骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的体内成骨

doi:10.12307/2021.233

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5420-5426.doi: 10.12307/2021.233

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的体内成骨

刘小元1，2，李蕾1，2，张凯1，2，李君1，2，韩祥祯1，2，何惠宇1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2020-07-27 修回日期:2020-07-29 接受日期:2020-09-15 出版日期:2021-12-08 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 何惠宇，博士，教授，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复科·新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:刘小元，1993年生，甘肃省陇南市人，汉族，在读硕士，医师，主要从事口腔修复及组织工程骨研究
基金资助:
新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2018E02060)，项目负责人：何惠宇

Osteogenesis using bone marrow mesenchymal stem cell sheets combined with three-dimensional printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold in vivo

Liu Xiaoyuan1, 2, Li Lei1, 2, Zhang Kai1, 2, Li Jun1, 2, Han Xiangzhen1, 2, He Huiyu1, 2

1Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-07-27 Revised:2020-07-29 Accepted:2020-09-15 Online:2021-12-08 Published:2021-07-26
Contact: He Huiyu, MD, Professor, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Liu Xiaoyuan, Master candidate, physician, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Xinjiang Uygur Autonomous Region Science and Technology Support Project, No. 2018E02060 (to HHY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞膜片技术：体外将高密度的骨髓间充质干细胞接种在大小合适的培养皿上，加入成膜诱导液，连续诱导培养成高密度细胞，使其复层生长，形成一张由细胞和细胞外基质构成的膜片，这种采用非酶解的方式获取膜片，避免了胰酶消化对细胞造成的损伤。
极限骨缺损：确定的研究时间内颌骨缺损不可能自行愈合的颌骨最小缺损，骨缺损应大于实验动物颌骨自行愈合修复的能力，才能真实地反映修复材料等对骨缺损的修复效果。
背景：马鹿角粉是一种生物相容性及机械性能良好的组织工程骨材料。采用细胞膜片技术、3D打印技术构建组织工程骨，可实现极限骨缺损的个性化治疗。
目的：探讨骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇骨支架修复羊下颌骨极限缺损的能力及成骨效果。
方法：全骨髓法培养羊骨髓间充质干细胞，采用细胞膜片技术及3D打印技术构建骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的组织工程骨。取12只新疆阿勒泰大尾羊，随机分为术后1，2，3个月组，每组4只，于双侧下颌骨制备20 mm×3 mm×5 mm骨缺损，每组2只羊一侧植入细胞膜片复合3D打印鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架，另一侧植入细胞膜片复合明胶海绵，每组另外2只羊，一侧植入细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇支架，另一侧植入细胞膜片复合明胶海绵。植入1，2，3个月末处死实验动物，取下颌骨标本进行大体观察、锥形束CT、组织学观察及RT-PCR检测相关成骨指标。
结果与结论：①锥形束CT观察：第1，2个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区呈稀薄云雾状，支架吸收较多，细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组吸收相对较少；第3个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组有大量的新骨形成，密度接近周围骨质，但细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区未长满，骨密度较低。细胞膜片复合明胶海绵组3个月内变化均不明显，均没有新骨生成；②组织学观察：第3个月末，与其他两组相比，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架材料吸收较多，可见骨小梁排列规则及成熟板状骨，细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组也有少量新骨形成，细胞膜片复合明胶海绵组3个月内变化均不明显；③RT-PCR检测：细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平均高于其他两组，在第3个月时成骨基因的表达量达到最高；④结果表明，骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的组织工程骨能够修复羊下颌骨极限骨缺损，可满足羊颌骨实验性缺损的修复重建。

https://orcid.org/0000-0003-1918-579X (何惠宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 细胞膜片, 3D打印, 马鹿角粉, 丝素蛋白, 聚乙烯醇, 极限骨缺损, 羊

Abstract: BACKGROUND: Cervus elaphus antler powder is a bone tissue engineering material with good biocompatibility and mechanical properties. The use of cell patch technology and three-dimensional (3D) printing technology to build tissue engineered bone can accomplish individualized treatment of limit bone defects.
OBJECTIVE: To explore the ability and osteogenesis effect of bone marrow mesenchymal stem cell sheet combined with 3D printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol bone scaffold to repair the limit defect of sheep mandible.
METHODS: The whole bone marrow method was used to cultivate sheep bone marrow mesenchymal stem cells, and the cell sheets technology and 3D printing technology were used to construct the bone marrow mesenchymal stem cell sheets combined with 3D printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold tissue engineered bone. Totally 12 Xinjiang Altay big-tail sheep were randomly divided into 1-, 2-, and 3-month groups (n=4 per group). An experimental bone defect area of 20 mm×3 mm×5 mm was prepared in the bilateral mandible edentulous area. Two sheep in each group were implanted with cell membrane combined with 3D printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold. Cell sheets combined with gelatin sponge was implanted on the other side. The other two sheep was composited with nano-hydroxyapatite/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold, and the other side was implanted with cell sheets combined with gelatin sponge. The experimental animals were sacrificed at the end of 1, 2, and 3 months after implantation, and the mandible specimens were taken for gross observation, cone beam CT, histological observation, and RT-PCR to detect related osteogenic indicators.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cone beam CT: At the end of the 1st and 2nd months, the bone defect area in the cell sheets compounded with Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol group was thin and cloudy; the scaffold absorbed more. The absorption of the cell sheets compounded with nano-hydroxyapatite/silk fibroin/polyvinyl alcohol group was relatively low. At the end of the 3rd month, a large amount of new bone was formed in the cell sheets composite Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol group, and the density was close to the surrounding bone; however, the bone defect area in the composite nano-hydroxyapatite/silk fibroin/polyvinyl alcohol group was not overgrown and the bone density was lower. The cell sheets composite gelatin sponge group did not change significantly within 3 months, and there was no new bone formation. (2) Histological observation: At the end of the 3rd month, compared with the other two groups, the scaffold material of the cell sheets composite Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol group was more absorbed, showing the regular arrangement of bone trabeculae and mature plate-like bone. There was also a small amount of new bone formation in the composite nano-hydroxyapatite/silk fibroin/polyvinyl alcohol group, and the cell sheets composite gelatin sponge group did not change significantly within 3 months. (3) RT-PCR: The mRNA expression levels of osteopontin, osteocalcin and type I collagen were higher than those of the other two groups in the cell sheets composite Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol group, and the expression of osteogenic genes reached the highest level at the third month. (4) The results show that the bone marrow mesenchymal stem cell sheets combined with 3D printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold tissue engineered bone can repair the limit bone defect of the sheep mandible, and can meet the repair and reconstruction of the experimental sheep jaw defect.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, cell sheets, 3D printing, Cervus elaphus antler powder, silk fibroin, polyvinyl alcohol, limit bone defect, sheep

中图分类号:

刘小元, 李蕾, 张凯, 李君, 韩祥祯, 何惠宇. 骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的体内成骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5420-5426.

Liu Xiaoyuan, Li Lei, Zhang Kai, Li Jun, Han Xiangzhen He Huiyu. Osteogenesis using bone marrow mesenchymal stem cell sheets combined with three-dimensional printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold in vivo[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5420-5426.

图/表（结果） 5

2.1 羊骨髓间充质干细胞的分离培养、传代及鉴定结果全骨髓法培养羊原代骨髓间充质干细胞，倒置相差显微镜观察原代细胞的大体形态，见图3A，可见梭形、三角形、多边形的细胞散在贴壁。传代后细胞的基本形态均为长梭形，部分细胞边缘可见突起，见图3B，2C。第2代羊骨髓间充质干细胞表面CD44标志物表达呈阳性，阴性对照组细胞未见阳性。

2.2 羊骨髓间充质干细胞膜片的形态结构第3代骨髓间充质干细胞高密度接种至培养皿，隔天更换培养液，当细胞密度达到约90%时，细胞形态比第1，2代细胞体积较大，分泌的细胞外基质较多，但仍可见贴壁细胞之间的间隙，见图4A。加入细胞膜片诱导液连续诱导5-7 d，可见培养皿中间区域细胞密度增加，细胞复层生长，密度达100%，细胞外基质分泌显著增加，细胞之间的间隙充满了基质，细胞的体积相对变小，见图4B，培养皿边缘可见细胞不同程度的皱缩，见图4C；丢弃培养皿中的完全培养基，大体可见培养皿底壁有一层白色薄膜，见图4D。

2.3 一般情况将组织工程骨植入颌骨缺损区，30 min后羊苏醒，能够平稳行走，3 h后术区稍肿胀，未见明显出血，术后1周术区切口愈合良好、未见裂开、进食及排便正常。整个实验过程中，12只动物无死亡，均进入最后的结果分析。
2.4 锥形束CT结果植入第1个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区呈稀薄云雾状，支架吸收较多、未见明显钙化新骨生成，细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架吸收较少，3组之间均未见新骨形成；植入第2个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组、细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区密度较第1个月增高，能观察到不同密度的新骨生成，但细胞膜片复合明胶海绵组仍未见新骨形成；植入第3个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区有大量的新骨形成，密度接近周围骨质，但细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨缺损区未长满新骨，骨密度较低，而细胞膜片复合明胶海绵组3个月内均变化不明显，见图5。

2.5 组织工程骨植入后不同时间点苏木精-伊红染色组织学观察植入第1个月末，2种骨支架开始吸收，可见少量成骨细胞及新生低密度类骨质形成，有纤维组织长入支架内，而细胞膜片复合明胶海绵组仅有大量的纤维形成。植入第2个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架材料吸收较少，但成骨细胞成骨活跃，较其他两组可见较多新生毛细血管及较规则排列骨小梁形成，有大量纤维组织长入支架内；植入第3个月末，与其他两组相比，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架材料吸收较多，可见骨小梁排列规则，毛细血管丰富，大片成熟板状骨；细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组也有少量的新骨形成，并与大量的纤维长入骨内，且第1，2，3个月末细胞膜片复合明胶海绵组均未见明显变化，见图6。

2.6 实时荧光定量PCR检测相关成骨基因mRNA表达水平在各个时间点，成骨相关基因表达量两两组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平均高于其他两组，在第3个月末时成骨基因的表达量最高，而细胞膜片复合明胶海绵组在第1，2，3个月末成骨基因的表达均不太明显(P > 0.05)，见图7。

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引言

颌骨极限缺损一直是口腔临床常见的问题，通常是由创伤、感染、癌症等原因引起[1]。如颌骨缺损未达到极限骨缺损时可自愈[2]，超越极限骨缺损则很难自愈。现阶段，对极限骨缺损的治疗方式主要为自体骨[3]、异体骨及人工骨移植等方式[4-5]，但自体骨移植受供体区域的限制、异体骨及人工骨移植经常会引起受体严重的免疫排斥反应。研究表明，由多孔性网状支架、种子细胞及细胞因子构成的组织工程骨治疗极限骨缺损较其他治疗方法有更多的优点[5-7]。构建组织工程骨的核心要素往往取决于多孔网状支架材料-细胞复合物的选择及制备[6-7]，优异的支架材料为细胞提供黏附空间，细胞在支架材料上不断生长、繁殖，并分泌细胞外基质逐渐取代降解的生物材料，最终在极限骨缺损区形成新生骨，骨缺损区得到修复。研究表明，马鹿角经超低温粉碎研磨成粉末，3D打印马鹿角粉复合骨支架具有良好的机械力学性能及细胞相容性，可作为异种骨支架材料研究的新方向[8]，与高温煅烧相比，超低温粉碎研磨保留了鹿角中促进成骨的鹿茸多肽等细胞因子。马鹿角粉是一种天然的骨质材料，较其他无机材料具备较好的生物相容性[9]，因其来源广泛，可避免因屠杀动物涉及的伦理问题，可作为异种骨支架材料的大量原材料。丝素蛋白是一种天然高分子纤维蛋白[10]，含有18种氨基酸，具有良好的生物相容性，与其他材料复合具有较高的机械强度[11]，同时聚乙烯醇以其良好的生物相容性、力学性能等因素，越来越多的研究将其用作骨组织替代材料[12]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stromal cells，BMSCs)是组织工程中应用最为广泛的种子细胞[13]，可将其在体外接种在培养皿上，连续诱导培养成高密度细胞，使其复层生长，形成一张由细胞和细胞外基质构成的膜片[14]，这种采用非酶解的方式获取膜片，避免了胰酶消化对细胞造成的损伤，提高了细胞的利用效率和膜片的可塑性。
3D打印骨组织工程支架与人体天然骨形态结构相似，可以根据骨缺损的实际情况打印出大小、形状等合适的个性化骨支架。目前仍未见到关于3D打印个性化马鹿角粉复合支架修复颌骨缺损的相关报道，所以该研究将整合马鹿角粉、生物降解型凝胶丝素蛋白和聚乙烯醇，利用3D技术制备个性化的马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组织工程骨支架，然后将骨髓间充质干细胞膜片与骨支架在体外复合构建组织工程骨，植入阿勒泰大尾羊下颌骨极限骨缺损模型内，分别在1，2，3个月处死实验动物，通过大体观察、锥形束CT影像学观察、组织学染色及实时荧光定量PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原等成骨基因的表达，探索该组织工程骨修复羊下颌骨极限骨缺损的成骨能力及效果，为组织工程骨研究领域提供一种新型的组织工程骨支架及方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验及动物实验。
1.2 时间及地点细胞培养及细胞膜片的制备于2019年3至8月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞实验室完成。动物实验及体外指标检测于2019年9月至2020年6月在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6月龄雄性新疆阿勒泰大尾羊2只，体质量(9.00±1.41) kg，用于提取、分离及培养羊骨髓间充质干细胞所用；健康成年新疆阿勒泰大尾羊12只，雌雄不拘，12月龄，体质量(30.33±2.50) kg，植入体外构建的组织工程骨，均由新疆医科大学动物实验中心提供，单独饲养于新疆医科大学动物实验中心，由专人饲养。实验过程中对动物处置严格遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[15]。
1.3.2 实验试剂及仪器马鹿角粉(特丰药业股份有限公司，新疆)；蚕茧、粒径20 nm羟基磷灰石(南京埃普瑞公司)；普通干型透析袋 MD34(索莱宝公司，北京)；聚乙烯醇(分析纯)；电子天平(Sartorius BSA124S，赛多利斯科学仪器公司，北京)；明胶海绵(新疆医科大学第一附属医院口腔修复科提供)；三维FDM打印成型机(新疆大学提供)；锥形束CT(新疆医科大学第一附属医院口腔影像科提供)；DMEM/F-12培养液(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibico，美国)；双抗、胰酶(Hyclone，美国)；陆新眠、新速醒、戊巴比妥及苏木精-伊红等染色试剂(天津化学试剂公司，中国)；固体石蜡(Leica，德国)；舒泰®50(Virbac S.A,法国)；紫色抗凝管、肝素钠、GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱(博迅，中国)；TG16-WS高速离心机(湘仪，中国)；鼠抗山羊CD44单克隆一抗、山羊抗大鼠IgG H&L(Alexa Fluor®488)预吸附二抗(Abcam，美国)；流式细胞仪(Beckman-coulter公司，美国)；RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)；引物序列(上海生物工程公司，中国)；RT-PCR仪(Bio-RAD，美国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；超净工作台(苏州净化设备厂，中国)；倒置相差显微镜及拍照系统(Lecia，德国)；CO2恒温培养箱(Thermo，美国)；RM 2235切片机(Leica公司，德国)；70 μm孔径过滤网(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 羊骨髓间充质干细胞的分离培养、传代及鉴定 6月龄雄性新疆阿勒泰大尾羊用0.05 mL/kg舒泰®50和0.05 mL/kg陆新眠肌肉注射麻醉(骨髓穿刺后用0.05 mL/kg新速醒复醒)，固定四肢，术区剃毛，常规消毒铺巾。用骨穿针于髂后上棘处抽取骨髓5 mL，吸入含肝素200 U/mL的20 mL注射器中，迅速转入紫色抗凝管充分混匀，转移至超净操作工作台用 70 μm过滤器进行过滤，采用全骨髓法培养骨髓间充质干细胞，提取骨髓至50 mL离心管，将其接种至25 mm2细胞培养瓶中，加入4 mL完全培养基(含体积分数为5%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺的DMEM/F-12培养液)，转移至37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，3 d后半量换液，7 d后全量换液，倒置显微镜观察细胞形态，然后每隔3 d换液进行常规培养，待细胞密度达到80%-90%时，PBS洗2次，加入2 mL 2.5 g/L胰蛋白酶消化约1 min，在此期间用手在瓶底轻拍打数次，倒置相差显微镜下见细胞变圆时，加2倍体积的完全培养基终止消化，吹打均匀，1 000 r/min离心5 min去除胰蛋白酶，加入完全培养基重悬细胞，按照1∶3或1∶4的比例进行传代培养，倒置相差显微镜观察细胞活力和生长情况。传代至第3代时用流式细胞仪进行鉴定或冻存至-196 ℃，以备后期膜片的制备。
流式细胞术鉴定：取第2代骨髓间充质干细胞经胰酶消化计数，避光条件下分别加入2 μL相关抗体CD44，并设立阴性对照组，于4 ℃孵育30 min，加入1 mL预冷的PBS离心洗涤2次，再加入400 μL PBS吹打混匀，上流式细胞仪鉴定。

1.4.2 羊骨髓间充质干细胞膜片的制备用0.25%胰蛋白酶消化第2代羊骨髓间充质干细胞，重悬细胞后以1.0×106/mm2的密度接种至60 mm2培养皿中，加入 DMEM/F-12完全培养基4 mL，隔天换液，待培养皿内细胞密度达90%-100%时，更换4 mL成膜诱导液(DMEM/F-12培养基+体积分数为10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+50 μmol/L抗坏血酸+1%双抗)，隔天换液，连续诱导5-7 d，倒置显微镜及大体可见培养皿边缘皱缩，表明羊骨髓间充质干细胞成膜。
1.4.3 体外构建细胞膜片复合3D打印骨支架的组织工程骨
(1)丝素蛋白溶液的制备：称取5 g蚕丝，剪碎成1 cm的碎片，放入烧杯中，加入0.02 mol/L无水碳酸钠溶液，煮沸30 min脱胶；脱胶后蚕丝用去离子水冲洗数次，挤出多余的水分，干燥过夜，然后溶解于9.3 mol/L溴化锂(蚕丝∶溴化锂=1 g∶4 mL)，60 ℃水浴4 h，不停搅拌，使蚕丝完全溶解；待溶解的蚕丝液冷却后倒入透析袋中，两端封闭，放置在去离子水中，透析48 h，每隔12 h换水透析；透析结束后，收集透析袋中的溶液，2 000 r/min离心10 min(2次)，取上清液即为丝素蛋白溶液，测其浓度为5%，4 ℃保存备用。
(2)3D打印丝素蛋白/聚乙烯醇复合支架：根据课题组之前的研究结果[8]，按照马鹿角粉、粒径20 nm 羟基磷灰石、浓度为5%丝素蛋白溶液、浓度15%聚乙烯醇凝胶的最佳配比，即丝素蛋白∶15%聚乙烯醇凝胶=1 mL∶4 mL；纳米羟基磷灰石∶(聚乙烯醇∶丝素蛋白)=1 g∶1.2 mL；鹿角粉∶(聚乙烯醇∶丝素蛋白)=1 g∶1.2 mL。应用3D FDM打印技术打印大小与羊下颌极限骨缺损相符的20 mm(长)×
3 mm(宽)×5 mm(高)个性化马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇复合骨支架，见图1A，放置在-20 ℃固定支架48 h(防止其变形)，室温保存备用，使用前必须进行高温高压灭菌后再回植体内。
(3)构建组织工程化骨：植入羊下颌骨极限骨缺损模型前30 min，利用显微镊揭起细胞膜片包裹3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇支架，体外构建组织工程骨，加入2 mL DMEM/F-12完全培养基覆盖支架和细胞膜片，放置细胞培养箱中孵育30 min，等待回植，见图1B，C。

1.4.4 实验动物分组取12只新疆阿勒泰大尾羊，随机分为1，2，3个月组，每组4只，于双侧下颌骨制备20 mm×3 mm×5 mm骨缺损。每组2只羊一侧植入细胞膜片复合3D打印鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架，另一侧植入细胞膜片复合明胶海绵；每组另外2只羊一侧植入细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇支架，另一侧植入细胞膜片复合明胶海绵。
1.4.5 构建羊下颌骨极限骨缺损模型及植入组织工程骨实验前，阿勒泰大尾羊禁食24 h，使用动物微量麻醉仪经小隐静脉给予3%戊巴比妥钠0.005-0.02 mg/kg麻醉。术中密切监护阿勒泰大尾羊的生命体征，将其四肢固定在动物外科手术台，严格口外内消毒、用甲紫标记羊口内下颌骨制备骨缺损区，采用课题组前期实验方法构建羊下颌极限骨缺损，大小为20 mm(长)×3 mm(宽)×5 mm(高)[16]，分层切开，剥离骨膜，暴露骨面，再次标记缺损尺寸，使用牙科慢速手机制备极限骨缺损区(生理盐水冲洗降温)，用直尺测量骨缺损尺寸，按照实验分组植入不同材料，严密缝合，见图2A-C。术后肌肉注射3.2×106 U青霉素钠及新速醒。实验羊苏醒后运回动物饲养中心，单独圈养3 d、专人喂养，抗生素抗炎3-5 d (期间使用洗必泰漱口液清洁口腔，预防动物术后感染)，流食饲养3 d，后续常规饲养。

1.5 主要观察指标
1.5.1 羊骨髓间充质干细胞及骨髓间充质干细胞膜片的形态结构采用全骨髓培养法培养羊原代骨髓间充质干细胞，首次全换液后用倒置相差显微镜观察细胞形态和数目。传代培养和制备骨髓间充质干细胞膜片后，定期倒置相差显微镜下观察细胞和细胞膜片的生长及成膜情况。
1.5.2 一般情况术后大体观察动物的精神、饮食、活动及伤口愈合情况，术后1，2，3个月末处死实验羊，每个时间点4只，取下颌骨制备标本。
1.5.3 锥形束CT观察骨修复情况无菌操作分离羊下颌骨，无菌保鲜膜包裹，拍摄锥形束CT。通过计算机辅助截取极限骨缺损区植入组织工程骨中间最宽处水平面的影像图，验证骨修复情况。
1.5.4 组织学观察成骨情况采用线锯快速将植骨区扩大5 mm锯断取出下颌骨，锯下骨缺损周围的骨组织，先用40 g/L多聚甲醛固定液冲洗一下，然后将标本进行固定，置于含有体积分数10%甲醛固定液标本瓶中，用15%EDTA脱钙液脱钙后，包埋、切片进行苏木精-伊红染色观察成骨情况。
1.5.5 实时荧光定量PCR检测成骨基因的表达下颌骨标本在液氮下研磨成粉末，每组称取50-100 mg，用Trizol法裂解骨组织提取各组总RNA，分别测定其纯度、浓度，选择纯度值在1.8-2.0之间的总RNA，反转录获得cDNA，用RT-PCR 试剂盒检测相关成骨基因骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平，同一成骨基因mRNA重复测量3次，计算2-∆∆Ct获得均值。引物设计见表1。

1.6 统计学分析定量资料以x±s表示，采取3×3析因设计的方差分析，方差齐性，两两比较使用LSD检验。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。运用SPSS 25.0统计学分析软件。

讨论

近年来修复骨缺损的方法及材料层出不穷，支架材料、种子细胞及生长因子组成的组织工程骨也逐渐备受追捧[9-11]。马鹿角来源广泛，可避免因屠杀动物涉及的伦理问题，经超低温粉碎研磨成粉末，保留了鹿角中众多细胞因子，是一种天然的骨质材料，在中医药中经常被研磨成粉用来促进人体生骨[8-9]。另外，聚乙烯醇复合支架、可降解型丝素蛋白复合支架均具备良好的可降解性能及生物相容性、机械性能等因素[10，12]。该研究根据前期课题组的实验成果[8]，成功3D打印出马鹿角粉、丝素蛋白、聚乙烯醇复合支架。赵小琦及丁刘闯等[8，17-19]在实验室利用FDM技术及冷冻干燥法以马鹿角粉、聚乙烯醇凝胶及丝素蛋白混合制备出骨支架，并与羟基磷灰石复合支架对比分析其各种性能，得出马鹿角粉复合支架具有良好的机械力学性能及生物相容性，可植入动物体内研究成骨效果。骨髓间充质干细胞是组织工程中应用最为广泛的种子细胞，因自身的特殊性而受到人们的青睐，在特定的条件下可向血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞等分化[20]。由于传统干细胞移植是在脱离培养板和再悬浮过程中以注射的方式为基础，有扩散快、对宿主组织的定位有限、酶消化损伤、剪切诱导细胞死亡等缺点[21]，细胞膜片技术是通过物理方法将扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得膜片状细胞结构的一种技术[22]。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质，生物相容性好，从而避免外源性生物材料的应用，提高了细胞移植的成活率[23]。研究表明，细胞膜片包裹支架材料极大地提高了细胞的利用率[24]。MOUTHUY等[25]研究表明，膜片复合支架材料具有钙化骨的特点，较单纯干细胞膜片组，机械强度和韧性明显提高。张文静[26]研究认为，细胞膜片结合马鹿角粉复合支架能够显示出良好的生物相容性、可降解性及显著的成骨效应，说明细胞膜片复合支架是一种骨缺损修复的选择方案。该研究将细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架、细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇支架植入羊下颌骨极限骨缺损区，第1个月末，2种支架均开始吸收，呈现稀薄云状，可见少量成骨细胞，但未见明显的钙化物，有纤维组织长入支架内；第2个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架材料吸收较少，能观察到不同密度的新骨生成，成骨细胞成骨活跃，有大量纤维组织长入支架内，较其他两组可见较多的新生毛细血管及较规则的排列骨小梁形成，有大量纤维组织长入支架内；第3个月末，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组支架材料吸收较多，新生骨长满骨缺损区，可见骨小梁排列规则、毛细血管丰富，成熟板层状骨，而细胞膜片复合纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚乙烯醇组仅有少量的新骨形成，并有大量的纤维长入骨内，细胞膜片复合明胶海绵组均未见明显变化，这表明骨髓间充质干细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇的组织工程骨在体内表现出了较好的诱导成骨性能，赵小琦[19]前期将大鼠骨髓间充质干细胞膜片复合马鹿角粉/聚乙烯醇支架植入肾被膜，在软组织内出现了成骨现象，可见马鹿角粉复合支架在骨形成方面有较好的优势。
颌骨极限缺损是在确定的研究时间内颌骨缺损不可能自行愈合的颌骨最小缺损，骨缺损应大于实验动物颌骨自行愈合修复的能力，才能真实地反映修复材料等对骨缺损的修复效果[2]。课题组前期将3D打印双相陶瓷化骨粉制备的组织工程骨植入至20 mm×5 mm×3 mm大小的羊颌骨缺损区[16]，再次证明羊颌骨极限骨缺损的大小。该研究将骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇骨支架植入羊下颌骨缺损[20 mm(长)×3mm(宽)×5 mm(高)]区域，经锥形束CT、大体观察及组织学观察，细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇骨支架表现出明显的骨修复特性，但细胞膜片复合明胶海绵材料无法在极限骨缺损的中央区成纤维血管化及成骨。实时荧光定量PCR结果显示，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组的骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达均大于其他两组。通过查阅文献可知，骨组织的主要成分为羟基磷灰石晶体，在骨代谢过程中成骨细胞、骨细胞及破骨细胞均可分泌骨桥蛋白，在骨基质矿化和编织骨中，成骨细胞、骨细胞的胞浆中均可观察到骨桥蛋白[27]，骨桥蛋白对成骨细胞分化和矿化的中止过程起重要作用。该研究在3个月的修复过程中，细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组骨桥蛋白的mRNA表达显著高于其他两组，随着时间的推移，骨桥蛋白的表达量也逐渐上升。骨钙蛋白是分化成熟的成骨细胞合成和分泌的[28]，并将其作为羟基磷灰石晶体储存在骨矿物基质中，能准确反映成骨细胞的活动[29]，其与钙结合后促进骨基质钙化，调控骨矿物沉积和转移，促进成骨细胞分化成熟及骨细胞的形成[30]。体外构建的组织工程骨植入到动物体内，骨钙蛋白增加说明骨组织形成也不断增加，缺损区逐渐在修复。在骨基质矿化过程中，Ⅰ型胶原给骨钙蛋白提供结构场所，还与骨钙蛋白等非胶原蛋白相结合，形成网络支架，为骨矿化提供基本条件。第1个月末时细胞膜片复合马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇组的Ⅰ型胶原表达量显著高于其他两组，各组Ⅰ型胶原在第2，3个月末时表达量显著减少，说明在早期成骨时Ⅰ型胶原表达量较高，骨形成晚期则减少，Ⅰ型胶原是成骨细胞分化早期的观测指标。综上所述，采用细胞膜片技术及计算机辅助设计，高浓度接种及诱导骨髓间充质干细胞成膜后，与3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架复合构建组织工程骨，植入羊下颌骨极限骨缺损区，可诱导骨缺损区修复重建及骨形成，显示出良好的成骨效果，这为后续马鹿角粉的组织工程骨研究提供参考，但该研究更多的关注骨形成方面，并未对其支架降解性指标进行分析，后续的实验将进一步研究破骨及蛋白方面的数据，探索组织工程骨成骨和破骨之间的平衡性及调控机制。同时，还应补充该组织工程骨植入颌骨缺损后半定量的Micro-CT扫描数据，探究该组织工程骨诱导新生骨的体积及面积，为今后组织工程骨商业化生产及储存提供充分的依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨髓间充质干细胞膜片复合3D打印马鹿角粉/丝素蛋白/聚乙烯醇支架的体内成骨

Osteogenesis using bone marrow mesenchymal stem cell sheets combined with three-dimensional printed Cervus elaphus antler powder/silk fibroin/polyvinyl alcohol scaffold in vivo

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