浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备及降解性能

doi:10.12307/2021.232

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5413-5419.doi: 10.12307/2021.232

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浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备及降解性能

肖得力1，孙崟喆1，崔城1，刘博2

1中国药科大学理学院，江苏省南京市 211198；2南乐县小梅口腔，河南省濮阳市 457400

收稿日期:2020-05-25 修回日期:2020-05-26 接受日期:2020-09-21 出版日期:2021-12-08 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 肖得力，博士，副教授，中国药科大学理学院，江苏省南京市 211198
作者简介:肖得力，男，1986年生，江苏省南京市人，汉族，博士，副教授，主要从事药学研究工作。
基金资助:
国家级大学生创新创业训练计划项目成果(202010316020G)，项目负责人：孙崟喆

Preparation and degradation properties of concentrated growth factor fibrin membrane

Xiao Deli1, Sun Yinzhe1, Cui Cheng1, Liu Bo2

1School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu Province, China; 2Xiao Mei Kou Qiang Clinic in Nanle County, Puyang 457400, Henan Province, China

Received:2020-05-25 Revised:2020-05-26 Accepted:2020-09-21 Online:2021-12-08 Published:2021-07-26
Contact: Xiao Deli, PhD, Associate professor, School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu Province, China
About author:Xiao Deli, PhD, Associate professor, School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Achievements of National Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students, No. 202010316020G (to SYZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
浓缩生长因子纤维蛋白：是第3代血浆提取物，与前两代血小板浓缩制品相比相同体积中含有更丰富的生长因子，纤维蛋白基质的拉伸强度和黏度更高，在临床应用中其体内作用时间更长，拥有更为优秀的组织再生能力。
引导骨组织再生术：作为常见的骨增量术式之一，其生物学机制是将生物膜覆盖在骨缺损区的骨组织表面，作为一屏障将软组织与骨组织隔开，从而形成相对封闭的成骨区域，使成骨细胞在该区域迁移、增殖及分化，实现牙周膜、牙槽骨、牙骨质再生，形成牙周新附着。
背景：在引导骨再生手术临床应用中生物材料的降解时间至关重要。
目的：系统比较富血小板纤维蛋白膜与浓缩生长因子纤维蛋白膜体外降解性能的差异，并分析同种型号不同机器与不同采血管对浓缩生长因子纤维蛋白膜降解性能的影响。
方法：利用Multi-CGF-3离心机分别制备富血小板纤维蛋白膜与浓缩生长因子纤维蛋白膜，然后将两种纤维蛋白膜分别浸泡于唾液中，观察膜质量与面积的变化。采用同种型号的两台离心机分别制备浓缩生长因子纤维蛋白膜，浸泡于唾液中观察膜质量与面积的变化。采用两种真空采血管(BD管、康捷管)分别制备浓缩生长因子纤维蛋白膜，浸泡于唾液中观察膜质量与面积的变化。
结果与结论：①两种纤维蛋白膜的体外降解性能存在差异，浓缩生长因子纤维蛋白膜初始质量更大且体外降解时间更长；②同种型号不同机器制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜初始质量无明显差异，初始面积质量比越小的浓缩生长因子纤维蛋白膜降解速度越慢；③与康捷管相比，BD管离心后的血液样本分层效果较好，但两种试管制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜的降解时间相近，总体降解性能相似；④结果表明，作为最新一代的自体血小板浓缩制品，浓缩生长因子纤维蛋白膜展现了较富血小板纤维蛋白膜更优异的降解性能。

https://orcid.org/0000-0002-0778-4691(肖得力)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 口腔, 浓缩生长因子, 纤维蛋白膜, 富血小板纤维蛋白, 体外降解

Abstract: BACKGROUND: The degradation time of biomaterials is crucial in the clinical application of guided bone regeneration surgery.

OBJECTIVE: To systematically compare the difference in degradation performance of platelet-rich fibrin membrane and concentrated growth factor membrane in vitro, and analyze the effects of different machines of the same type and different blood collection tubes on the degradation performance of concentrated growth factor membrane.

METHODS: Platelet-rich fibrin membranes and concentrated growth factor membranes were prepared with a Multi-CGF-3 centrifuge, and soaked in saliva to observe the changes in membrane quality and area. Two centrifuges of the same type were used to prepare concentrated growth factor membranes, which were then soaked in saliva to observe changes in membrane quality and area. Two types of vacuum blood collection tubes (BD tube and Kangjie tube) were used to prepare concentrated growth factor membranes, and the membranes were soaked in saliva to observe changes in membrane quality and area.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The in vitro degradation performance of the platelet-rich fibrin membrane and concentrated growth factor membrane was different. The initial mass of the concentrated growth factor membrane was larger and its degradation time in vitro was longer. (2) The initial mass of the concentrated growth factor membranes prepared by different machines of the same type had no significant difference. The smaller the initial area-to-mass ratio, the slower the degradation rate of the concentrated growth factor membrane. (3) Compared with the Kangjie tube, the BD tube had a better layering effect on blood samples after centrifugation; however, the degradation time and overall degradation performance of concentrated growth factor membranes prepared by the two test tubes were similar. (4) The results show that, as the latest generation of autologous platelet-concentrated products, the concentrated growth factor membrane exhibits better degradation performance than the platelet-rich fibrin membrane.

Key words: material, oral cavity, concentrated growth factor, fibrin film, platelet-rich fibrin, degradation in vitro

中图分类号:

肖得力, 孙崟喆, 崔城, 刘博. 浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备及降解性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5413-5419.

Xiao Deli, Sun Yinzhe, Cui Cheng, Liu Bo. Preparation and degradation properties of concentrated growth factor fibrin membrane[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5413-5419.

图/表（结果） 10

2 结果与分析 Results and analysis
2.1 两种纤维蛋白膜的体外降解性能差异
2.1.1 两种纤维蛋白膜的质量变化见图3A。
重复测量方差分析组内比较结果显示，随着时间的变化，富血小板纤维蛋白组(F=17 793.560，P < 0.05)与浓缩生长因子纤维蛋白组(F=49 986.785，P < 0.05)中纤维蛋白膜的质量都发生了明显变化。
组内进一步方差分析比较结果显示，富血小板纤维蛋白膜的质量在实验前9 d均表现为显著下降(P < 0.05)，从第9天开始质量残余量很少，可认为降解完全；浓缩生长因子纤维蛋白膜的质量除第5，10天外在实验前14 d均表现为显著下降(P < 0.05)，从第14天开始质量残余量很少，可认为降解完全。
组间进一步t检验比较结果显示，实验开始后，两种纤维蛋白膜的质量在各时间点均有显著差异(P < 0.05)。
2.1.2 两种纤维蛋白膜的面积变化见图3B。

重复测量方差分析组内比较结果显示，随着时间的变化，富血小板纤维蛋白组(F=14 124.200，P < 0.05)与浓缩生长因子纤维蛋白组(F=48 061.405，P < 0.05)中纤维蛋白膜的面积都发生了明显变化。
组内进一步方差分析比较结果显示，富血小板纤维蛋白膜的面积除第2天到第3天、第4天到第5天变化比较平缓外，在实验前9 d均表现为显著下降(P < 0.05)，从第9天开始面积残余量很少，可认为降解完全；浓缩生长因子纤维蛋白膜的面积除第4天到第5天变化比较平缓，在实验前14 d均表现为显著下降(P < 0.05)，从第14天开始面积残余量很少，可认为降解完全。
组间进一步t检验比较结果显示，实验开始后，两种纤维蛋白膜的面积在各时间点均有显著差异(P < 0.05)。

2.1.3 两种纤维蛋白膜的降解性能真空采血管中的血液样本分别运行富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子纤维蛋白程序后，均被分成3层，由底端到上端依次为红细胞层、浓缩生长因子纤维蛋白层和血浆层。浓缩生长因子纤维蛋白膜的初始质量与富血小板纤维蛋白膜的初始质量存在差异，浓缩生长因子纤维蛋白膜的初始质量大于富血小板纤维蛋白膜，这说明浓缩生长因子纤维蛋白膜比富血小板纤维蛋白膜有更多的纤维蛋白和生长因子。其次，浓缩生长因子纤维蛋白膜的质量和膜面积变化较富血小板纤维蛋白膜稳定。在降解过程刚开始的几天里，浓缩生长因子纤维蛋白相较于富血小板纤维蛋白降解速率更慢，能够更长时间地保持初始的质量和面积。最后，浓缩生长因子纤维蛋白膜的降解时间比富血小板纤维蛋白膜要长，有更稳定的控释生长因子能力。因此与富血小板纤维蛋白膜相比，浓缩生长因子纤维蛋白膜在医疗领域有望展现更优异的性能[33]。两种纤维蛋白膜的体外降解过程见图4。

如图5所示，两组浓缩生长因子纤维蛋白膜总体降解趋势相似。经t检验分析，同种型号不同机器制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜的初始质量无差异(P > 0.05)，说明同种型号不同机器制备浓缩生长因子纤维蛋白凝胶具有较好的重现性。但在人工压制成膜的过程中，不同批次间得到的初始膜面积会存在差异。为便于解释，作者提出了初始面积质量比(k)的概念：初始质量(m0)相同的浓缩生长因子纤维蛋白凝胶，初始膜面积(S0)越小则初始面积质量比越小，理论上降解速度也越慢。
研究发现，组二的初始面积质量比较小，降解速度因此较慢，与理论相吻合。迄今为止，国内外尚无关于浓缩生长因子纤维蛋白膜初始面积质量比的论述。其意义在于：在临床应用时，医生希望浓缩生长因子纤维蛋白膜有合适的降解时间，实验揭示了可以通过改变浓缩生长因子纤维蛋白膜的初始面积质量比来灵活调控其降解时间。

2.3 不同采血管制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜体外降解性能不同采血管对浓缩生长因子纤维蛋白膜的降解行为可能存在影响，但迄今尚未见不同采血管的系统比较，因此实验采用国内市场较为常见的两种采血管进行了比较。如图6所示，BD管离心后的血液样本分层效果比康捷管略好，纤维蛋白与红细胞部分之间界限更清晰。但进一步研究表明，两种试管制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜降解时间相近(P > 0.05)，总体降解性能相似，如图7所示。

2.4 浓缩生长因子纤维蛋白临床应用效果观察在临床应用时，浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备过程如图8所示。
将浓缩生长因子纤维蛋白膜应用于4种不同的临床适应证，均观察到良好的临床效果。

病例1：38岁男性根尖肉芽肿患者进行牙齿种植手术，该病例手术过程如图9所示；术后第2天，术区无疼痛，无肿胀，无感染，伤口良好；术后第10天，术区牙龈无异常，愈合良好。

病例2：56岁女性根尖周囊肿患者进行牙齿种植手术，该病例手术过程如图10所示；术后第10天，伤口愈合良好，未肿胀，无疼痛。

病例3：35 岁女性根尖周肉芽肿患者进行牙齿种植手术，该病例手术过程如图11所示；术后第10天，愈合良好，未有异常；术后2.5个月，角化龈充足。

病例4：9岁男性组合性牙瘤患者进行牙瘤摘除术，该病例手术过程如如图12所示；术后第10天，伤口愈合良好，无肿胀，无疼痛。

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引言

自体血小板浓缩制品是将自体全血通过离心、分离得到的富含血小板制品[1]，其血小板浓度一般为全血中血小板浓度的5倍[2]。血小板中含多种生长因子[3]，可促进骨增长和组织再生[4-5]。目前血小板浓缩制品主要分为3代[6]：第一代为富血小板血浆[7]，第二代为富血小板纤维蛋白，第三代为浓缩生长因子纤维蛋白[8]。自体血小板浓缩制品应用广泛，其中的富血小板血浆在整形外科、骨关节炎和口腔外科方面有重大应用[9]。因制备富血小板血浆时添加了牛凝血酶，可能引发患者免疫反应而造成术后损伤[10]，之后的富血小板血浆制备便添加患者自身的凝血酶，尽管解决了免疫问题，但富血小板血浆的制备仍然较繁琐。
尽管富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子纤维蛋白的组成几乎相同，但是与富血小板纤维蛋白相比，浓缩生长因子纤维蛋白具有更高的抗张强度，能够更好地保护生长因子不被水解[7]。富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子纤维蛋白中多种生长因子具有相似的释放规律，但浓缩生长因子纤维蛋白同期生长因子的释放浓度高于富血小板纤维蛋白。浓缩生长因子纤维蛋白中血小板衍生生长因子和表皮生长因子的浓度和数量也显著高于富血小板纤维蛋白。此外，浓缩生长因子纤维蛋白中的成骨细胞数也显著高于富血小板纤维蛋白[11]。在牙龈凹陷的治疗中，浓缩生长因子纤维蛋白在术后第10天就显示出令人满意的治疗效果，而富血小板纤维蛋白则长达3个月。另一方面，由于浓缩生长因子纤维蛋白是在不同离心条件下分离静脉血中的细胞而获得的，导致富含纤维蛋白的块状物体积更大、密度更高[12]。富血小板纤维蛋白中的纤维蛋白交织度较低，排列成条索状；与富血小板纤维蛋白相比，浓缩生长因子纤维蛋白的内部纤维蛋白交织度更高，其排列成栅栏状[13]。因此，浓缩生长因子纤维蛋白的纤维网络更加紧密，不易被降解，内含更多生长因子，在成骨作用和软组织修复过程中更加有效，所能发挥的生物再造功能更强[14]。
2006年，SACCO首先用一种特殊的离心机(Medifuge， Silfradent srl，意大利)离心血液样本制成浓缩生长因子纤维蛋白[15]。浓缩生长因子纤维蛋白制备时不添加外原物，且血液来自患者本身，不存在伦理道德问题，不存在免疫排斥的风险，且具有良好的生物相容性。因此，浓缩生长因子纤维蛋白被广泛应用于口腔医学与外科手术中[16]，如鼻窦增高手术和颌骨大囊肿切除手术[17-18]；浓缩生长因子还可增加失去的骨结构[19]，促进组织再生[20]，提高骨缺损修复能力[21]，以便为种植牙和随后的修复提供最佳条件[22-23]；浓缩生长因子纤维蛋白还有促进周围神经恢复[24]、促进创面愈合[25]、减轻瘢痕及修复难愈性创面等诸多功能[26-28]。
浓缩生长因子纤维蛋白的治疗效果与其降解特性密切相关，浓缩生长因子纤维蛋白中生长因子的主要释放方式并不是自由扩散，而是随着纤维蛋白的降解和血小板的破裂而释放[29]，因此浓缩生长因子纤维蛋白的降解性对其促进骨生长和组织再生的作用有决定性影响[30-31]。浓缩生长因子纤维蛋白属于生物制品，不同的形状[32]、仪器、程序、真空采血管对其降解性能可能存在影响，进而会影响其治疗效果。然而，迄今尚未见文献系统比较不同的制备方法、仪器和采血管得到的血小板浓缩制品的效果，因此实验探讨浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备及其降解性能，具有一定的理论价值和现实应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3月至2020年9月在中国药科大学、濮阳市南乐县小梅口腔完成。
1.3 材料
1.3.1 血样标本选择10名志愿者，其中男5名，女5名，年龄18-50岁，告知志愿者实验的目的意义，经其同意和中国药科大学伦理委员会审核。每名志愿者抽取2份9 mL静脉血，分别注入2个不同的采血管中，分别制备富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子纤维蛋白。选择标准：符合种植手术要求，无吸烟史，血常规、出凝血时间等指标正常，无影响种植手术的其他系统疾病。
1.3.2 实验仪器与设备一次性真空采血管[BD，碧迪医疗器械(上海)有限公司]；一次性真空采血管(康捷，江苏省康捷医疗用品有限公司)；浓缩生长因子纤维蛋白离心机[Multi-CGF-3，丰泰(湖南)商贸有限公司，1号机出厂编号19400018050083，2号机出厂编号19400018050178]；一次性使用静脉血样采集针(山东省成武县医用制品厂)；分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；移液枪；实验室常规离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
1.4 实验方法
1.4.1 两种纤维蛋白膜的体外降解性能差异
唾液采集：受试者静坐，头和躯干前倾45°，采集唾液。取样后放入常规离心机进行离心(1 500×g离心10 min)。离心完毕后取上清液，用于纤维蛋白膜的降解。

富血小板纤维蛋白膜的制备：用真空采血管采集受试者约9 mL血液，切勿摇晃采血管，以免产生溶血反应。立即放入浓缩生长因子纤维蛋白1号离心机，运行富血小板纤维蛋白离心程序。离心10 min后，真空采血管中的血液样本被分成3层，由底端到上端依次为红细胞层、富血小板纤维蛋白层和血浆层，如图1A所示。静置10 min后，取出富血小板纤维蛋白层，用蒸馏水清洗富血小板纤维蛋白以去除残留的红细胞，将富血小板纤维蛋白放在培养皿上，用压模装置压制成膜。

浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备：使用浓缩生长因子纤维蛋白1号离心机，运行浓缩生长因子纤维蛋白梯度离心程序10 min，其余步骤均与富血小板纤维蛋白膜制备过程相同。真空采血管中的血液样本被分成3层，由底端到上端依次为红细胞层、浓缩生长因子纤维蛋白层和血浆层，如图1B所示。
纤维蛋白膜的降解：将制得的纤维蛋白膜置于培养皿中，并用分析天平称量其质量(m)。用移液枪吸取8 mL唾液放入培养皿中，使唾液淹没纤维蛋白膜，测量纤维蛋白膜的面积(S)。将培养皿置于37 ℃干燥箱中保存，每天将培养皿取出，用移液枪吸去唾液，精密称量其质量，重复3次。称量完毕后补充等体积的新唾液，测量膜面积。重复上述操作直至纤维蛋白膜降解完全。

1.4.2 同种型号不同机器制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜体外降解性能如图2所示，分别用浓缩生长因子纤维蛋白1号和2号离心机制备浓缩生长因子纤维蛋白膜。1号离心机制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜为组一，2号离心机制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜为组二。实验前准备、唾液采集、浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备、纤维蛋白膜的降解实验标同1.4.1。

1.4.3 不同采血管制备的浓缩生长因子纤维蛋白膜体外降解性能采用两种真空采血管[碧迪医疗器械(上海)有限公司生产，以下简称BD；江苏省康捷医疗用品有限公司生产，以下简称康捷]分别制备浓缩生长因子纤维蛋白膜。实验前准备、唾液采集、浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备、纤维蛋白膜的降解实验同1.4.1。
1.4.4 浓缩生长因子纤维蛋白临床应用效果观察
浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备：采集患者静脉血约
9 mL于不含抗凝剂的真空采血管中，按照1.4.1所述过程制备浓缩生长因子纤维蛋白膜。
液态浓缩生长因子纤维蛋白的制备：采集患者静脉血约9 mL于含抗凝剂的真空采血管中，并立刻放入浓缩生长因子纤维蛋白离心机内，采用浓缩生长因子纤维蛋白程序进行离心。
浓缩生长因子纤维蛋白的临床应用：①病例1：制备2份浓缩生长因子纤维蛋白。取出患者牙齿，将浓缩生长因子纤维蛋白部分剪碎与其自体骨骨粉充分混合，植入术区，剩余浓缩生长因子纤维蛋白覆盖伤口，松散缝合。②病例2：制备1份液态浓缩生长因子纤维蛋白和1份浓缩生长因子纤维蛋白。使用5 mL一次性无菌注射器抽取适量液态浓缩生长因子纤维蛋白，与骨粉混合静置10 min。取出患者牙齿，取自体骨填充缺损处并植入液态浓缩生长因子纤维蛋白与骨粉混合物，浓缩生长因子纤维蛋白膜覆盖术区，松散缝合。③病例3：制备1份浓缩生长因子纤维蛋白。取出患者牙齿，用相应设备压制浓缩生长因子纤维蛋白成膜，联合骨膜覆盖创口，松散缝合。④病例4：制备2份浓缩生长因子纤维蛋白。摘除右上切牙-尖牙区组合性牙瘤，将浓缩生长因子纤维蛋白放入牙瘤摘除空腔中，松散缝合。
1.5 主要观察指标各组纤维蛋白膜的降解性能。
1.6 统计学分析所有数据结果均应用SPSS 23统计软件进行处理，富血小板纤维蛋白组与浓缩生长因子纤维蛋白组分别采用重复测量设计资料的方差分析，进一步组内比较采用方差分析，组间进一步比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

浓缩生长因子纤维蛋白膜的制备及降解性能

Preparation and degradation properties of concentrated growth factor fibrin membrane

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