医用可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶的生物安全性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1632

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

防粘连凝胶：适用于预防妇产科、普通外科、骨外科、泌尿外科等术后的粘连，在遇到组织液后自动固化成膜，具有良好的生物相容性和柔韧性，通过膜的“屏障”作用及膜的降解与术后粘连形成的时差作用，将手术创面和周围组织隔离开，并在降解后成为微小的间隙，能够阻止周围组织中成纤维细胞对手术创面的入侵，避免它们直接接触产生粘连。

生物安全性：指所有材料设备、过样或系统对宿主不引起明显的临床反应，即无大血栓形成、无毒性、无过敏或炎症反应、无破坏血细胞作用。目前，与人体直接或者间接接触的医疗器械约占整个医疗器械市场的50%，所以其重要性已备受关注。

背景：前期研究制备的可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶结合了防粘连膜和防粘连液的优点，于较短时间内可在原位形成形状柔软的凝胶，不受体位影响，可承受周围组织的压力且自身无压迫作用。

目的：评价医用可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶的生物相容性。

方法：以对数生长期的L929细胞为受试细胞，采用MTT法检测可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液的细胞毒性；以日本大耳兔为受试动物，进行可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液的皮内刺激实验；以豚鼠为受试动物，进行可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液的皮内诱导与局部诱导迟发型超敏反应实验；以Wistar大鼠为受试动物，进行可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液的亚慢性毒性实验。

结果与结论：可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液的细胞毒性为1级，符合标准要求；可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液无潜在皮内刺激作用、无潜在皮肤致敏性；亚慢性毒性实验中，对大鼠连续尾静脉注射28 d的可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液，大鼠体质量、血液学、凝血功能、血液生化学和脏器病理均未见明显的亚慢性全身毒性反应；结果表明，可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶具有良好的生物安全性。

ORCID: 0000-0003-3275-8396(高萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 防粘连凝胶, 生物安全性, 羧甲基葡糖胺聚糖, 浸提液, 可注射防粘连胶, 迟发型超敏反应

Abstract:

BACKGROUND: The injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel prepared in the previous study combines the advantages of anti-adhesion membrane and anti-adhesion liquid. It can form soft gel in situ in a relatively short time, which is not affected by body position, bear the pressure of surrounding tissues and can be used without compression.

OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of medical injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel.

METHODS: Logarithmic growing L929 cells were used as test cells, and the cytotoxicity of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract was detected by MTT method. The intradermal stimulation test of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract was carried out in Japanese big ear rabbits. Guinea pigs were used as experimental animals to carry out intradermal induction and local induced delayed hypersensitivity test of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract. Wistar rats were used as experimental animals to carry out the subchronic toxicity test of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract.

RESULTS AND CONCLUSION: The cytotoxicity of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract was grade 1, meeting the standard requirements. Injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract had no potential intradermal stimulation and no potential skin sensitization. In the subchronic toxicity test, the rats were subjected to the tail vein injection of injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel extract for 28 continuous days, and there was no obvious subchronic systemic toxicity in body mass, hematology, coagulation function, blood biochemistry and visceral pathology. These results indicate that the injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel has good biosafety.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Materials Testing, Gels, Tissue Adhesions, Tissue Engineering

中图分类号:

高萍，程琳，陈斌，李睿智，李昕，史梦柔，李光远，程鹏，李东风，于欢，王晓辉. 医用可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶的生物安全性评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(10): 1570-1574.

Gao Ping, Cheng Lin, Chen Bin, Li Ruizhi, Li Xin, Shi Mengrou, Li Guangyuan, Cheng Peng, Li Dongfeng, Yu Huan, Wang Xiaohui. Biosafety of medical injectable carboxymethyl glycosaminoglycan anti-adhesion gel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(10): 1570-1574.

图/表（结果） 4

2.1 细胞毒性实验结果阴性对照组相对增殖率为100.7%，细胞毒性反应为0级；阳性对照组相对增殖率为5.2%，细胞毒性反应为4级，说明实验系统反应成立。样品浸提液组的相对增殖率为86.0%，细胞毒性反应为1级。符合标准要求。实验结果，见表2。各组细胞镜下状态，见图1。

2.2 皮内刺激实验结果样品生理盐水和芝麻油浸提液的皮内反应记分均为0，阴性对照生理盐水和芝麻油浸提介质的皮内反应记分也均为0，2种浸提液与各自浸提介质的反应平均记分之差均为0，符合标准平均记分之差小于1.0的要求。实验结果，见表3。

2.3 迟发超敏实验结果除去贴敷物24 h后，阴性对照组和样品浸提液组豚鼠激发部位皮肤反应均为0级，阳性对照组3只反应为2级，2只反应为3级。48 h后，阴性对照和样品浸提液组豚鼠皮肤反应均为0级；阳性对照组2只反应为1级，2只反应为2级，1只反应为3级。在此次实验条件下，样品生理盐水组和芝麻油浸提液组动物皮肤反应等级未超过相应的阴性对照组动物反应等级，实验样品浸提液未引起迟发型超敏反应，无潜在的皮肤致敏性。实验结果，见表4。

2.4 亚慢性毒性实验结果在整个实验过程中，样品组和对照组均未观察到明显的临床毒性症状，体质量增长和摄食量正常，脏器指数、血液学、凝血、血液生化学(肝、肾功能、糖脂代谢)、血液电解质均在实验室正常值范围内，各脏器病理组织学观察未见明显的病理改变，实验结果见表5。大鼠连续28 d由尾静脉注射样品浸提液后，未见与受试材料相关的明显亚慢性全身毒性反应指征。

参考文献

[1] 苏迪娅,刘松,王世炜,等.椎板切除神经根损伤后聚羧甲基葡糖胺产品抗瘢痕粘连的效果[J].中国康复理论与实践, 2015,21(1):45-48.

[2] Zheng YY,Liang YQ,Zhang DP,et al.Gelatin-Based Hydrogels Blended with Gellan as an Injectable Wound Dressing.Acs Omega. 2018;3(5):4766-4775.

[3] 谢新艺,吕鹏举,颜林.可吸收医用防粘连材料及其性能要求研究进展[J].中国医疗器械信息,2012, 18(8):10-18.

[4] 罗军.几种手术防粘连材料的性能比较分析[J].中国医疗设备, 2008, 23(4):128-129.

[5] 池余刚,杨晓煜,何萍,等.经皮雌二醇凝胶用于中重度宫腔粘连术后辅助治疗的研究[J].生殖医学杂志, 2016,5(8):691-695.

[6] Liu Y,Skardal A,Shu XZ,et al.Prevention of peritendinous adhesions using a hyaluronan-derived hydrogel film following partial-thickness flexor tendon injury. J Orthop Res. 2008;26(4):562-569.

[7] Tuncay I,Ozbek H,Atik B,et al.Effects of hyaluronic acid on postoperative adhesion of tendo calcaneus surgery: An experimental study in rats. J Foot Ankle Surg. 2002;41(2):104-108.

[8] 张卫国,姜长明.高分子纤维素预防肌腱粘连的实验研究[J].实用手外科杂志,2003,17(4):51-53.

[9] Butler J. Hyaluronic acid in synovial fluid. VI. Effect of intra-articular injection of hyaluronic acid on the clinical symptoms of arthritis in track horses. Acta Vet Scand.1970;11(2):139-155.

[10] Amiel D,Ishizue K,Billings E,et al.Hyaluronan in flexor tendon repair. J Hand Surg.1989;14(5):837-843.

[11] 刘文,常菁,刘万顺,等.壳聚糖基复合膜的制备及预防术后肌腱粘连功能的研究[J].功能材料,2009, 40(3):450-454.

[12] 邹剑,张长青.可吸收膜预防鸡肌腱粘连的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2005,7(10):967-970.

[13] 肖颖锋.聚DL-乳酸可吸收性防粘连膜预防肌腱粘连的临床应用[C].广东省手外科学学术会议,2005.

[14] 唐朝阳.肌腱套管加透明质酸钠局部注射防止肌腱粘连的临床疗效观察[J].中国现代手术学杂志,2008, 12(2):121-123.

[15] 王铭河,李大卫.壳聚糖生物膜在结直肠癌手术中的应用[J].临床医药文献电子杂志,2015,2(23):4797-4798.

[16] 魏钢.医用防粘连改性壳聚糖膜对胃癌术后腹腔粘连的预防作用[J].实用癌症杂志,2015,30(2):239-241.

[17] 金小英,钟少平,陈校丹.羧甲基壳聚糖预防输卵管整形术后再次粘连的疗效研究[J].浙江医学,2017,39(17):1486-1487.

[18] 杨君乐,宋华羽.壳聚糖联合马应龙痔疮栓治疗对混合痔术后肛缘创面的影响[J].新中医, 2016,48(4):109-111.

[19] 胡畅,吴清玉,郭宝华,等.聚乙烯醇-羧甲基纤维素防粘连膜的生物相容性[J].中华实验外科杂志,2016, 33(7):1822-1825.

[20] 梁永辉,磨鹏诗,廖伟明,等.腹腔镜化脓性阑尾切除术后应用壳聚糖预防肠黏连的临床观察[J].海南医学, 2018,29(20):2898-2899.

[21] 王汉斌,苏亦兵,史良,等.一种聚己内酯/明胶膜对兔颅骨缺损模型的防黏连作用[J].中国微侵袭神经外科杂志, 2016,21(11):516-519.

[22] 何楠,龙安妮,胡畅,等.聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠复合膜预防血管开放术后黏连的实验研究[J].中国循环杂志, 2018,33(7):714-718.

[23] Montalvo-Javé EE,Mendoza-Barrera GE,GarcíA-Pineda MA,et al.Histological Analysis of Intra-Abdominal Adhesions Treated with Sodium Hyaluronate and Carboxymethylcellulose Gel. J Invest Surg.2016;29(2):80-87.

[24] 简军,李睿智,李东风.医用可注射防粘连凝胶及其制备方法:,CN 104307052 A[P].2015.

[25] 张玉兰,袁源,常丽,等.可吸收止血膜止血作用的试验研究[J].中国医学物理学杂志,2017,34(8):841-847.

[26] Bang S,Ko YG, Kim WI,et al. Preventing postoperative tissue adhesion using injectable carboxymethyl cellulose-pullulan hydrogels. Int J Biol Macromol.2017;105(Pt 1):886-893.

[27] 赵瑛,胡巧玲,方征平,等.壳聚糖/明胶防术后黏连膜的制备和表征[J].浙江大学学报(工学版),2004, 38(1):121-124.

[28] 林美岑,李寅,胡红文.中度宫腔粘连宫腔镜术后宫腔放置透明质酸钠预防粘连的疗效分析[J].临床医药文献电子杂志, 2017,4(97): 19051-19052.

[29] 薛佳佳.基于明胶的生物弹性体及生物医用膜材料的制备与性能研究[D].北京:北京化工大学,2015.

[30] Zeng RX,He JY,Zhang YL,et al.Experimental study on repairing skin defect by tissue-engineered skin substitute compositely constructed by adipose-derived stem cells and fibrin gel. Eur Rev Med Pharmacol Sci.2017;21(3 Suppl):1-5.

[31] Albiñanacunningham JN, Ripaldacemboráin P, Labiano T, et al. Mechanical barriers and transforming growth factor beta inhibitor on epidural fibrosis in a rabbit laminectomy model.J Orthop Surg Res. 2018;13(1):72.

[32] Bülbüller N,Karaka? BR,Y?ld?r?m HT,et al.Effect of a new cross-linked hyaluronan gel on the staple line after sleeve gastrectomy in a rat model. Acta Cir Bras. 2018;33(2):163-174.

[33] 迟妍妍,乐尧金,刘旭昭,等.胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收[J].中国组织工程研究,2014,18(34):5515-5519.

[34] Kean T,Thanou M. Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(1):3-11.

[35] 贾莉芳,袁暾,王亚宁,等.不同用途透明质酸钠凝胶的亚慢性毒性和局部植入反应试验的研究比较[J].生物医学工程学杂志, 2012,29(5): 919-922.

引言

材料方法

1.1 设计医用生物材料的生物相容性实验。

1.2 时间及地点实验于2014-11-25至2015-02-12在天津市医药科学研究所细胞毒性检测室和实验动物实验室完成。

1.3 材料羧甲基葡糖胺聚糖(20141008，爱美克技术发展股份有限公司)；PBS(0032818，Biological Industries公司)；高密度聚乙烯(20140801，江门市新会区皓天工贸有限公司)；戊二醛(20131101，天津化学试剂批发公司)；弗式完全佐剂(SLBF9338V，Sigma公司)；胎牛血清(NWJ0473，Hyclone)；MEM培养液(862839，Gibco)；生理盐水(4D74G1，中国大冢制药有限公司)；芝麻油(A0318542，ACROS公司)；L-929细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

实验动物：初成年中白化豚鼠，体质量300-350 g；三四月龄雄性日本大耳白兔，体质量2.2-2.5 kg，均购自北京隆安试验动物养殖中心，许可证号：SCXK(京)2014- 0003。6-8周龄Wistar大鼠，体质量80-100 g，雌雄各半，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.4 实验方法

1.4.1 可注射凝胶的配制羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶按照专利配制^[24]，将分子质量100 kDa的羧甲基葡糖胺聚糖溶解于pH=7.4的PBS中，质量浓度为100 g/L，作为高分子原液；将戊二醛溶于pH=10的PBS中，作为交联剂原液；交联剂与高分子聚合物的质量比为0.1∶1。将高分子聚合物溶液装入双联注射装置的A管，将交联剂溶液装入双联注射装置的B管，通过推挤双联注射装置，可使底物溶液和交联剂溶液在共同注射针头处混合并推挤出。

1.4.2 凝胶的生物学评价根据GB/T16886系列国家标准选择生物相容性实验，为凝胶的安全性评价提供依据。

样品浸提液的制备：将实验样品推弃掉初始端0.5 mL后，取余下混合样品，经30 min使凝胶凝固后，与相应的浸提介质以1∶5的体积比混合制备浸提液，亚慢性全身毒性实验以1∶7的体积比混合制备浸提液。其中体外细胞毒性实验采用细胞培养液为浸提介质，在37 ℃浸提24 h；皮内刺激实验和迟发型超敏反应实验采用生理盐水和芝麻油为浸提介质，亚慢性全身毒性实验采用生理盐水为浸提介质，在37 ℃浸提72 h。

细胞毒性实验：将对数生长期的L-929细胞接种于96孔板，每孔100 µL，在含体积分数5%CO₂条件下，37 ℃培养24 h后，弃去培养液，分组培养：空白对照组更换为细胞培养液，阴性对照组更换为浸提比例为6 cm²/mL的高密度聚乙烯浸提液，阳性对照组更换为含5%二甲基亚砜的细胞培养液，样品浸提液组更换为羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液，每组6孔。置CO₂培养箱内37 ℃培养72 h后，加MTT继续培养4 h，在酶标仪570 nm和630 nm处测定吸光度值。计算相对增殖率(RGR)，根据对增殖率判断实验样品细胞毒性反应级别：≥100%，为0级；80%-99%，为1级；50%-79%，为2级；30%-49%，为3级；0%-29%，为4级。

皮内刺激实验：取日本大耳白兔2只，背部备皮并消毒，在脊柱两侧各选择10个点，每点间隔2 cm，每点皮内注射0.2 mL，左侧前5 点注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶生理盐水浸提液(实验组)，后5点注射同批号生理盐水(对照组)，右侧前5点注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶芝麻油浸提液(实验组)，后5点注射同批号芝麻油(对照组)。注射后24，48，72 h，按表1记录注射点的红斑和水肿反应记分。将实验组和对照组的全部红斑和水肿的记分相加，再除以12[2(动物数)×3(观察点)×2(记分类型)]，计算出实验组和对照组的综合平均记分。

迟发型超敏实验：采用豚鼠最大剂量法进行实验。样品组将羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶生理盐水浸提液以皮内注射和皮肤敷贴的方式，对10只受试豚鼠进行皮内诱导和局部诱导，将羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶芝麻油浸提液以相同方式对10只受试豚鼠进行皮内诱导和局部诱导。皮内注射弗氏完全佐剂予以加强。局部诱导后13 d以腹部敷贴法进行激发。10只阴性对照(分2组，每组5只，分别以生理盐水注射液和芝麻油进行诱导和激发)和5只阳性对照(以0.1% 2，4-二硝基氯苯进行诱导和激发)也同时进行实验。激发除去敷贴物后24，48 h，观察动物激发部位皮肤的红斑、水肿等反应情况，按Magnusson和Kligman分级表记录各观察点激发部位的红斑和水肿的反应分级：无明显改变，0级；散发性或斑点状红斑，1级；中度融合性红斑，2级；严重红斑和水肿，3级。

亚慢性毒性实验：将40只Wistar大鼠分为样品组和对照组，每组20只，雌雄各半。样品组以10 mL/kg的剂量将羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶浸提液由大鼠尾静脉注入体内，对照组以相同的剂量和方式注射相应的浸提介质(生理盐水)，1次/d，连续注射28 d，每周记录体质量和摄食量。末次注射24 h后，腹主动脉取血进行血液学、凝血功能和生化方面检测，采集动物心脏、肝脏等28处器官或组织进行病理组织学检查。t 检验统计结果，分析毒性反应产生与实验样品之间的相关性。

1.5 主要观察指标可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶用的生物相容性。

1.6 统计学分析亚慢性毒性实验的数据分析用SPSS 16.0软件完成。样品组和对照组间的数据用两样本均数t 检验进行比较。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前市场上已有的抗瘢痕粘连产品，膜材料自动黏附力差，无法全方位和创面贴合，需通过缝合固定保证其使用效果^[25-27]，无法达到预期的防粘连效果，而防粘连液的降解时间短^[28-31]，通常情况下，在创伤急性炎症期过后材料就完全被体内吸收，无法阻止创面在慢性炎症期内发生的粘连，无法达到预期的防粘连效果。而此次实验的可注射防粘连凝胶，结合了防粘连膜和防粘连液的优点，经双联注射装置推注至创面部位时可为流动的液体，迅速填满神经或肌腱等组织周围的缝隙，并在较短时间内原位形成柔软的凝胶，该凝胶不受体位影响，可承受周围组织的压力且自身无压迫作用^[24]，所以为尽快将可注射防粘连凝胶应用于临床使用，此次项目对可注射防粘连凝胶的生物安全性进行评价。

对可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶进行细胞毒性实验，结果显示其细胞毒性反应为1级，符合生物材料的安全性评价要求。羧甲基葡糖胺聚糖单体本身具有良好生物相容性^[32-34]，而材料配方中引用的交联剂可能增加了材料的细胞毒性。但细胞毒性实验结果证实，该配方的交联剂并没有使材料的细胞毒性明显增加。通过文献分析认为交联剂是产生毒性的主要原因，有待实验证实。

皮内刺激实验和迟发超敏实验是生物材料安全性评价要求检测指标，研究结果显示可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶对机体没有任何刺激反应，但该凝胶的应用范围较广，可应用于机体内部的伤口，所以需要对其毒性进行更加深入的研究。

研究按照GB/T16886系列国家标准选择生物相容性实验标准，选用的亚慢性全身毒性实验是评价长期或持久接触类医疗器械生物材料安全性的重要检测指标。在亚慢性毒性实验中，可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶对动物的体质量增长和摄食量没有影响，动物的脏器指数、血液学、凝血、血液生化学(肝、肾功能、糖脂代谢)、血液电解质均在实验室正常值范围内，各脏器病理组织学观察未见明显病理改变。此次研究是将实验样品凝胶浸提液经大鼠尾静脉注射直接全身给药，更能够体现凝胶系统的全身毒性，而贾莉芳等^[35]在研究透明质酸钠凝胶的亚慢性毒性实验中是将凝胶植入体内，该方法更加贴合临床使用要求，但具体那种方法更加适用，还有待实验研究。

综上所述，医用可注射羧甲基葡糖胺聚糖防粘连凝胶的生物安全性实验结果显示，其细胞毒性、皮内刺激实验、迟发超敏和亚慢性全身毒性实验均符合医用生物材料的要求。这为该剂型和未来的衍生剂型发展打下基础，该剂型在关节、神经、硬膜、皮肤、黏膜、骨组织手术中用于控制炎症和粘连有很好的发展前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程