丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (38): 5650-5656.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.004

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丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性

范纯泉¹，叶晓健²

¹解放军第175医院/厦门大学附属东南医院，全军骨科中心，福建省漳州市 363000；²解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200001

收稿日期:2016-07-05 出版日期:2016-09-16 发布日期:2016-09-16
通讯作者: 叶晓健，博士，主任医师，教授，博士生导师，解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200001
作者简介:范纯泉，男，1980年生，福建省永安市人，汉族，2010年解放军第二军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱外科及骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81472071)；军队医学科技青年培育计划(15QNP022)；南京军区医学科技创新课题面上项目(15MS109)

Biological safety of silk fibroin/nano-hydroxyapatite composites

Fan Chun-quan¹, Ye Xiao-jian²

¹Orthopedics Center of PLA, the 175^th Hospital of PLA/Dongnan Hospital of Xiamen University, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China; ²Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200001, China

Received:2016-07-05 Online:2016-09-16 Published:2016-09-16
Contact: Ye Xiao-jian, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200001, China
About author:Fan Chun-quan, M.D., Attending physician, Orthopedics Center of PLA, the 175th Hospital of PLA/Dongnan Hospital of Xiamen University, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472071; the Medical Incubation Program for the Youth in PLA, No. 15QNP022; the Medical Innovation Project of the Nanjing Military Region of Chinese PLA, No. 15MS109

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
丝素蛋白：是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量占蚕丝的70%-80%，含有18种氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占总组成的80%以上。丝素蛋白具有良好的机械性能和理化性质。
生物材料的安全性：是指生物材料与人体之间相互作用下必须对人体无毒性、无致敏性，无刺激性，无遗传毒性，无致癌性，对人体组织、血液、免疫系统无不良反应。

背景：丝素蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、优越的力学性能，与纳米羟基磷灰石的复合可以模拟天然骨组织中的有机无机成分，可以弥补单纯纳米羟基磷灰石力学性能的不足。
目的：评价丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性。
方法：以氯化钙和磷酸氢二铵为原料，丝素蛋白作为调控纳米羟基磷灰石晶体生长的模板，通过共沉淀法合成了丝素蛋白/纳米羟基磷灰石类骨质复合材料。按照国际标准化组织(ISO10993)和国内(GB/T 16886)对于生物材料相容性的检测方法和要求，通过体外细胞毒性、全身急性毒性实验、溶血实验来评价丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性。
结果与结论：①丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液与L929细胞共培养后对细胞的形态、代谢及增殖无影响；②丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液腹腔注射到小白鼠体内，对小白鼠无明显不良反应；③丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液导致的静脉血溶血率为2.39%，小于5%的国际标准；④结果提示，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料无细胞毒性，无全身急性毒性反应，不引起溶血反应，具有良好的生物安全性。

ORCID: 0000-0001-5313-3796(范纯泉)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 丝素蛋白, 纳米羟基磷灰石, 组织工程, 生物安全性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Silk fibroin has excellent biocompatibility, biodegradability and unique mechanical properties. Its composite, silk fibroin/nano-hydroxyapatite, can simulate the composition and structure of nature bone tissue, contributing to remedying the insufficient mechanical properties of nano-hydroxyapatites.
OBJECTIVE: To observe the biological safety of silk fibroin/nano-hydroxyapatite composites.
METHODS: Silk fibroin/nano-hydroxyapetite composite biomaterial was synthesized by the coprecipitation method using silk fibroin, calcium chloride and diammonium phosphate as raw materials. According to the demands of International Standard Organization (ISO10993) and Technical Evaluation Standards of Biomedical Materials and Medical Instruments promulgated by Chinese Board of Health (GB/T 16886), experiments of cell toxicity in vitro, acute toxicity and hemolysis were investigated to evaluate the biocompatibility of silk fibroin/nano-hydroxyapetite composite.
RESULTS AND CONCLUSION: L929 cells co-cultured with silk fibroin/nano-hydroxyapatite composite leaching liquor had good cell morphology, metabolism and proliferation. The leaching extract of silk fibroin/nano-hydroxyapatite composite injected into mice intraperitoneally had no significant adverse reactions. And silk fibroin/nano-hydroxyapatite composite extracts caused 2.39% blood hemolysis, less than the international standards 5%. These experimental results on cell toxicity test in vitro, acute toxicity and hemolysis met the demands of ISO10993 and GB/T, which show the biological safety of the silk fibroin/nano-hydroxyapatite composite for clinical application.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Silk, Nanocomposites, Hydroxyapatites, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

范纯泉，叶晓健. 丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5650-5656.

Fan Chun-quan, Ye Xiao-jian.

Biological safety of silk fibroin/nano-hydroxyapatite composites

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5650-5656.

图/表（结果） 7

2.1 材料的细胞毒性实验结果

2.1.1 MTT法测定材料浸提液对细胞相对增殖率的影响及细胞毒性结果表明，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料细胞毒性为0级，无细胞毒性；0.64%苯酚液毒性级别在2 d时为Ⅲ级，在4，6 d均为Ⅳ级。丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液组与聚乙烯浸提液阴性对照组在同一时间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液组与0.64%苯酚阳性对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)；聚乙烯组与0.64%苯酚组之间差异也有显著性意义(P < 0.01)。见表4-6及图1。

2.1.2 L929细胞与不同材料接触后的细胞黏附情况及形态学变化在丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液组和阴性聚乙烯浸提液组细胞培养8 h后可以看见细胞形态基本正常，呈梭形或不规则三角形，细胞开始贴壁生长，随着时间延长，细胞数目增多，细胞突起伸展，出现分裂细胞。0.64%苯酚液阳性组在培养24 h时可见少量椭圆形细胞贴壁，大多数细胞悬浮。

培养3 d时可见丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液组(图2A)和聚乙烯浸提液组(图2B)细胞形态呈梭形或不规则三角形，细胞贴壁生长良好，排列密集规则，可见分裂细胞。培养3 d时在0.64%苯酚液组出现大部分细胞圆缩(图2C)，死亡细胞明显增多，细胞基本不贴壁。因此通过细胞形态学观察，可以判定，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液组和聚乙烯组浸提液无细胞毒性，0.64%苯酚液组具有重度细胞毒性。

2.2 急性全身毒性实验结果丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料组和生理盐水组小鼠从腹腔注射到72 h的整个观察期内无死亡，无惊厥、瘫痪、呼吸抑制、腹泻运动减少和体质量下降，一般状况良好，活动、进食、排便正常；0.64%苯酚腹腔注射组0-1 h死亡1只，4-6 h死亡1只，第6-8小时死亡2只。注射后多数动物表现为腹肌紧张，腹泻和运动减少，1只动物注射后3 h出现发绀和震颤，11 h死亡。各组体质量变化情况见表7。

在表7中，在同一时间不同组之间采用t 检验进行统计学分析，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料与生理盐水组差异无显著性意义(P > 0.05)；丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料、生理盐水组与0.64%苯酚组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。按照毒性分级，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料属于无毒级。

2.3 溶血实验结果经计算丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料的溶血率为2.39%，根据卫生部(GB/T 16886系列标准)中的评价标准，国家非直接接触血液的医用生物材料的溶血率须小于5%的标准，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料符合溶血实验要求。见表8。

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引言

人体骨组织是由有机和无机成分构成的生物矿化组织，其有机成分主要是骨胶原纤维束，作为骨的网络支架，提供了弹性和韧性；无机成分主要是纳米羟基磷灰石结晶，决定了骨骼的硬度和强度^[1-2]。目前，依据仿生学原理，制备有机无机复合的人工骨材料成为研究的热点^[3-5]。Ⅰ型胶原是天然骨组织中含量最多的有机基质，因此具有作为人工骨材料成分的天然优势，但是，由于目前胶原蛋白提纯工艺的不足以及动物组织来源的胶原蛋白存在过敏反应的可能性^[6]，因此利用胶原以外的有机基质作为骨组织工程中的支架也引起了广泛的兴趣^[7-9]。

丝素蛋白是蚕丝的主要成分，具有与胶原蛋白类似的生物活性和氨基酸组成，研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性、细胞吸附性、体内可降解性，可作为细胞培养基，具备织造工程支架材料的基本条件^[10-13]，同时它与胶原蛋白相比，丝素蛋白对细胞的黏附、扩展、分化和生长的作用与胶原蛋白相似，但是丝素蛋白在体内引起的炎症反应要小于胶原蛋白^[14]，同时，丝素蛋白提取方法简便，成本低廉，目前已经逐渐成为替代胶原蛋白作为骨支架材料的选择^[9，15-23]。

课题组在前期研究中，通过共沉淀的方法，定向诱导纳米羟基磷灰石晶体在丝素蛋白模板上生长，制备了组成和结构上均与天然骨组织结构类似的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料^[24]。作为体内植入的可吸收性生物医用材料，必须对人体无毒性、无刺激性、无抗原性、无遗传毒性和致癌性，与组织、细胞接触无任何不良反应^[21]。因此，材料的生物安全性是生物医用材料研究设计中首先考虑的重要问题。在文章中，进一步通过体外细胞毒性、全身急性毒性试验、溶血试验来评价该复合材料的生物安全性，为其将来应用于骨科临床奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年1月至2016年1月在解放军第二军医大学长征医院动物实验中心SPF1实验室完成。

1.3 材料丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料由本实验室仿生合成；小鼠成纤维细胞(L929)细胞株(中科院上海细胞生物学研究所)；健康成人志愿者新鲜静脉血；高糖DMEM培养液(Gibco，美国)；胎牛血清(TBD，美国)；二甲基亚砜(Sigma，美国)；噻唑蓝(MTT)(Sigma，美国)；聚乙烯(上海思吉生物公司)；聚氯乙稀(上海思吉生物公司)；0.64%苯酚溶液(上海思吉生物公司)；0.25%胰酶(Gibco，美国)。材料研磨成粉体后，在30 MPa压力下将材料制备呈厚0.5 mm，直径约1.0 mm的圆柱状，环氧乙烷消毒，备用。

实验动物：健康清洁级昆明小鼠30只，雌雄不限，一月龄，体质量250-300 g，由上海交通大学农学院动物繁育实验场提供。

1.4 方法

1.4.1 材料浸提液制备及实验分组将6 g灭菌处理过的丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料溶于30 mL DMEM溶液中，按ISO 10993(GB/T 16886) 标准不规则生物材料浸提液试样表面积和浸提介质比例标准制作浸提液，于37 ℃孵箱中浸提72 h，200目滤器除菌及杂质，4 ℃保存备用。以同样的方法制备聚乙烯浸提液作为阴性对照，灭菌的0.64%苯酚溶液为阳性对照，正常DMEM培养液作为正常对照。

1.4.2 体外细胞毒性实验

细胞培养：用DMEM培养液在50 mL培养瓶中培养L929细胞，待细胞长成单层后传代。弃去培养液，加入37 ℃预温的pH值在7.8左右的0.25%胰酶消化液，于 37 ℃消化2.0-3.0 min。弃去消化液，加入少量DMEM培养液反复吹打，使细胞分散均匀，制成浓度为6×10⁷ L^-1的细胞悬液，移于96孔细胞培养板和6孔细胞培养板。

MTT法检测细胞活性：将浓度为6×10⁷ L^-1的细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 μL，在37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度条件下培养24 h。 24 h后弃去原培养基，用PBS洗涤2次，分别加入100 μL的100%丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液、聚乙烯浸提液和0.64%的苯酚溶液，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度条件下培养，3 d更换1次培养液。在培养2，4，6 d分别弃去培养液，每孔加入MTT溶液(5 g/L)10 μL， 37 ℃孵育4 h后每孔加入100 μL 二甲基亚砜终止培养，600 r/min振荡10 min，用酶标仪在570 nm测定吸光度(A)值，计算相对增殖率，相对增殖率=(试样A均值/阴性对照组A均值)×100%，根据各组相对增殖率值采用5分制法进行细胞毒性分级(表1)，观察材料作用的剂量效应。

细胞形态学观察：分别取无菌的丝素蛋白纳米羟基磷灰石浸提液、聚乙烯浸提液、0.64%苯酚溶液和正常DMEM培养液3 mL置于6孔细胞培养板中，每个培养皿中加入浓度为6×10⁷ L^-1的细胞悬液3 mL，37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养，分别在培养1，2，3 d后用倒置相差显微镜观察细胞形态黏附生长情况以及形态变化进行细胞毒性判定，毒性判定分级标准见表2。

1.4.3 急性全身毒性实验将30只体质量25-30 g的小鼠按随机数字表法分为3组，每组10只。实验组用浓度为200 g/L的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料按 50 mg/kg剂量进行小鼠腹腔内注射，阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组用0.64%苯酚溶液，常规饲养。观察注射后动物的活动及一般情况，在注射后24，48，72 h分别称取动物体质量的变化，观察动物的一般状态、毒性反应和死亡动物数量。材料的毒性分级见表3。结果判断：72 h内实验组反应不大于对照组为符合要求；实验组中40%死亡，或60%出现明显毒性反应，或动物普遍出现进行性体质量下降为不符合要求。

1.4.4 溶血实验^[25] 分别以丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液、聚乙烯浸提液、聚氯乙稀溶液作为实验组、阴性对照组、阳性对照组，取健康成人志愿者新鲜采集的静脉血4 mL加入生理盐水5 mL稀释，在含有 10 mL材料溶液的试管内加入稀释后的新鲜静脉血 0.2 mL，37 ℃水浴60 min，每组均为5只试管，2 000 r/min离心5 min，取上清液，加入0.1%Na₂CO₃溶液4 mL，用分光光度计测量540 nm的吸光度值(A)。溶血率计算方法：溶血率=(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100%。Dt为实验组A值，Dnc为阴性对照组A值，Dpc为阳性对照组A值。

结果评定：阴性管<0.03，阳性管A为0.8±0.30有效；实验组溶血率<5%则说明材料符合医用材料的溶血实验要求，若溶血率> 5%，则预示材料有溶血作用。

1.5 主要观察指标 ①浸提液与L929细胞共培养2，4，6 d后，均由第一作者采用MTT法计算细胞相对增殖率，采用5分制法进行细胞毒性分级，观察材料作用的剂量效应；②浸提液与血细胞在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养，培养1，2，3 d后由第一作者采用倒置相差显微镜观察细胞形态黏附生长情况以及形态变化进行细胞毒性判定；③将浸提液按50 mg/kg剂量进行小鼠腹腔内注射，阴性对照组为生理盐水，阳性对照组用0.64%苯酚溶液，常规饲养，观察注射后动物的活动及一般情况，在注射后24，48，72 h分别称取动物体质量的变化，观察动物的一般状态、毒性反应和死亡动物数量。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料用x(_)±s表示，采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

对于预期应用于人体的材料(天然或人工合成的)或器械在进入临床前都要先进行安全性评价，评价的意义即在于预测生物材料或医疗器械在与人体接触过程中的潜在危害性，保证临床应用的安全性^[26]，具体要求为：①无毒；②无热源，无致癌性，不致畸；③对周围组织无刺激性，不干扰机体的免疫机制，不引起免疫排斥反应；④植入组织后不引起溶血、凝血反应，不破坏和改变血液成分。对生物材料的生物安全性评价方法主要有两类：一是动物体内实验，即将材料植入体内，分阶段将植入体与周围组织取出，做组织学检查，观察材料及周围组织病理变迁，评价组织相容性；另一类为体外实验，即观察材料或材料浸提液对组织细胞生长、代谢及增殖的影响。有学者认为，在区别生物材料的毒性及对细胞影响方面，体外实验较体内植入更敏感。

因此，课题根据IS0 10993系列标准及GB/T 16886系列标准的相关要求，对于仿生制备的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料进行体外细胞毒性实验、急性毒性实验和溶血实验，对所制备的复合材料的生物安全性作出综合性评价和分析。

体外细胞毒性实验是初级急性毒性筛选的一个重要方面，是简便、敏感性高、节省经费、缩短生物材料研究周期、重复性好的检测材料生物相容性方法，也是当前国际上评价生物材料细胞毒性和安全性的标准方法。其可不受动物体内环境变化等因素的影响，规范控制实验条件，在评价材料生物相容性方面的地位已经得到公认。材料细胞毒性实验主要是通过将可降解生物材料浸提液进行细胞培养，观察从材料中浸出的物质对细胞的生长、代谢和繁殖的影响，检测生物材料细胞毒性国际上最常用的细胞是L929细胞。该细胞于1948年由Earle等从小鼠皮下组织中分离出的成纤维细胞。由于这种细胞具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点，1982年美国质量标准协会将L929细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞^[27]。在课题这部分研究中，分别将丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液、聚乙烯浸提液与L929细胞共培养，结果表明前两种材料浸提液培养的细胞与常规细胞培养液培养的细胞在细胞形态、细胞生长倍增时间均无明显差异，提示仿生合成的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料无细胞毒性。

材料的细胞毒性研究，目前最常用的是MTT法，此法最早是1983年由Mosmann^[28]提出的，MTT法是通过培养液或实验材料对细胞代谢水平影响来间接反映培养液或材料细胞毒性的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使黄色的噻唑蓝还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，将结晶颗粒用二甲基亚砜等溶剂溶解，通过酶联检测仪测定其A值，可间接反映活细胞的数量及其活性。通过材料和标准对照的A值计算细胞相对增殖率或者存活率从而判定细胞的生物活性。该方法简便、经济、敏感性高，能客观地反映出被测试材料对细胞的毒性损害程度，无需特殊设备，操作简便。在课题中，实验结果证实丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液和聚乙烯浸提液对细胞的代谢和增殖无不良影响，而0.64%苯酚溶液对细胞的增殖和生长具有重度毒性。急性全身毒性实验主要用于评价材料短期内对生物体的毒性作用。观察24 h内一次或多次大剂量给予机体药物后对机体全身代谢和生存造成的毒性反应，从而评价生物材料或药物对生物体的急性毒性作用。全身毒性实验最常用的给药方法是采用腹腔注射或者静脉注射，注射后观察动物的反应。此次实验将无菌材料浸提液直接注入到小白鼠腹腔内，观察材料浸提液对腹腔脏器的刺激以及经腹膜吸收后的毒性反应，从而判定材料的急性全身毒性反应。此次实验中丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液和生理盐水组动物生长、进食、排泄均正常，无明显不良反应，在观察期间动物体质量增加，体质量变化2组差异无显著性意义(P > 0.05)，而阳性对照组动物死亡，且体质量明显减轻，体质量变化与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结果提示丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料的急性全身毒性实验阴性。

溶血试验具有快速、经济的有点，常作为生物材料血液相容性的初步筛选实验。该实验目的是通过试样在体外与血液直接接触，测定红细胞释放的血红蛋白量来评价材料是否对红细胞的功能和代谢造成不良影响。目前对溶血实验尚未明确的标准，国内主要参考国家标准《医疗器械生物学评价第1部分：试验选择指南》(GB/ T16886-4标准医用生物材料与血液相互作用)。医用生物材料与血液相互作用，使各自的功能和性质受到影响，具有优良血液相容性的医用生物材料对血液或血液成分的功能和性质影响在适当的范围内，主要表现在：①黏附血小板较少，不激活血小板，不发生血栓；②不激活凝血系统，促进凝血时间缩短；③无溶血作用；④不对其他血液成分产生不利的影响。文章中丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料浸提液的体外溶血率为2.39%，小于5%的国际标准，提示本材料无明显溶血反应，可满足医用生物材料的应用要求。

根据医疗器械生物学评价国际标准化组织ISO10993-1992和国内GB/T16886.1-1997标准并参照1994年《生物材料和制品的生物学评价标准》对仿生制备的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料进行了生物安全性评价，证明复合材料丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无细胞毒性，无全身急性毒性反应，不引起溶血反应，具有理想的生物安全性，为进一步的应用研究提供了必要条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性

Biological safety of silk fibroin/nano-hydroxyapatite composites

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