸酯, 成纤维细胞, 增殖, 迁移, 硬膜外纤维化, 动物, 小鼠, 实验

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that epidural fibrosis after laminectomy is mainly caused by the proliferation and migration of fibroblasts, and mycophenolate mofetil can inhibit the proliferation and migration of fibroblasts.
OBJECTIVE: To explore the effect of topical application of mycophenolate mofetil in preventing epidural fibrosis after laminectomy and its possible mechanism.
METHODS: (1) Cell test: Fibroblasts were separately treated with 0, 0.01, 0.1, 1, 10, and 100 μmol/L mycophenolate mofetil solution for 24 hours. Cell viability was detected by CCK-8 assay, and the appropriate treatment concentration was selected for subsequent cell experiments. Fibroblasts were separately treated with 0, 0.1, 1, 10 μmol/L mycophenolate mofetil solution for 24 hours. EdU assay and cell cycle assay were used to detect cell proliferation. Wound scratch assay and transwell assay were used to detect cell migration. Western blot assay was used to detect the expression of cell proliferation-related proteins (nuclear proliferation antigen, Cyclin D1) and migration-related proteins (α-tubulin, vinculin). (2) Animal test: Forty-eight adult SD rats were selected to construct rat laminectomy model and randomly divided into four groups. In the control group, cotton pads soaked with normal saline were placed on the postoperative bone defect area. In the low, medium, and high concentration groups, cotton pads soaked with 2.5, 5, and 10 g/L mycophenolate mofetil solution were placed on the postoperative bone defect area. Four weeks after the operation, the vertebral body of the operative area was taken for histological analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell test results: CCK-8 assay showed that mycophenolate mofetil inhibited the viability of fibroblasts in a concentration-dependent manner. EdU assay showed that mycophenolate mofetil inhibited the proliferation of fibroblasts in a concentration-dependent manner. Flow cytometry showed that 0.1 μmol/L mycophenolate mofetil solution blocked the cell cycle in G0/G1 phase. Wound scratch assay and transwell assay showed that mycophenolate mofetil inhibited the migration of fibroblasts in a concentration-dependent manner. Western blot assay showed that mycophenolate mofetil inhibited the expression of fibroblast proliferation-related protein and migration-related protein in a concentration-dependent manner. (2) Animal test results: Histological observation showed that with the increase of mycophenolate mofetil concentration, the number of fibroblasts and collagen production in the fibrotic tissue of the surgical area gradually decreased. (3) The results showed that the topical application of mycophenolate mofetil after laminectomy can effectively prevent the occurrence of epidural fibrosis, possibly by inhibiting the proliferation and migration of fibroblasts.

Key words: material, mycophenolate mofetil, fibroblast, proliferation, migration, epidural fibrosis, animal, mouse, experiment

中图分类号:

朱东明, 张振, 张杰, 颜连启. 局部应用霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖及迁移预防硬膜外纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2551-2556.

Zhu Dongming, Zhang Zhen, Zhang Jie, Yan Lianqi. Topical application of mycophenolate mofetil prevents epidural fibrosis by inhibiting the proliferation and migration of fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(16): 2551-2556.

图/表（结果） 9

2.1 体外细胞实验结果
2.1.1 霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖
CCK-8实验：霉酚酸酯通过浓度依赖性抑制成纤维细胞的活性，见图1。

EdU实验：随着药物浓度增加，EdU阳性细胞百分比逐渐减少，见图2，表明霉酚酸酯能够抑制成纤维细胞的增殖。

细胞周期实验：与0 μmol/L霉酚酸酯组相比，0.1 μmol/L霉酚酸酯组的成纤维细胞增殖周期被阻滞在G0/G1期，见图3。

2.1.2 霉酚酸酯减弱了成纤维细胞的迁移能力细胞划痕实验结果显示，随着药物浓度增加，划痕面积减少百分比逐渐降低，见图4，表明霉酚酸酯能够抑制成纤维细胞的迁移。Transwell实验结果显示，随着药物浓度增加，穿过小室的细胞数量越来越少，见图5，表明霉酚酸酯对细胞迁移能力有抑制作用。

2.1.3 霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖相关蛋白的表达随着霉酚酸酯浓度增加，增殖相关蛋白细胞核增殖抗原、Cyclin D1的表达量逐渐降低，见图6，说明药物对成纤维细胞的增殖有抑制作用。

2.1.4 霉酚酸酯抑制成纤维细胞迁移相关蛋白的表达随着霉酚酸酯浓度增加，迁移相关蛋白α-微管蛋白、黏着斑蛋白的表达量逐渐降低，见图7，说明药物对成纤维细胞的迁移能力有抑制作用。

2.2 体内动物实验结果硬膜外粘连程度组织学分析的苏木精-伊红染色显示，随霉酚酸酯浓度增加，成纤维细胞数量减少，见图8。

Masson染色显示，10 g/L组硬膜外纤维化组织中胶原纤维含量最少；2.5 g/L组胶原纤维含量较10 g/L组多；5 g/L组的胶原纤维含量介于2.5 g/L组与10 g/L组之间；对照组硬膜外纤维化组织中胶原纤维含量最多，见图9。

参考文献

[1] KONG L, SHANG XF, ZHANG WZ, et al. Percutaneous endoscopic lumbar discectomy and microsurgical laminotomy : A prospective, randomized controlled trial of patients with lumbar disc herniation and lateral recess stenosis. Orthopade. 2019;48(2):157-164.
[2] SUN F, LIANG Q, YAN M, et al. Unilateral Laminectomy by Endoscopy in Central Lumbar Canal Spinal Stenosis: Technical Note and Early Outcomes. Spine. 2020;45(14):E871-E877.
[3] AVELLANAL M, DIAZ-REGANON G, ORTS A, et al. Transforaminal Epiduroscopy in Patients with Failed Back Surgery Syndrome. Pain Physician. 2019;22(1):89-95.
[4] ROGERSON A, AIDLEN J, JENIS LG. Persistent radiculopathy after surgical treatment for lumbar disc herniation: causes and treatment options. Int Orthop. 2019;43(4):969-973.
[5] SOBTI S, GROVER A, JOHN BPS, et al. Prospective Randomized Comparative Study to Evaluate Epidural Fibrosis and Surgical Outcome in Patients Undergoing Lumbar Laminectomy with Epidural Autologous Free Fat Graft or Gelfoam: A Preliminary Study. Int J Appl Basic Med Res. 2018;8(2):71-75.
[6] DAI J, SUN Y, CHEN D, et al. Negative regulation of PI3K/AKT/mTOR axis regulates fibroblast proliferation, apoptosis and autophagy play a vital role in triptolide-induced epidural fibrosis reduction. Eur J Pharmacol. 2019;864:172724.
[7] KIKUCHI K, SETOYAMA K, TERASHI T, et al. Application of a Novel Anti-Adhesive Membrane, E8002, in a Rat Laminectomy Model. Int J Mol Sci. 2018;19(5):1513.
[8] ZENG L, SUN Y, LI X, et al. 10‑Hydroxycamptothecin induces apoptosis in human fibroblasts by regulating miRNA‑23b‑3p expression. Mol Med Rep. 2019;19(4):2680-2686.
[9] ANDERSON KD, BRYDEN AM, MOYNAHAN M. Risk-benefit value of upper extremity function by an implanted electrical stimulation device targeting chronic cervical spinal cord injury. Spinal Cord Ser Cases. 2019;5(1):68.
[10] TACCOLA G, BARBER S, HORNER PJ, et al. Complications of epidural spinal stimulation: lessons from the past and alternatives for the future. Spinal cord. 2020;58(10):1049-1059.
[11] 李杨.吡非尼酮抑制大鼠皮肤切口瘢痕形成的实验研究[D].合肥:安徽医科大学,2019.
[12] 佟格霏.A型肉毒毒素抑制增生性瘢痕成纤维细胞生物学功能的实验研究[D].大连:大连医科大学,2019.
[13] 杨春兰.霉酚酸酯在肾移植中的治疗药物监测研究及基因多态性的影响[D].合肥:安徽医科大学,2017.
[14] MORATH C, SCHWENGER V, BEIMLER J, et al. Antifibrotic actions of mycophenolic acid. Clin Transplant. 2006;20:25-29.
[15] ZHANG C, CHAN CCY, CHEUNG KF, et al. Effect of mycophenolate and rapamycin on renal fibrosis in lupus nephritis. Clin Sci. 2019; 133(15):1721-1744.
[16] 朱忠华,张春,邓安国,等.霉酚酸酯抑制大鼠肾间质纤维化的研究[J].中华肾脏病杂志,2002,18(4):61-63.
[17] 周晓霜.根据细胞周期联合使用他克莫司和霉酚酸酯治疗系膜增生性肾病的实验研究[D].太原:山西医科大学,2015.
[18] XIE F, LI X, SUN K, et al. An experimental study on drugs for improving blood circulation and removing blood stasis in treating mild chronic hepatic damage. J Tradit Chin Med. 2001;21(3):225-231.
[19] KNAPP S, BERTELMANN E, HARTMANN C, et al. Intraocular availability of topically applied mycophenolate mofetil in rabbits. Journal of ocular pharmacology and therapeutics. 2003;19(2):181-192.
[20] XIONG G, CHEN H, WAN Q, et al. Emodin promotes fibroblast apoptosis and prevents epidural fibrosis through PERK pathway in rats. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):319.
[21] ISMAILOGLU O, KIZILAY Z, CETIN NK, et al. Effect of Curcumin on the Formation of Epidural Fibrosis in an Experimental Laminectomy Model in Rats. Turk Neurosurg. 2019;29(3):440-444.
[22] VEDIAPPAN RS, MASCARENHAS A, NGUYEN-HOANG A, et al. Prevention of peridural adhesions in spinal surgery: Assessing safety and efficacy of Chitogel with Deferiprone in a sheep model. J Clin Neurosci. 2020; 72:378-385.
[23] ERDOGAN B, IS M, AKER FV, et al. Preventative effect of diclofenac sodium and/or diltiazem in rats with epidural fibrosis. Bratisl Lek Listy. 2019;120(11):813-818.
[24] KESER N, IS M, CEMAN D, et al. Locally Used Antibiotics for Spinal Infection Prophylaxis and Their Effects on Epidural Fibrosis: an Experimental Laminectomy Study in Rats Using Rifamycin and Gentamycin. Inflammation. 2019;42(2):714-720.
[25] WU Y, LIU D, ZHOU Q, et al. Effect of surface microstructure on the anti-fibrosis/adhesion of hydroxyapatite ceramics in spinal repair of rabbits. J Biomed Mater Res. Part B, Applied biomaterials. 2019;107(8):2629-2637.
[26] ALBIÑANA-CUNNINGHAM JN, RIPALDA-CEMBORÁIN P, LABIANO T, et al. Mechanical barriers and transforming growth factor beta inhibitor on epidural fibrosis in a rabbit laminectomy model. J Orthop Surg Res. 2018;13(1):72.
[27] YANG L, GAO Q, LV F, et al. miR‑519d‑3p promotes TGFβ/Smad mediated postoperative epidural scar formation via suppression of BAMBI. Mol Med Rep. 2019;20(4):3901-3909.
[28] PIYASIRIDEJ S, TOWNAMCHAI N, UDOMKARNJANANUN S, et al. Plasmapheresis Reduces Mycophenolic Acid Concentration: A Study of Full AUC(0-12) in Kidney Transplant Recipients. J Clin Med. 2019;8(12): 2084.
[29] DUARTE AC, SANTOS MJ, CORDEIRO A. Anti-fibrotic nintedanib-a new opportunity for systemic sclerosis patients? Clin Rheumatol. 2018;37(4):1123-1127.
[30] SCHEEL PJ JR, FEELEY N, SOZIO SM. Combined prednisone and mycophenolate mofetil treatment for retroperitoneal fibrosis: a case series. Ann Intern Med. 2011;154(1):31-36.
[31] YUNG S, ZHANG Q, CHAU MK, et al. Distinct effects of mycophenolate mofetil and cyclophosphamide on renal fibrosis in NZBWF1/J mice. Autoimmunity. 2015;48(7):471-487.
[32] WANG QJ, ZHANG AL, KANG ZQ, et al. Exogenous IL-19 mediates downregulation of TGF-β through Erk and p38 pathway to inhibit epidural fibrosis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(17):7184-7190.
[33] BAGCI G, YÜCEL I, DURANOGLU Y. The effect of cyclosporin A on cultured rabbit subconjunctival fibroblast proliferation. Ophthalmologica. 1999;213(2):114-119.
[34] YILDIZ KH, GEZEN F, IS M, et al. Mitomycin C, 5-fluorouracil, and cyclosporin A prevent epidural fibrosis in an experimental laminectomy model. Eur Spine J. 2007;16(9):1525-1530.
[35] 戴纪杭.羟基喜树碱通过调控NOXA表达预防椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的研究[D].扬州:扬州大学,2017.
[36] LI X, WANG S, DAI J, et al. Homoharringtonine prevents surgery-induced epidural fibrosis through endoplasmic reticulum stress signaling pathway. Eur J Pharmacol. 2017;815:437-445.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验和动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3-12月在苏北人民医院实验研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康8周龄雄性SD大鼠48只，体质量250-300 g，由江苏省苏北人民医院动物实验中心提供，动物生产许可证号：SYXK(苏)2017-0044。动物实验获得扬州大学伦理委员会批准。
1.3.2 试剂、药品及仪器设备霉酚酸酯(上海阿拉丁生物化学技术公司，中国)；胎牛血清 (Clark，美国)；DMEM培养基(Gibco，美国)；细胞计数Kit-8、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、青霉素-链霉素溶液、结晶紫染色液(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(ROCHE，瑞士)；GAPDH、细胞核增殖抗原、Cyclin D1、α-微管蛋白、黏着斑蛋白及山羊抗兔IgG抗体(Cell Signal Technology，
美国)；碘化丙啶、EdU细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司，中国)；电泳仪及化学发光成像仪(Bio-Rad，美国)；光学显微镜(ZEISS，德国)；ImageJ图像分析系统(Meyer Instruments，美国)；流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；ModFit LT(Verity Software House，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养人体硬膜外瘢痕来源的成纤维细胞(中国科学院上海细胞典藏库)，用含体积分数15%胎牛血清，1% 链霉素-青霉素溶液的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱培养，细胞长至80%-90%时传代。
1.4.2 体外细胞实验
细胞增殖活性检测：将成纤维细胞以约1×104/孔的密度接种于96孔板，培养箱培养24 h，加入不同浓度的霉酚酸酯(0，0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)作用24 h，加入CCK-8 10 μL /孔，采用450 nm多孔扫描器测量吸光度值。选择合适的浓度用于以下实验。
EdU实验检测细胞增殖：将成纤维细胞以1×105/孔的密度接种在24孔板中的细胞爬片上，将板在37 ℃下培养24 h，根据先前的体外实验研究和CCK-8实验结果设定霉酚酸酯处理浓度[17]，采用不同浓度的霉酚酸酯(0，0.1，1，10 μmol/L)处理细胞24 h。之后，向平板的每个孔中添加10 μmol/L EdU，持续作用24 h。将细胞在40 g/L多聚甲醛中固定15 min，并用0.5% Triton X-100促渗20 min。用Hoechst 33342染液将细胞核染色。完成所有步骤后，通过荧光显微镜观察带有荧光信号的阳性细胞，进行数据分析。
细胞周期检测：为了探索霉酚酸酯诱导成纤维细胞生长和增殖的机制，采用细胞周期检测试剂盒来分析霉酚酸酯干预后成纤维细胞的细胞周期分布。在10 cm的培养皿中培养成纤维细胞，实验组在细胞对数生长期时用0.1 μmol/L 的霉酚酸酯处理细胞24 h。处理结束后收集细胞，用离心机以 1 000 r/min的转速离心3-5 min。然后用冷磷酸盐缓冲液洗涤一次，将细胞固定在体积分数70%冰冷的乙醇中，然后将细胞重悬在0.5 mL碘化丙啶(PI，江苏凯基生物技术有限公司，中国)溶液中，在暗室中于37 ℃水浴中染色30 min。通过流式细胞仪检测细胞。采用ModFit软件分析细胞周期(如G0/G1，S和G2/M期)分布情况。
划痕实验检测细胞迁移能力：将成纤维细胞以2×105/孔的密度接种在6孔板中，直至细胞融合度达到80%-90%。用200 μL枪头在孔内划线，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次。将细胞与不同浓度霉酚酸酯(0，0.1，1，10 μmol/L)在补充有体积分数2%血清的培养基中孵育24 h。在光学显微镜下拍摄0 h和24 h时划痕区域的照片。为了进行统计分析，在5个随机选择的观察点测量其划痕面积。
Transwell实验检测细胞迁移能力：将细胞收集在无血清培养基中，其终浓度为1×108 L-1。然后在37 ℃下用不同浓度霉酚酸酯(0，0.1，1，10 μmol/L)处理24 h。取无菌12孔板，在孔板内添加500 μL含体积分数15%胎牛血清的培养基，将Transwell小室置于12孔板中，使小室的底部与孔板内的培养基接触，将具有无血清培养基的200 μL细胞悬液加入小室中，孵育18 h后，将小室底部外表面迁移的细胞用结晶紫染色液染色。在光学显微镜下观察迁移的成纤维细胞数量，进行数据分析。
Western Blot检测增殖、迁移相关蛋白：以1×108 L-1的细胞浓度将成纤维细胞接种于10 cm培养皿中，细胞数量达到60%时，采用不同浓度霉酚酸酯(0，0.1，1，10 μmol/L)处理24 h，提取蛋白，采用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。电泳，转膜，5%BSA封闭，GAPDH、细胞核增殖抗原、Cyclin D1、α-微管蛋白、黏着斑蛋白一抗4 ℃隔夜孵育，漂洗后，将条带放入对应的二抗中常温孵育2 h，最后用化学发光成像仪检测。
1.4.3 体内动物实验
模型建立：取48只SD大鼠，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，L1-L2处备皮，碘伏消毒3遍，铺无菌巾；沿L1-L2棘突水平纵行切开，逐层分离至显露腰椎椎板；使用咬骨钳咬除棘突及椎板，面积约5.0 mm×5.0 mm，暴露硬脊膜，生理盐水清洗，术式参考先前的研究[18]。随机分为4组，每组12只：实验组将浸透不同质量浓度霉酚酸酯(2.5，5，10 g/L[19])的棉片置于术后骨缺损区域，对照组将浸透生理盐水的棉片置于术后骨缺损区域，放置5 min后将棉片取出[20]。生理盐水术区冲洗3次，清除残留药物，用慕丝线逐层缝合。
组织学分析：术后4周，麻醉大鼠后切取术区完整椎体。多聚甲醛固定24 h后双蒸水持续冲洗2 h；EDTA脱钙至利器可以轻松刺破椎体骨质，制作石蜡标本，切片，行苏木精-伊红染色和Masson染色。取苏木精-伊红染色标本切片，于400倍光学显微镜下观察术区切片的边缘与中心3个区域，分别计数纤维化组织中的成纤维细胞数量。取Masson染色标本切片，于400倍光学显微镜下观察纤维化组织中的胶原含量。
1.5 主要观察指标霉酚酸酯处理后成纤维细胞的活力、增殖情况、细胞周期及增殖相关蛋白表达情况；霉酚酸酯处理后成纤维细胞的迁移能力及迁移相关蛋白表达情况；霉酚酸酯处理后术区纤维化组织的苏木精-伊红染色及Masson染色结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料结果以x±s表示，使用单因素方差分析和t检验比较各组数据，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

椎板切除术后硬膜外纤维化是骨科医生面临的临床难题，纤维化组织带来的并发症会严重影响患者术后的生活质量[21-22]。研究表明细胞过度增殖广泛参与正常代谢、神经退变术后粘连、硬膜外粘连等病理生理过程[23-25]。与此同时，近年来越来越多的学者研究表明，抑制细胞的迁移能力能够有效抑制组织的纤维化，为纤维化疾病的治疗提供了新的研究思路[26-27]。
霉酚酸酯作为一种免疫抑制剂，主要应用于预防同种肾移植的排斥反应[28]。近年来许多相关研究表明，霉酚酸酯能抑制纤维化，在许多抗纤维化研究中都取得了良好效果[29-31]，但对于在硬膜外纤维化的预防中能否发挥作用目前尚无相关研究。
成纤维细胞的过度增殖和迁移是导致组织纤维化的主要因素，过度增殖的细胞在椎板切除术术区形成瘢痕粘连[32]。此次实验发现，霉酚酸酯通过抑制成纤维细胞的增殖和迁移抑制硬膜外粘连的形成，与成纤维细胞过度增殖和迁移导致组织纤维化的理论相一致。这是首次将霉酚酸酯局部应用于大鼠椎板切除术后预防硬膜外纤维化的研究，并阐述其可能的机制。
在体外通过CCK-8检测成纤维细胞的活性，结果表明霉酚酸酯可以通过浓度依赖性抑制成纤维细胞的活性。通过EdU检测成纤维细胞的增殖情况，结果显示随着霉酚酸酯浓度升高，阳性细胞百分比逐渐降低，表明成纤维细胞的增殖能力受到霉酚酸酯抑制；而细胞周期实验的结果表明霉酚酸酯将成纤维细胞的增殖周期抑制在G0/G1期。划痕实验显示，随着霉酚酸酯浓度升高，划痕面积减少百分比逐渐下降；Transwell实验表明，随着霉酚酸酯浓度升高，穿过小室的细胞数量逐渐下降，这些结果证明霉酚酸酯可以有效抑制成纤维细胞的迁移能力。Western Blot检测实验表明，随着霉酚酸酯浓度升高，增殖相关蛋白细胞核增殖抗原、Cyclin D1和迁移相关蛋白α-微管蛋白、黏着斑蛋白的表达量逐渐降低。通过检测成纤维细胞增殖活性、迁移活性及增殖相关蛋白和迁移相关蛋白的表达量，验证了霉酚酸酯能够抑制成纤维细胞的增殖和迁移，减少纤维化组织的形成。体外实验表明，霉酚酸酯可能是通过抑制成纤维细胞的增殖和迁移预防椎板切除术后硬膜外纤维化。
体内实验方面，通过分析纤维化组织中成纤维细胞数量、胶原含量等来评估术区粘连程度。前期研究表明局部应用霉酚酸酯可安全有效防止青光眼术后粘连、角膜纤维化，因此作者猜测局部应用霉酚酸酯可有效抑制椎板切除术后粘连，减少术区成纤维细胞等促纤维化的介质产生。此次实验发现，局部应用10 g/L的霉酚酸酯能有效抑制椎板切除术后成纤维细胞的增殖及胶原纤维的生成，并且霉酚酸酯在抑制硬膜外粘连作用上呈现一定的剂量-效应关系。
近年来，国内外学者对于硬膜外纤维化的预防展开了深入探索。在药物选择方面，有诸多不良反应较小的免疫抑制剂受到研究人员的关注，BAGCI等[33]通过细胞实验发现，环孢霉素A可以有效抑制成纤维细胞的增殖；YILDIZ等[34]通过动物实验发现，环孢霉素A可以预防椎板切除术后的硬膜外纤维化。国内研究人员发现，抗肿瘤药物羟基喜树碱可以有效减少椎板切除术后硬膜外瘢痕组织的生成[35]。抗纤维化药物的作用机制可能是通过抑制相关信号通路来影响成纤维细胞的相关功能。LI等[36]发现高三尖杉酯碱可通过内质网应激信号通路预防手术引起的硬膜外纤维化，内质网应激信号通路可以抑制成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡，从而减少了硬膜外成纤维组织的形成。
然而实验动物与人体生理、病理方面存在较多差异，霉酚酸酯作为预防硬膜外粘连的临床药物还需进一步探索。实验存在一些不足之处：首先，对于霉酚酸酯使用后实验动物的相关不良反应，在该实验中没有进行深入的探索；也没有对霉酚酸酯可能的分子信号作用机制进行详细研究，后续将针对这些方面进行完善。
通过体外和体内实验得出了以下结果：①霉酚酸酯能够抑制成纤维细胞增殖和迁移，具有浓度依赖性；②局部应用霉酚酸酯能够减少椎板切除术后硬膜外纤维化组织的产生，也具有浓度依赖性。实验结果可能为预防椎板切除术后硬膜外纤维化提供一种新的药物选择。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

局部应用霉酚酸酯抑制成纤维细胞增殖及迁移预防硬膜外纤维化

Topical application of mycophenolate mofetil prevents epidural fibrosis by inhibiting the proliferation and migration of fibroblasts

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	孔亚敏, 严隽陶, 马丙祥, 李华伟. 推拿振法干预坐骨神经损伤模型大鼠MyoD表达及肌卫星细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1160-1166.
[3]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[4]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[5]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[6]	李志一, 贺鹏程, 边天月, 肖玉霞, 高璐, 刘华胜. 铁死亡机制研究的文献计量学与可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1202-1209.
[7]	李琴, 毛双法, 李敏, 程基焱. 石斛多糖保护中波紫外线损伤成纤维细胞的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1228-1233.
[8]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[9]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[10]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[11]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[12]	温小雨, 孙玉浩, 夏猛. 五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1068-1073.
[13]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[14]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[15]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.