骨组织工程中应用的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1269

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (22): 3445-3450.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1269

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 下一篇

骨组织工程中应用的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架

傅娜，罗晓丁，焦铁军，隋磊

天津医科大学口腔医院，天津市 300070

收稿日期:2019-03-21 出版日期:2019-08-08 发布日期:2019-08-08
通讯作者: 隋磊，主任医师，天津医科大学口腔医院修复科，天津市 300070
作者简介:傅娜，女，1986 年生，山东省淄博市人，汉族，2016 年四川大学华西口腔医学院毕业，博士，讲师，主要从事支架材料、干细胞在组织工程方面应该的研究。
基金资助:
国家自然科学青年科学基金项目(81800930)，项目负责人：傅娜；天津医科大学天津市高等学校基本科研业务费资助项目(2017KJ217)，项目负责人：傅娜

Application of electrospun polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone fiber scaffolds in bone tissue engineering

Fu Na, Luo Xiaoding, Jiao Tiejun, Sui Lei

Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Received:2019-03-21 Online:2019-08-08 Published:2019-08-08
Contact: Sui Lei, Chief physician, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
About author:Fu Na, MD, Lecturer, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81800930 (to FN); Science & Technology Development Fund of Tianjin Education Commission for Higher Education, No. 2017KJ217 (to FN).

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

静电纺丝技术：是指事先将所选用的材料制备成为聚合物溶液，通过正负电压差产生电场力，当电场力大于聚合物溶液的表面张力时，聚合物溶液形成喷射状细流，靠静电作用产生纤维，并将纤维收集在相应的接收装置上，从而得到所需支架的一种方法。

骨桥蛋白：是一种广泛分布的O-糖基化磷酸蛋白，又被称为分泌性磷蛋白1、骨涎蛋白1、Eta-1等，可在上皮、肾、骨和牙齿等的各种组织中表达，也可在包括血液和母乳在内的所有体液中检测出。骨桥蛋白在如细胞黏附和迁移、血管生成、免疫、神经发育和肿瘤转移等许多生理和病理过程中起作用。

背景：聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯是一种良好的组织工程支架材料，目前没有将其采用静电纺丝技术制成电纺支架并用于骨组织工程的报道。

目的：采用静电纺丝技术制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯支架，检测其理化性能、生物学性能及成骨性能。

方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯支架，利用扫描电镜观察支架表面形貌，并检测支架亲水角及杨氏模量等理化性能。将骨髓间充质干细胞接种于聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯支架上，扫描电镜观察细胞形态。实验组将骨髓间充质干细胞接种于聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯支架上，对照组单独培养骨髓间充质干细胞，培养1，3，5 d后，采用CCK-8法检测细胞增殖；成骨诱导1，5，7，14 d后，采用荧光定量PCR法检测成骨基因Runx2和骨桥蛋白的表达。实验经四川大学华西口腔医学院伦理委员会批准(SKLODLL2013A173)。

结果与结论：①聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架是一种无纺结构，其纤维连续且表面光滑均匀，无颗粒结节形成，纤维之间有明显的分界，且纤维之间相互交织形成小不一孔隙的三维结构，其亲水角为(116.1±2.5)°，相对疏水，杨氏模量为16.464 4 MPa；②在聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架上可见大量黏附的骨髓间充质干细胞，相邻细胞之间开始互相连接并融合在一起，部分长入架纤维的孔隙中；③实验组培养不同时间点的细胞增殖速度均快于对照组(P < 0.05)；实验组成骨诱导5，7，14 d的Runx2基因表达高于对照组(P < 0.05)，成骨诱导1，5，7，14 d的骨桥蛋白基因表达高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架具有良好的理化性能、生物学性能与成骨性能。

ORCID: 0000-0001-9666-9646(傅娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯, PCL-PEG-PCL, 静电纺丝技术, 骨髓间充质干细胞, 生物相容性, 生物安全性, 成骨基因, 骨组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone (PCL-PEG-PCL) is a good scaffold material for tissue engineering. Little is reported on electrospun PCL-PEG-PCL in bone tissue engineering.

OBJECTIVE: To prepare PCL-PEG-PCL scaffolds using electrospinning technology and investigate their physical/chemical/biological/ osteogenic properties.

METHODS: PCL-PEG-PCL scaffolds were prepared using electrospinning technology. Scaffold surface was characterized by scanning electron microscopy. The physical and chemical properties, such as the hydrophilic angle and Young’s modulus, of the scaffold were determined. Bone marrow mesenchymal stem cells were seeded on PCL-PEG-PCL scaffolds and cell morphology was observed. In the experimental group, bone marrow mesenchymal stem cells were seeded on PCL-PEG-PCL scaffolds and then cultured. In the control group, bone marrow mesenchymal stem cells were concurrently cultured without seeding on the PCL-PEG-PCL scaffolds. After culture for 1, 3, 5 days, cell proliferation was determined by the Cell Counting Kit-8 assay. After osteogenic induction for 1, 5, 7, and 14 days, the expression levels of osteogenic genes Runx2 and osteopontin were detected by fluorescence-based quantitative PCR. The study was approved by the Ethics Committee of West China School of Stomatology, Sichuan University (SKLODLL2013A173).

RESULTS AND CONCLUSION: Electrospun PCL-PEG-PCL scaffold had a non-woven structure. Its fibers were continuous and had smooth surface without granular nodules. There was no obvious boundary between the fibers. The fibers were interwoven with each other to form a three-dimensional structure with different sized pores. The hydrophilic angle was (116.1±2.5)° and was relatively hydrophobic. The Young's modulus was 16.464 4 MPa. A large number of bone marrow mesenchymal stem cells adhered on the electrospun PCL- PEG-PCL scaffolds. Adjacent cells began to connect and fuse with each other, and some of them grew into the pore of the scaffold fibers. The proliferation speed of cells cultured at different time points in the experimental group was faster than that in the control group (P < 0.05). At 5, 7, 14 days of culture, Runx2 gene expression in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). At 1, 5, 7, 14 days of culture, osteopontin expression in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). These results suggest that electrospun PCL-PEG-PCL scaffolds exhibit encouraging physical/chemical/biological/osteogenic properties.

Key words: polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone, PCL-PEG-PCL, electrospinning, bone marrow mesenchymal stem cells, biocompatibility, biosafety, osteogenic gene, bone tissue engineering

中图分类号:

傅娜，罗晓丁，焦铁军，隋磊. 骨组织工程中应用的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(22): 3445-3450.

Fu Na, Luo Xiaoding, Jiao Tiejun, Sui Lei. Application of electrospun polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone fiber scaffolds in bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(22): 3445-3450.

图/表（结果） 4

2.1 静电纺丝支架的表面形貌及理化性能扫描电镜显示，PCL-PEG-PCL静电纺丝支架是一种无纺结构，其纤维是相连续的且纤维表面光滑均匀，无颗粒结节形成，纤维之间有明显的分界，且纤维的走行方向并不一致，纤维之间是相互交织的，形成了具备较多大小不一孔隙的三维结构，见图1A。去离子水滴在PCL-PEG-PCL静电纺丝支架上所采集的图片显示，水滴与PCL-PEG-PCL静电纺丝支架表面之间形成的亲水角为(116.1±2.5)°，相对是疏水的，见图1B。

从样品的延伸曲线可看出，PCL-PEG-PCL静电纺丝支架可承受最大1.1 N的拉伸力，其断裂前的拉伸长度可至50 mm左右，见图2A；PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的杨氏模量为16.464 4 MPa，延伸率为129.09%，见图2B。

2.2 静电纺丝支架表面的细胞行为学检测结果接种后细胞伸出多个突起并贴附在PCL-PEG-PCL静电纺丝支架周围的纤维上，形态不规则，接种时间越长，静电纺丝支架上细胞的分裂速度越快、细胞数目越多，且相邻细胞之间开始互相连接并融合在一起，可看到很多细胞都长到了PCL-PEG-PCL静电纺丝支架纤维的孔隙中，不只表面的纤维上有细胞，下层纤维中也有细胞生长，见图3A，B。PCL-PEG-PCL静电纺丝支架表面逐渐被融合成片的细胞所覆盖，支架表面的原有的形态模糊不清，很难分辨。

CCK-8检测显示，实验组培养1，3，5 d后的细胞分裂增殖速度均明显高于对照组(P < 0.05)，见图3C。

2.3 静电纺丝支架促进成骨基因表达实验组诱导培养5，7，14 d的Runx2基因表达明显高于对照组(P < 0.05)，且在5 d时达高峰；实验组诱导培养1，5，7，14 d骨桥蛋白基因表达明显高于对照组(P < 0.05)，且在7 d时达高峰，见图4。

参考文献

[1]Rogers C.AAOS Supports Research on many Fronts.Am Acad Orthop Sur Bull.2007.

[2]Long T,Yang J,Shi SS,et al.Fabrication of three-dimensional porous scaffold based on collagen fiber and bioglass for bone tissue engineering.J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater. 2015;103 (7):1455-1464.

[3]Wei J,Smith AA,Liu B,et al.Reengineering autologous bone grafts with the stem cell activator WNT3A. Biomaterials. 2015; 47:29-40.

[4]Zhou X,Sahai N,Qi L,et al.Biomimetic and nanostructured hybrid bioactive glass. Biomaterials. 2015;50:1-9.

[5]Brian Alan F,Nikita K,Anusuya D,et al.Current concepts of bone tissue engineering for craniofacial bone defect repair.Craniom Trau Reconstr.2014;8(1):23-30.

[6]Lo H,Kadiyala S,Guggino SE,et al.Poly(L-lactic acid) foams with cell seeding and controlled-release capacity.J Biomed Mater Res Part A.2015;30(4):475-484.

[7]Park SM,Kim DS.Electrolyte-assisted electrospinning for a self-assembled, free-standing nanofiber membrane on a curved surface.Adv Mater.2015;7:1682-1687.

[8]Harris LD,Kim BS,Mooney DJ.Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J Biomed Mater Res. 2015;42(3):396-402.

[9]Zeltinger J,Sherwood J,Graham D,et al.Effect of pore size and void fraction on cellular adhesion, proliferation, and matrix deposition.Tissue Eng Part A.2001;7(5):557-572.

[10]Logeartavramoglou D,Anagnostou F,Bizios R,et al. Engineering bone: challenges and obstacles. J Cell Molecul Med.2010;9(5):72-84.

[11]Ji W,Sun Y,Yang F,et al. Bioactive Electrospun Scaffolds Delivering Growth Factors and Genes for Tissue Engineering Applications.Pharma Rese.2011;28(6):1259-1272.

[12]Pham QP,Sharma U,Mikos AG.Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.Biomacromolecules. 2006;7(10):2796-2805.

[13]Tuzlakoglu K,Bolgen N,Salgado AJ,et al.Nano-and micro-fiber combined scaffolds: A new architecture for bone tissue engineering.J Mater Sci Mater Med.2005;16(12):1099-1104.

[14]Cotí KK,Belowich ME,Monty L,et al.Mechanised nanoparticles for drug delivery.Nanoscale. 2009;1(1):16-39.

[15]Guo G,Fu S,Zhou L,et al.Preparation of curcumin loaded poly(ε-caprolactone)-poly(ethylene glycol)-poly (ε-caprolactone) nanofibers and their in vitro antitumor activity against Glioma 9L cells.Nanoscale. 2011;3(9):3825-3832.

[16]Zhou S,Deng X,Yang H.Biodegradable poly(-caprolactone)-poly(ethylene glycol) block copolymers: characterization and their use as drug carriers for a controlled delivery system.Biomaterials. 2003;24:3563-3570.

[17]Xie J,MacEwan MR,Schwartz AG,et al.Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2010; 2(1):35-44.

[18]Zhang D,Tong A,Zhou L,et al.Osteogenic differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells (PMSCs) on electrospun nanofiber meshes.Cytotechnology. 2012; 64(6):701-710.

[19]Fu N,Liao J,Lin S,et al.PCL-PEG-PCL film promotes cartilage regeneration in vivo.Cell Prolif.2016;49(6):729-739.

[20]Lutolf MP,Hubbell JA.Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol.2005;23(1):47.

[21]Kim SS,Sun Park M,Jeon O,et al. Poly(lactide-co-glycolide)/ hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering.Biomaterials.2006;27(8):1399-1409.

[22]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284 (5411):143-147.

[23]Mackenzie TC,Flake AW.Multilineage differentiation of human MSC after in utero transplantation. Cytotherapy. 2001;3(5): 403-405.

[24]Kim J,Jeong SY,Ju YM,et al.In vitro osteogenic differentiation of human amniotic fluid-derived stem cells on a poly(lactide- co-glycolide) (PLGA)-bladder submucosa matrix (BSM) composite scaffold for bone tissue engineering. Biomed Mater. 2013;8:014107.

[25]Takashi F,Yasutaka A,Ryo F,et al.Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with PI3K-Akt signaling.J Cell Biol. 2004;166(1): 85-95.

[26]Doherty MJ,Ashton BA,Walsh S,et al.Vascular pericytes express osteogenic potential in vitro and in vivo.J Bone Miner Res.2010;13(5):828-838.

[27]Viereck V,Siggelkow H,Tauber S,et al.Differential regulation of Cbfa1/Runx2 and osteocalcin gene expression by vitamin-D3, dexamethasone, and local growth factors in primary human osteoblasts. J Cell Biochem.2002;86(2):348-356.

引言

因创伤、先天性畸形、炎症和肿瘤等原因导致的骨组织病损，是临床上常见而又亟待解决的难题，不仅给患者带来严重痛苦，也给家庭及社会带来沉重的经济负担。目前因各种原因造成的骨缺损患者数量日益增加，仅在中国每年就有数百万的骨缺损患者^[1]。临床上巨大的骨缺损治疗，常常由于移植骨不足出现周围骨组织向缺损处生长迁移很慢，致缺损很难愈合，严重影响患处功能和患者生活质量^[2]，但目前没有有效的治疗方法^[3]。骨组织工程技术近年来的迅猛发展，为骨缺损治疗提供了新的思路及方法，是治疗骨缺损很有前景的方案^[4]。组织工程常将干细胞或种子细胞种植于有良好组织相容性、可降解支架材料上，添加生物化学因子等因素促进细胞生长，改进组织结构及功能^[5]。骨髓间充质干细胞取材方便，体外培养技术成熟且操作简单，且对其性质研究也较明确，是骨组织工程中最有希望的一类种子细胞。目前骨组织工程研究的关键在于支架的设计和构建。支架材料在骨组织再生过程中起着支撑缺损处结构、为新生骨成长提供微环境、连结新生骨与缺损部位宿主骨等作用。目前用于制备骨组织工程支架的方法有很多，如：颗粒致孔、诱导相分离、静电纺丝、自组装纳米纤维、乳液冷冻干燥及气体发泡等^[6-8]，其中静电纺丝所制备的聚合物纳米纤维组织工程支架越来越受到重视，主要是因为其具有模拟细胞外基质的结构特点，且其高孔隙率及贯通性也对细胞的生长及迁移、营养物质扩散、血管化及骨组织化等都非常有利^[9-10]，另外对于生物活性因子也具有很高的包载效率^[11]。

用于骨缺损修复再生的组织工程支架材料，除应具备良好的生物相容性和生物安全性外，还应具有可控的降解速率及良好的物理性能。大量研究证明聚己内酯具有在体内形成细胞-支架复合物的能力，是一种可用于组织工程的支架材料^[12-13]。作为一种典型的亲水性聚合物，聚乙二醇也被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床，低分子量聚乙二醇容易通过肾脏排泄^[14]。四川大学生物治疗国家重点实验室将聚乙二醇引入到聚己内酯主链中，合成了两亲性三嵌段共聚物—聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯[Poly (caprolactone)- poly(ethylene glycol)-Poly(caprolactone)，PCL-PEG- PCL]^[15]，其与单纯聚己内酯相比降解率高、亲水性强，但酸性低，在形成细胞-支架复合物方面有很好的潜力^[16-17]。研究表明PCL-PEG-PCL是一种良好的组织工程支架材料^[18-19]。目前没有将PCL-PEG-PCL制成电纺静电纺丝支架并用于骨组织工程的报道。课题旨在研究PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的表面形貌及相应理化性能，以及与骨髓间充质干细胞的相互作用，探讨PCL-PEG-PCL静电纺丝支架是否是一种适合应用于骨组织工程的支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2018年9至10月在天津医科大学基础医学研究中心完成。

1.3 材料绿色荧光c57BL/6J小鼠由四川大学口腔国家重点实验室提供。PCL-PEG-PCL材料，由四川大学生物治疗国家重点实验室提供，见表1。

实验用主要试剂：CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；总RNA提取试剂盒(Simply P Total RNA Extraction Kit，BioFlux，杭州)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara Bio，Tokyo，Japan)；SYBR^®Premix ExTaq^TM (Perfect Real Time) kit(Takara，Japan)。

实验用主要仪器：Ucalery SS-2534H静电纺丝仪(北京永康乐业科技有限公司)；扫描电子显微镜(Inspect F50，FEI，美国)；Cam 200光学接触角测量仪(KSV Instruments，Monroe，CT，USA)；万能力学测量仪(Instron 5565，USA)；ABI7300荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；倒置相差显微镜(OLYMPUS Ⅸ710，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 静电纺丝支架的制备用静电纺丝仪来制备静电纺丝支架。将1 g高分子化合物 PCL-PEG-PCL溶解于20 mL有机溶剂中(氯仿∶二甲基甲酰胺=4∶1)，放在磁力搅拌器上60 r/min均匀搅拌12 h。待PCL-PEG-PCL完全溶解并放置一段时间后，用20 mL注射器抽取5 mL PCL-PEG-PCL有机溶液，将21-G针头放在注射泵上，针头与接收装置之间的距离为12-15 cm，在12-20 kV的高压电场中以1 mL/h的推进速度喷射出液流，当电场力大于液流的表面张力时，液流即被拉伸成纤维，收集在铝箔纸上。待得到的静电纺丝膜大小和厚度均达到实验要求时，停止静电纺丝过程，将静电纺丝膜从铝箔纸上揭下即获得PCL-PEG-PCL静电纺丝支架。

1.4.2 静电纺丝支架表面形貌和理化性能检测

支架表面形貌特征：用3%戊二醛固定PCL-PEG-PCL静电纺丝支架样品，分别按照体积分数50%，70%，90%，100% 乙醇梯度进行脱水，每次10 min，干燥，将样本用六甲基二硅醚处理后放入通风橱中风干，表面喷金镀膜后进行扫描电镜观察。观察PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的纤维形态、直径、孔隙率均一性等。

亲水角检测：为了检测PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的亲水性，将去离子水滴在支架表面1 min后进行测试。在室温及65%相对湿度下，分别在6个样本上取4个不同的点，每次测试均使用5 µL去离子水，测出的角度值取平均数。

弹性模量测定：采用万能力学测量仪对PCL-PEG- PCL静电纺丝支架进行力学测试。将PCL-PEG-PCL静电纺丝支架裁剪成10.0 mm×5.0 mm×0.7 mm大小，固定于万能力学测量仪上，采用50 N恒定拉伸作用力对样品进行拉伸直到样品断裂。重复6次后获得支架的应力-应变曲线、弹性模量、拉伸强度及伸长率等参数。

1.4.3 细胞行为学检测动物实验经四川大学华西口腔医学院伦理委员会批准(SKLODLL2013A173)。

骨髓间充质干细胞的提取及培养：采用全骨髓法从2周龄绿色荧光小鼠分离出骨髓间充质干细胞。称小鼠质量， 10 g/L戊巴比妥钠腹腔过量注射麻醉，乙醇消毒，分离出股骨和胫骨，去除干骺端，然后用含有体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM(L-DMEM)反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞悬液置于培养皿中，按照常规培养方法在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。48 h后更换半数培养基，72 h后更换全部培养基，细胞在培养器皿中分裂增殖至80%-90%时，用细胞胰蛋白酶消化和传代培养。传代2次后可获得纯化的骨髓间充质干细胞。成骨诱导培养鉴定为间充质干细胞。

细胞在PCL-PEG-PCL静电纺丝支架上的形态：将裁剪好的PCL-PEG-PCL静电纺丝支架放入96孔板孔内，紫外光下照射1 h以达到消毒灭菌的目的。将骨髓间充质干细胞消化离心，按照8×10⁷ L^-1的细胞浓度重悬于含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基中。吸取250 µL混悬液，滴入装有静电纺丝支架的96孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的孵箱中培养5 d，显微镜下观察骨髓间充质干细胞在静电纺丝支架上的形态；并取出静电纺丝支架样本，PBS漂洗2次，3%戊二醛溶液固定1 h，再分别按照体积分数50%，70%，90%，100%梯度乙醇脱水，每次10 min，然后将样本用六甲基二硅醚处理后放入通风橱中风干，表面喷金镀膜后进行扫描电镜观察。

细胞增殖实验：将裁剪好的PCL-PEG-PCL静电纺丝支架放入96孔板孔内，紫外光下照射1 h以达到消毒灭菌的目的。将骨髓间充质干细胞消化离心后，重悬于含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基中，后以每孔(5-8)×10⁴的密度接种到含有(实验组)或不含(对照组)静电纺丝支架的96孔板孔中，细胞接种1，3，5 d后，将10 µL CCK-8溶液加入到96孔板中，放到37 ℃孵箱中孵育1-4 h后可形成水溶性晶体，随后可使用多功能酶标仪来测定450 nm处的吸光度值，以明确细胞在静电纺丝支架上的增殖情况及支架是否具有细胞毒性。

1.4.4 Real-time PCR检测成骨基因表达将骨髓间充质干细胞接种到含(实验组)或不含(对照组)PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的6孔板上，成骨诱导1，5，14 d后，提取不同组别细胞的总RNA，经反转录后进行实时荧光定量PCR反应，按照表2检测Runx2和骨桥蛋白的表达水平。使用RNA提取试剂盒Simply P Total RNA Extraction kit提取总RNA，提取的RNA一部分经分装标记后于-20 ℃保存，其余部分立即进行反转录步骤；cDNA的合成反应使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒来进行；Real-time PCR反应利用SYBR^® Premix ExTaq^TM(Perfect Real Time)kit来完成。所有操作步骤严格按照试剂盒使用说明书完成。

1.5 主要观察指标 PCL-PEG-PCL静电纺丝支架的表面形貌、理化性能、细胞相容性及成骨性能。

1.6 统计学分析使用SPSS 19.0(SPSS，USA)软件对数据进行整理分析。数据结果采用x(_)±s的形式表示，使用Student’s t 检验及单因素方差分析对数据进行统计分析，显著性水准α=0.05，P < 0.05时差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

对于骨组织工程而言，所面临的挑战不仅在于支架材料的设计及如何制备具有高重复率的三维支架，还应在一定时间内保持其在受力条件下的功能。骨组织工程三维支架为骨缺损修复提供了新的思路和方法^[20]。干细胞因其具有自我更新和多向分化潜能而被称为干细胞。骨髓间充质干细胞是Friedenstein于1968年首次从骨髓中发现并报道的^[21]，此后研究人员逐渐从身体的许多其他组织和器官中分离培养间充质干细胞。已有研究证实，间充质干细胞不仅可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱等中胚层细胞，而且可在不同诱导条件下分化为外胚层神经元、胶质细胞、皮肤细胞、内皮血管内皮细胞、肝、肾等组织细胞，其在组织工程中的应用前景非常广阔^[22]。

人体组织和器官具有不同的性质，因此在组织重建中对材料的要求也不同，这就要求材料提供不同的力学性能、强度、亲水性或疏水性、层状结构、精细的黏附性、孔隙率等。静电纺丝技术是组织工程中一种非常有前途的方法^[23]。Zhang等^[18]报道证实PCL-PEG-PCL静电纺丝支架具有生物降解率高、两亲性和生物相容性等特点，在形成细胞-支架复合物方面具有广阔的应用前景。因此，此次实验利用静电纺丝技术成功地制备了PCL-PEG-PCL静电纺丝支架。

实验检测了PCL-PEG-PCL静电纺丝支架表面形貌和理化特征，并观察了骨髓间充质干细胞在支架上的细胞形态与增殖，发现PCL-PEG-PCL静电纺丝支架是由多条纤维交织而成的，有大量孔隙及细胞接触面积，并且具有良好的机械性能；细胞实验结果表明PCL-PEG-PCL静电纺丝支架有于细胞的黏附和增殖，具有良好的生物相容性和生物安全性。

以往研究表明在成骨诱导液下，支架上的人羊水干细胞可向成骨向分化^[24]。RUNX2是在骨骼发育过程中向成熟成骨细胞分化的关键转录因子^[25]，骨桥蛋白主要在分化后期的成骨细胞中表达，其在矿化过程中也有一定作用^[26-27]。实验将骨髓间充质干细胞接种在PCL-PEG-PCL静电纺丝支架上，然后进行成骨诱导培养，随后提取其mRNA进行荧光定量PCR检测，发现PCL-PEG-PCL静电纺丝支架能够促进骨髓间充质干细胞中RUNX2和骨桥蛋白的表达，具有良好的骨诱导能力。推测可能跟以下2方面有关系：PCL-PEG-PCL支架材料的组成成分有利于细胞在成骨诱导液向成骨分化；静电纺丝支架有多条纤维交织而成，有大量的孔隙，细胞跟支架的接触面积增大，有利于细胞的黏附和增殖。

研究成功制备了PCL-PEG-PCL静电纺丝支架，并对其理化性能、生物学性能及成骨性能进行检测，证实PCL-PEG-PCL静电纺丝支架具有高的表面积及孔隙率，能够促进细胞的黏附和增殖，且其能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，说明PCL-PEG-PCL静电纺丝支架有良好的理化性能、生物相容性、生物安全性和良好的成骨诱导性能，是一种具有良好潜能的骨组织工程支架。接下来打算在动物实验中使用PCL-PEG-PCL静电纺丝支架进行骨修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨组织工程中应用的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯静电纺丝支架

Application of electrospun polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone fiber scaffolds in bone tissue engineering

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[10]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[11]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[12]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[13]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[14]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[15]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.