马鹿角粉浸提液对骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响

doi:10.12307/2022.563

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3840-3845.doi: 10.12307/2022.563

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

马鹿角粉浸提液对骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响

单帅1，董艺1，刘佳林1，韩祥祯1，何惠宇1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复与种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2021-09-23 接受日期:2021-11-03 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 何惠宇，主任医师，教授，博士生导师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复与种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:单帅，男，1994年生，河南省南阳市人，在读硕士，主要从事口腔修复学及组织工程研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2018E02060)，项目负责人：何惠宇；新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJ2021G196)，项目负责人：刘佳林

Effects of red deer horn powder extract on the biological behavior of bone marrow derived macrophages

Shan Shuai1, Dong Yi1, Liu Jialin1, Han Xiangzhen1, He Huiyu1, 2

1Department of Prosthodontics and Implant, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Xinjiang Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2021-09-23 Accepted:2021-11-03 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: He Huiyu, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics and Implant, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Shan Shuai, Master candidate, Department of Prosthodontics and Implant, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Science and Technology Support Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2018E02060 (to HHY); Postgraduate Research and Innovation Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. XJ2021G196 (to LJL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
锻烧骨：通过物理及化学的方法去除骨内的有机物成分，而保留其无机物成分，通过这种方法可以有效增加材料的生物相容性。
巨噬细胞极化：巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体，在体内复杂的微环境中，巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，而M1型和M2型巨噬细胞是这一连续状态的两个极端，在异物反应中巨噬细胞M1和M2两个表型处于动态平衡状态，是目前免疫研究的热点。

背景：异物反应会导致材料植入失败，近些年来对于免疫学的研究逐渐成为热点，选择具有良好免疫性能的支架材料，对于骨缺损修复具有重要意义。
目的：探讨去抗原处理的煅烧马鹿角松质骨及未去抗原处理的马鹿角对骨髓来源M1型巨噬细胞生物行为的影响。
方法：经过物理及化学方法制备煅烧马鹿角松质骨，通过X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱检测材料理化性质，制备2种材料浸提液并检测浸提液中Ca、P、Mg的元素水平。体外诱导培养骨髓来源巨噬细胞并在脂多糖和干扰素γ刺激下极化为M1型巨噬细胞，然后与各组浸提液共培养，对照组用单纯IMDM完全培养基共培养，CCK-8检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞M1型标志物表达率、qPCR检测巨噬细胞相关基因表达水平。
结果与结论：①去抗原马鹿角组Ca、P、Mg元素水平高于马鹿角组；②去抗原马鹿角组和马鹿角组主要官能团为OH-、PO43-、CO32 -；③共培养1，3，7 d各组M1型巨噬细胞存活率差异无显著性意义；④共培养1 d时，去抗原马鹿角组细胞表面标志物CD16/32表达率低于对照组；⑤共培养1，3 d时，去抗原马鹿角组促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达明显低于对照组；共培养3 d时，去抗原马鹿角组M2型巨噬细胞主要标记物CD206的表达量明显高于对照组；而在共培养1，3 d时马鹿角组的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达或与对照组无差异或明显高于对照组，在CD206因子表达方面均与对照组无差异；⑥结果表明，去抗原马鹿角松质骨粉末浸提液可降低M1型巨噬细胞相关促炎因子的表达并促进其向M2型巨噬细胞极化。

https://orcid.org/0000-0003-4321-890X (单帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 鹿角, 锻烧骨, 浸提液, 骨髓来源巨噬细胞, 异物反应, 巨噬细胞极化

Abstract: BACKGROUND: Foreign body reactions will lead to the failure of material implantation. In recent years, research on immunity has gradually become a hot spot. It is of great significance to select scaffold materials with good immune properties for the development of bone defect repair.
OBJECTIVE: To investigate the effects of calcinated antler cancellous bone and untreated antler bone on the biological behavior of bone marrow-derived M1 macrophages.
METHODS: Calcinated antler cancellous bone was prepared by physical and chemical methods. The physical and chemical properties of calcinated antler cancellous bone and untreated antler bone were detected by X-ray photoelectron spectroscopy and Fourier transform infrared spectroscopy. The extracts of calcinated antler cancellous bone and untreated antler bone were prepared and the contents of Ca, P and Mg in the extracts were determined. Bone marrow-derived macrophages were cultured in vitro and polarized into M1 macrophages under lipopolysaccharide and interferon γ stimulation. These cells were then co-cultured with different extracts in calcinated antler cancellous bone and untreated antler bone groups, while co-cultured with an IMDM medium in control group, followed by cell counting kit-8 detection of cell survival, flow cytometry detection of M1 markers, and qPCR detection of macrophage-related genes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The contents of Ca, P and Mg were higher in the calcinated antler cancellous bone group than the untreated antler bone group. (2) The main functional groups in these two groups included OH-, PO43-, and CO32 -. (3) There was no significant difference in cell survival rate among the three groups for 1, 3, and 7 days of co-culture. (4) The expression rate of CD16/32 was lower in the calcinated antler cancellous bone group than the control group after 1-day co-culture. (5) The expression levels of pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor-α and interleukin-6 were lower in the calcinated antler cancellous bone group than the control group after 1 and 3 days of co-culture, while there was no significant difference between the untreated antler bone group and the control group. The expression of CD206, a main marker of M2 macrophages, was significantly higher in the calcinated antler cancellous bone group than the control group at 3 days of co-culture, while there was no significant difference between the untreated antler bone group and the control group at 1 and 3 days of co-culture. (6) To conclude, calcinated antler cancellous bone powder extract can reduce the expression of pro-inflammatory cytokines in M1 macrophages and promote their polarization to M2 macrophages.

Key words: antler, calcinated bone, extract, bone marrow-derived macrophages, foreign body reaction, macrophage polarization

中图分类号:

单帅, 董艺, 刘佳林, 韩祥祯, 何惠宇. 马鹿角粉浸提液对骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3840-3845.

Shan Shuai, Dong Yi, Liu Jialin, Han Xiangzhen, He Huiyu. Effects of red deer horn powder extract on the biological behavior of bone marrow derived macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3840-3845.

图/表（结果） 10

2.1 骨髓来源巨噬细胞的培养及鉴定结果经过巨噬细胞集落刺激因子7 d的诱导，镜下见细胞形态并不统一，多数细胞呈椭圆形，不规则米粒状，见图1；流式细胞术鉴定表面抗原，单核细胞表面抗原CD11b阳性表达(80.3%)，见图2A；巨噬细胞表面抗原F4/80阳性表达(95.9%)，见图2B；流式细胞术鉴定M1型巨噬细胞表面抗原CD16/32阳性表达(93.8%)，见图2C。

2.2 去抗原马鹿角松质骨将马鹿角切割成块，去除外层密质骨后将松质骨切成大小均匀的小块，经过物理化学方法处理，见图3。

2.3 浸提液中3种主要元素水平及其pH值与无血清 IMEM基础培养基相比，马鹿角粉组及去抗原马鹿角粉组制备的浸提液中Ca及P元素水平较高，并出现了新的元素Mg，且去抗原马鹿角粉组Mg水平高于马鹿角粉组。两组鹿角粉制备的浸提液呈碱性，pH值高于基础培养基，见表2。

2.4 两组粉末元素分析主要物质结构均为Ca、P、Mg等。去抗原马鹿角粉组3种元素的峰值均高于马鹿角粉组，该结果也与电感耦合等离子体光发射光谱结果一致，见图4A-C；与去抗原马鹿角粉组峰值相比，马鹿角粉组峰值并不尖锐清晰，杂峰较多，可见未作去抗原处理组鹿角粉，成分较为复杂，见图4D。

2.5 两组鹿角粉官能团位于3 571 cm-1 的峰为OH-的特征峰，1 460，1 413，891，864 cm -1处为4个CO32-特征峰，1 040，960，600和570 cm-1处为PO43-特征峰，此外与马鹿角粉组相比，去抗原马鹿角粉组更加清晰平滑，结果与X射线电子能谱结果一致，见图5。

2.6 各组M1型巨噬细胞存活率 CCK-8实验检测各组浸提液共培养1，3，7 d时M1型巨噬细胞的存活率，结果发现在这3个时间点各组细胞的存活率差异无显著性意义，见图6。

2.7 各组浸提液与M1型巨噬细胞共培养1 d后CD16/32的表达与对照组相比，去抗原马鹿角粉组CD16/32阳性率下降(P < 0.05)，而马鹿角粉组稍高于对照组，但差异无显著性意义，见图7。

2.8 各组M1巨噬细胞肿瘤坏死因子α、CD206、白细胞介素6、白细胞介素10 mRNA表达 qRT-PCR结果显示，M1型巨噬细胞与各组浸提液共培养1，3 d后，与对照组相比，去抗原马鹿角粉组巨噬细胞的促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6以及抑炎因子白细胞介素10均在不同程度被下调(P < 0.05，P < 0.01)；而对于马鹿角粉组来说，共培养3 d的肿瘤坏死因子α表达量与对照组相比没有统计学意义，共培养1 d的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及共培养3 d的白细胞介素6促炎因子表达均明显高于对照组(P < 0.001)，共培养1，3 d的白细胞介素10表达明显低于对照组(P < 0.001，P < 0.01)；共培养1，3 d，马鹿角粉组M2巨噬细胞标志因子CD206表达与对照组之间均无统计学意义；共培养1 d，去抗原马鹿角粉组CD206表达稍高于对照组但无统计学意义；共培养3 d，去抗原马鹿角粉组CD206表达明显高于对照组(P < 0.001)，可见在共培养3 d后，去抗原马鹿角粉组刺激的M1型巨噬细胞有明显M2型极化的迹象，见图8。

2.9 各组M1型巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子α、CD206、白细胞介素6、白细胞介素10水平 ELISA结果显示，共培养1，3 d，去抗原马鹿角粉组上清液中促炎因子肿瘤坏死因子α以及白细胞介素6水平均被不同程度抑制(P < 0.001，P < 0.05)，这一结果与先前PCR的结果保持一致；但去抗原马鹿角粉组在刺激3 d后抗炎因子白细胞介素10水平高于对照组(P < 0.05)，这与之前PCR结果稍有不同；去抗原马鹿角粉组CD206水平与PCR结果也保持一致，在共培养3 d明显高于对照组。对于马鹿角粉组，共培养1 d时白细胞介素6水平与对照组无统计学意义，其余指标与PCR的结果大致一致；马鹿角粉组CD206水平与对照组无统计学意义，与PCR的结果也保持一致，见图9。

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引言

目前，随着骨缺损发病率的不断增加，对骨修复材料提出了更高的要求，异种骨广泛应用于颌面骨缺损修复治疗中，其演化过程大体为从惰性材料到生物活性材料最终发展为智能型材料[1-2]，其中技术较为成熟、应用最为广泛就是组织工程骨，其由支架材料、生长因子和种子细胞构成[2-3]。支架材料构成了组织工程骨的框架，其材质种类的选择对骨修复的成败至关重要。临床中常见材料均有着自己独特的优势[4]，例如较强的材料强度[5]，较好的生物相容性[6]。将不同材料相结合以期提高现有材料功能来满足不同临床需求，这就产生了复合材料的概念。此外，作为异种骨的一种，植入体内后不可避免地会引起机体的一系列免疫反应[7]，在此过程当中产生的一些酶和细胞因子如肿瘤坏死因子α、干扰素γ、脂多糖等，促进巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，极化后又可产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等一系列炎性递质，M1型巨噬细胞的产生会进一步加剧炎症程度，不利于修复[8-9]。但是随着时间的发展，巨噬细胞又会逐步向M2型极化，产生白细胞介素10等具有抵挡外界感染及促进组织再生的因子[10-11]，因此尽早促使细胞向M2型转化是保证修复体稳定性的关键要素之一。
课题组之前研究发现马鹿角粉复合支架具有良好的机械力学性能，细胞及体内实验均显示具有良好的生物相容性，成骨方面也有较好的优势[12-13]。研究还发现将天然骨经化学处理及高温煅烧工艺去除有机物成分后也具有促进成骨的作用[14]。此外学者在对鹿角无机成分分析后，发现除了Ca、P、Na外，Mg在鹿角中含量最高[15-16]。大量的研究表明了Mg元素不仅在生物相容性及成骨方面都有着积极的作用[17]，而且在Mg的刺激下巨噬细胞具有抑制炎症的作用[18-19]。综合这些研究成果，鹿角成分与人骨及常用的骨修复材料羟基磷灰石成分接近且具有促进成骨、成血管的作用，所以探究鹿角材料对免疫细胞的影响具有重大意义。生物材料植入体内后，会持续释放材料所含的元素[20]，而且学者发现当Fe、Mg、Cu等元素含量增高后会对巨噬细胞极化产生影响[21-25]。因此，可以通过浸提液来模拟材料元素渗出的微环境，探究材料的渗出元素是否可以影响巨噬细胞的极化。
由上可知，材料植入体内会引起机体的异物反应，异物反应初期会分泌因子促进周围巨噬细胞向M1型极化。该研究在体外通过脂多糖+干扰素γ诱导巨噬细胞来模拟异物反应初期阶段的M1型巨噬细胞极化，将其与不同处理方式的马鹿角粉浸提液共培养，检测相关因子表达量及巨噬细胞的极化情况，旨在探讨鹿角粉对于免疫细胞的影响，进而为其临床应用奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，将M1型巨噬细胞与各组材料浸提液共培养后进行相关检测，实验结果采用单因素方差分析，组间数据用 LSD-t 检验。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年7月在新疆医科大学第一附属医院感染与免疫实验室及干细胞研究实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级Balb/C小鼠30只，6-8周龄，体质量20-25 g，雌雄不拘，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2016-0003。实验经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准(动物伦理审核项目编号：IACUC20170706-04)。
1.3.2 实验材料、试剂和仪器马鹿角购自新疆特丰药业股份有限公司。胎牛血清(Bioligical Industries，以色列 )；增强型CCK-8试剂盒(同仁，日本 )；RNA快速提取试剂盒(TIANGEN，中国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；qRT-PCR仪(QuantStudio™ 6 Flex，美国)；倒置相差显微镜(莱卡，德国)；IMDM培养基(Gibco，中国)；酶标仪(Thermo，美国)；ELISA试剂盒(江莱生物，中国)；PE-cy5标记抗鼠CD11b(BioLegend，美国)；APC 标记抗鼠F4/80(BioLegend，美国)；PE标记抗鼠CD16/32(BioLegend，美国)。
1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离和诱导将Balb/C小鼠麻醉后引颈处死，无菌条件下取其股骨及胫骨置于预冷的IMDM基础培养基中，移至于超净台内，全程于冰袋上操作。剔除四周的肌肉组织，去除两侧干骺端，用IMDM完全培养基将骨髓冲出髓腔，并将其吹打成均匀的单细胞悬液，以(1-3)×107个/皿的密度接种于10 cm Petri培养皿中，细胞所用培养基为IMDM+巨噬细胞集落刺激因子(20 μg/L)+体积分数为10%胎牛血清+1%青霉素、链霉素，置于37 ℃孵箱中培养，从接种时起，第3，7天半量换液。

1.4.2 骨髓来源巨噬细胞的鉴定原代细胞培养7 d后，用细胞刮刮下细胞，1 000 r/min离心5 min；去上清液，加入PBS重悬，重复上一步离心；去上清液，加入PBS重悬，全自动细胞计数仪计数，400目滤网过滤，以1×106个细胞加入EP管中，其中实验组EP管内加入抗体F4/80-APC、CD11b和PEcy5，而空白组则加入PBS，放入4 ℃冰箱避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，1 000 r/min离心5 min，重复1次，去除未结合的抗体，50 μL PBS重悬后上机检测，并使用Flowjo软件对结果进行分析。
1.4.3 诱导为M1巨噬细胞取培养7 d的巨噬细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的IMDM培养基将巨噬细胞稀释成1×108 L-1，铺于6孔板中，每孔加入100 μg/L脂多糖、30 μg/L干扰素γ，置于37 ℃、体积分数为5% CO2恒温培养箱中培养1 d。
流式细胞术鉴定M1巨噬细胞：脂多糖和干扰素γ诱导1 d后，用细胞刮收集诱导后的M1型巨噬细胞，1 000 r/min离心5 min；去上清液，加入PBS重悬，重复上一步离心；去上清液，加入PBS重悬，全自动细胞计数仪计数，400目滤网过滤，以1×106个细胞加入EP管中，其中实验组EP管内加入抗体CD16/32-PE，而空白组则加入PBS，放入4 ℃冰箱避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，1 000 r/mim离心5 min，重复1次，去除未结合的抗体，50 μL PBS重悬后上机检测，并使用Flowjo软件对结果进行分析。
1.4.4 鹿角粉的制备选用新疆特色马鹿角，为了消除其中的有机成分，需对其进行物理化学处理。松质骨块在2%氢氧化钠中浸泡12 h，然后在体积分数为30%过氧化氢中浸泡24 h，流水洗涤后再浸泡在3∶1的氯仿和甲醇混合物中1 h，烘干箱70 ℃干燥过夜，最后在马弗炉中800 ℃烧结6 h，并在该温度下保持3 h，获得去抗原马鹿角松质骨块，将骨块研磨和筛分获得直径为300-800 μm的颗粒。而马鹿角粉的制取是直接将马鹿角骨块切割、研磨和筛分，以获得与去抗原马鹿角粉直径大小一致的颗粒。
1.4.5 浸提液的制备根据ISO国际标准(10993-12)制做骨粉材料浸提液，马鹿角粉和去抗原马鹿角粉经过60Co消毒后，分别浸泡在IMEM无血清培养基中(200 g/L)，37 ℃培养24 h，离心，取上清，0.22 μm滤器过滤，0.1 mol/L HCl调整pH值至7.4。
1.4.6 浸提液元素浓度检测采用电感耦合等离子体光发射光谱(ICP-OES)确定各组浸提液中的Ca、P、Mg浓度；pH仪测定浸提液的pH值。
1.4.7 实验分组去抗原马鹿角粉组和马鹿角粉组用各自浸提液制备的IMDM完全培养基培养M1型巨噬细胞，对照组用单纯的IMDM完全培养基培养M1型巨噬细胞。各组分别在体外共培养1，3 d做相关检测。M1型巨噬细胞由脂多糖+干扰素γ刺激巨噬细胞1 d而得。
1.4.8 材料元素分析采用X射线光电子能谱仪对马鹿角粉及去抗原马鹿角粉样品表面价态和含量进行观察分析。
1.4.9 官能团分析采用傅里叶变换红外光谱学来表征马鹿角粉及去抗原马鹿角粉的官能群，记录400-4 000 cm-1范围内的透射红外光谱，光谱分辨率为1 cm-1，平均超过100次扫描。
1.4.10 CCK-8检测不同浸提液刺激下细胞存活率将M1型巨噬细胞以3 000个/孔接种在96孔板中，加入相应浸提液共培养，孵育1，3，7 d时按10 µL/孔加入CCK-8，以只添加CCK-8和培养基作为对照，连续孵育3 h，用酶标仪检测450 nm下吸光度值，评估各组细胞存活率，实验重复3次。
1.4.11 流式细胞术检测M1巨噬细胞标志物CD16/32表达量共培养1 d后，用细胞刮收集M1型巨噬细胞，1 000 r/min离心5 min；去上清液，加入PBS重悬，重复上一步离心；去上清液，加入PBS重悬，全自动细胞计数仪计数，400目滤网过滤，以1×106个细胞加入EP管中，加入抗体CD16/32-PE，空白组则加入PBS，4 ℃冰箱避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，1 000 r/mim离心5 min，重复1次，去除未结合的抗体，50 μL PBS重悬后上机检测，并使用Flowjo软件对结果进行分析。
1.4.12 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肿瘤坏死因子α、CD206、白细胞介素6、白细胞介素10 mRNA表达量共培养1，3 d后，提取各组M1型巨噬细胞总RNA，采用RNA反转录试剂盒行反转录以合成cDNA，然后在qRT-PCR系统中运行PCR反应，以β-actin为内参照。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火34 s；循环40次后检测其熔解曲线。分析各样本Ct值，采取2–ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。实验重复3次。qRT-PCR引物序列，见表1。

1.4.13 ELISA检测上清液中肿瘤坏死因子α、CD206、白细胞介素6、白细胞介素10水平 ①M1型巨噬细胞与各组浸提液共培养1，3 d后收集培养基并离心，将离心后的培养基上清液置于-80 ℃保存，以备检测；②提前去除铝箔袋室温平衡60 min后取出板条；③设置标准孔、空白孔及实验孔，将提前梯度稀释好的标准品按不同浓度加入标准品孔，各50 μL，空白孔加入50 μL的样本稀释液，样本孔加入50 μL待测样本；④各孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封膜封孔，37 ℃恒温箱避光孵育60 min；⑤弃去液体，拍干，每孔加入洗涤液350 μL，静置1 min，拍干，重复5次；⑥每孔加入底物A、B各5 μL，37 ℃恒温箱避光孵育15 min；⑦每孔加入终止液50 μL，将 96 孔板放入ELISA检测仪，获取450 nm处吸光度值，根据标准曲线，计算各组目的细胞因子水平。实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①去抗原马鹿角粉及马鹿角粉的理化性质；②各组浸提液与M1型巨噬细胞共培养后的免疫相关指标。
1.6 统计学分析运用SPSS 23.0统计学软件进行处理，以上实验至少重复3次，CCK-8、流式细胞术、qPCR实验数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，组间数据用 LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着异种骨尤其是天然骨材料的发展，面临着材料植入后机体产生异物反应，导致修复体失败的问题[7]。该实验通过将马鹿角粉做去抗原处理后，显示了比未作去抗原处理马鹿角粉具有更好的免疫性能。
材料去抗原就是结合物理煅烧及化学试剂处理天然骨材料，学者研究发现天然骨材料在经过去抗原处理后可有效去除其有机物成分，得到的材料与羟基磷灰石元素构成接近[24]。该研究将马鹿角松质骨去抗原处理后进行了X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱检测，结果均表明去抗原处理后的马鹿角粉比未处理的马鹿角粉波峰清晰，杂峰较少，且与标准羟基磷灰石卡峰形基本一致，达到了材料制备的目标。另外材料浸提液中存在含量较高的Mg元素，为实验的进一步进行奠定了基础。
qPCR和ELISA结果均显示与对照组相比，去抗原马鹿角粉组可明显抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达，而且M2型表面标志物CD206因子表达明显升高，说明去抗原马鹿角粉浸提液可以抑制M1型巨噬细胞的炎症因子表达，并促进其向M2型转换，从而可能更快地结束炎症过程。研究发现，巨噬细胞经脂多糖刺激后可以使细胞膜对Ca离子的通透性增高[26]，使得细胞内Ca离子含量骤增从而激活了NF-κB信号通路，促使细胞分泌更多的炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6[27]，Mg可以通过与钙离子拮抗达到抑制NF-κB信号通路的作用[28]。因此去抗原鹿角粉浸提液抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素6因子的表达，其可能原因是通过其中的Mg离子与Ca离子拮抗从而达到了抑制NF-κB信号通路的作用。
综上，该研究证实去抗原马鹿角粉浸提液在抑制M1型巨噬细胞炎症表达及促进其向M2极化方面均具有积极的作用，并且讨论了其抑制炎症因子表达的原因可能与NF-κB 信号通路受抑制有关，但缺乏相关实验的支撑，这将在进一步的研究中验证。此外，目前临床中常用的骨修复材料，如羟基磷灰石、Bio-oss骨粉等，它们对巨噬细胞生物学行为影响的相关研究还比较少，下一步将完善去抗原马鹿角粉与这些材料的对比，以提高该实验结论的可靠性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

马鹿角粉浸提液对骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响

Effects of red deer horn powder extract on the biological behavior of bone marrow derived macrophages

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