肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2022.564

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3846-3851.doi: 10.12307/2022.564

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肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

陈迟迟1，2，张雨1，2，何家辰1，2，施勤1，2

1苏州大学医学部，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215123；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2021-03-13 接受日期:2021-04-10 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-22
通讯作者: 施勤，博士，研究员，苏州大学医学部，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215123；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:陈迟迟，男，1996年生，江苏省徐州市人，汉族，2018年常熟理工学院毕业，主要从事干细胞及骨代谢研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81972059)，项目负责人：施勤

Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in obese mice

Chen Chichi1, 2, Zhang Yu1, 2, He Jiachen1, 2, Shi Qin1, 2

1Medical College of Soochow University, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2021-03-13 Accepted:2021-04-10 Online:2022-08-28 Published:2022-01-22
Contact: Shi Qin, PhD, Researcher, Medical College of Soochow University, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Chen Chichi, Medical College of Soochow University, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81972059 (to SQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是骨髓基质中的一种具有多种分化潜能的细胞亚群。常用的分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增的目的。
成骨细胞：由多能的间质干细胞经过各种因素的调节发展而来，成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。成骨细胞增殖期细胞数量增加，形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原以最终可以矿化形成骨结节。

背景：骨髓间充质干细胞分化受到多种因素的影响，肥胖小鼠骨髓间充质干细胞具有更佳的成骨分化能力。
目的：探究正常饮食小鼠与高脂饮食诱导的肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的差异。
方法：将4-6周龄Balb/c小鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组，饲养20周后，通过全骨髓培养法得到骨髓间充质干细胞，成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色以及qRT-PCR检测成骨相关基因的表达，成骨诱导14 d后进行茜素红染色。高脂饲养20周后，Micro-CT分析股骨骨量的变化，小鼠股骨切片进行苏木精-伊红染色。
结果与结论：①与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食饲养20周后小鼠体质量显著增加；②与正常饮食组小鼠骨髓间充质干细胞相比，高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶阳性表达和钙结节数目显著增加，成骨相关基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白和RUNT相关转录因子2表达水平升高；③Micro-CT重建和骨形态参数量化结果显示，与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠骨量显著增加，其中骨密度、骨体积分数、骨面积与骨体积比值、骨小梁厚度和骨小梁数目均显著增加，而骨小梁分离度显著减小，苏木精-伊红染色显示高脂饮食组小鼠股骨内含有较多的骨小梁；④结果表明，肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强，进一步导致小鼠的骨密度、骨小梁厚度和骨小梁数目显著增加，骨量显著升高。

https://orcid.org/0000-0002-9403-752X (施勤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 正常饮食, 高脂饮食, 肥胖, 成骨诱导, 成骨分化, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells is affected by many factors. The bone marrow mesenchymal stem cells of obese mice have better osteogenic differentiation ability.
OBJECTIVE: To explore the difference of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from obese mice induced by high fat diet and normal diet mice.
METHODS: Balb/c mice aged 4-6-weeks were randomly divided into normal diet group and high-fat diet group for 20 weeks. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by whole bone marrow culture. After 7 days of osteogenic induction, alkaline phosphatase staining and qRT-PCR were performed to detect the expression of osteogenic related genes. At 14 days after osteogenic induction, alizarin red staining was performed. After 20 weeks of high-fat feeding, changes of bone mass of femur were analyzed by Micro-CT. The decalcified sections of the mouse femur were stained with hematoxylin and eosin.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the mice in the normal diet group, after 20 weeks of high-fat feeding, the weight of the mice increased significantly. (2) Compared with the bone marrow mesenchymal stem cells of mice in the normal diet group, the expression of alkaline phosphatase and the number of calcium nodules in the bone marrow mesenchymal stem cells of mice in the high-fat diet group increased significantly, and the expression levels of osteogenic related genes alkaline phosphatase, osteopontin and RUNT-related transcription factor 2 elevated. (3) The results of Micro-CT reconstruction and bone morphological parameter quantification showed that compared with the normal diet group, the high-fat diet group had a significant increase in bone mass, including bone mineral density, bone volume fraction, bone area to bone volume ratio, bone trabecular thickness, and bone trabecular number increased significantly, while the trabecular separation significantly reduced. Hematoxylin-eosin staining showed that there were more trabecular bones in the femur of the high-fat diet group. (4) It is concluded that osteogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells in obese mice is enhanced, which further leads to a significant increase in bone mineral density, bone trabecular thickness, and bone trabecular number, and also in the bone mass in mice.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, normal diet, high-fat diet, obesity, osteogenesis induction, osteogenic differentiation, mice

中图分类号:

陈迟迟, 张雨, 何家辰, 施勤. 肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3846-3851.

Chen Chichi, Zhang Yu, He Jiachen, Shi Qin. Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in obese mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3846-3851.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 4-6周龄雌性Balb/c小鼠16只，适应饲养1周后，随机均分为2组：正常饮食组和高脂饮食组，每组8只，其中3只用来提取骨髓间充质干细胞进行细胞实验，剩余5只小鼠先进行Micro-CT分析然后进行组织形态学染色，中途无脱落。
2.2 肥胖小鼠模型的鉴定结果小鼠饲喂高脂饮食饲料之前，正常饮食组和高脂饮食组小鼠体质量差异无显著性意义，见图1A；高脂饲料饲养20周之后，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠体质量均显著增加，差异有显著性意义。在糖代谢方面，葡萄糖耐量实验结果显示高脂饮食组小鼠的血糖水平在口服葡萄糖15 min时显著高于正常饮食组，见图1B，说明高脂饮食导致的小鼠肥胖模型构建成功。

2.3 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力差异成骨诱导7 d，高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达显著高于正常饮食组，见图2A，说明高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞具有较好的早期成骨分化能力；成骨诱导14 d，茜素红染色发现，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞具有更多的钙结节，见图2B，说明高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后具有较强的钙化能力。

2.4 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达差异成骨诱导7 d后qRT-PCR检测成骨相关基因的表达，与对照组相比，正常饮食组和高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞成骨相关基因表达水平显著升高；与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶、RUNT相关转录因子2和骨桥蛋白等成骨特异性基因表达水平显著升高，见图3A-C，说明肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强。

2.5 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨蛋白表达差异成骨诱导5 d后Western blot检测成骨蛋白表达，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后RUNT相关转录因子2和β-catenin蛋白表达水平显著升高，见图4，说明肥胖小鼠骨髓间充质干细胞可以通过Wnt/β-catenin通路促进成骨分化。

2.6 两组小鼠股骨Micro-CT分析结果两组小鼠股骨的二维和三维重建图像清晰地显示：与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠股骨中骨小梁比较密集，骨小梁间隙也明显减小，说明高脂饮食组小鼠骨量较多，见图5A，B。通过分析小鼠股骨相关参数发现：与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠骨密度显著增加[正常饮食组：(0.174±0.008) g/cm3，高脂饮食组：(0.273±0.044) g/cm3]，差异有显著性意义；正常饮食组小鼠的骨体积分数为(20.305±2.212)%，高脂饮食组为(38.125±7.068)%，比正常饮食组增加了87.76%，差异有显著性意义；正常饮食组小鼠骨面积与骨体积比值为(55.572±2.409) 1/mm，高脂饮食组为(69.321±4.961) 1/mm，比正常饮食组增加了24.74%，差异有显著性意义；正常饮食组的骨小梁厚度为(0.078±0.002) μm，高脂饮食组为(0.087±0.004) μm，比正常饮食组增加了11.54%，差异有显著性意义；正常饮食组和高脂饮食组的骨小梁数目分别为(2.606±0.292)1/mm和(4.51±0.685) 1/mm，高脂饮食组增加了73.06%，差异有显著性意义；正常饮食组和高脂饮食组的骨小梁分离度分别为(0.249±0.026) μm和(0.091±0.033) μm，高脂饮食组减少了63.45%，差异有显著性意义。这些效应表明高脂饮食组小鼠的骨密度、骨小梁数目和骨小梁厚度均增加，骨小梁分离度减少，说明高脂饮食组小鼠骨形成增强，见图5C。

2.7 两组小鼠股骨苏木精-伊红染色结果高脂饮食组小鼠股骨骨髓腔中的骨小梁数目明显多于正常饮食组，并且骨小梁分离度也较低，与Micro-CT结果一致，见图6。

2.8 生物相容性 CCK-8实验结果显示正常饮食组和高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞增殖差异无显著性意义，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验和动物实验，正常小鼠与肥胖小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化和体内成骨量差异，运用配对t检验统计学方法。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年3月在苏州大学骨科研究所施勤教授实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 16只4-6周龄健康雌性Balb/c小鼠来自苏州大学实验动物中心，体质量15 g左右，饲养于SPF级动物饲养室，喂饲全价颗粒饲料。饲养条件为每12 h明暗循环，温度21-23 ℃，湿度为50%-80%。

1.3.2 实验试剂与耗材正常饲料、高脂饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，中国)，配方见表1；二甲苯、苯、无水乙醇、中性树胶、盐酸(国药化学试剂有限公司，中国)；40 g/L多聚甲醛固定液、NaOH粉剂、EDTA粉剂、磷酸盐缓冲液、固体石蜡(北京索莱宝科技有限公司，中国)；伊红染液、苏木素染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，中国)；3 mL巴氏吸管、15 mL离心管、50 mL离心管(Crystalgen，美国)；刀片(Leica，德国)。

1.3.3 实验仪器电子天平、电热恒温鼓风干燥箱(八金实验器材有限公司，中国)；Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-Micro-CT，比利时)；超纯水过滤机(Millipore，美国)；正置显微镜(Carl Zeiss，德国)；包埋机、切片机(Leica，德国)。
1.4 方法
1.4.1 正常和肥胖模型小鼠的构建 4-6周龄雌性Balb/c小鼠16只，适应饲养1周后，随机均分为2组：正常饮食组和高脂饮食组，每组8只，5只用于Micro-CT，3只用来提取骨髓间充质干细胞。正常饮食组饲喂基础饲料，高脂饮食组饲喂高脂饲料，高脂饲料持续喂养20周以形成肥胖模型。在开始饲喂高脂饲料时以及饲喂高脂饲料20周后称量小鼠体质量，口服葡萄糖15，30，60 min后使用血糖仪测定血糖值，判断肥胖模型是否构建成功。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的提取及成骨诱导使用无菌器械分离出正常饮食组、高脂饮食组小鼠(每组3只)的股骨与胫骨，用含α-MEM完全培养基的无菌注射器反复冲洗小鼠骨髓腔，获得骨髓全细胞，将其转移至培养皿中，3 d后去除未贴壁细胞，PBS清洗3次，加入α-MEM培养基继续培养7 d至细胞融合90%左右进行细胞传代培养。将培养皿中的细胞用PBS洗2遍后加入胰酶消化90 s，加入α-MEM培养基终止消化，离心，将细胞沉淀重悬转入2个培养皿中继续培养，培养至第3代后即可使用。

将第3代骨髓间充质干细胞分别以1×105/孔和5×104/孔的密度接种在6孔板和24孔板，加入成骨诱导培养基(体积分数为10%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松和50 mg/L维生素C的α-MEM培养基)，每隔3 d换液1次，诱导5 d后提取蛋白进行western blot检测，诱导7 d后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行染色以及提取细胞总RNA进行qRT-PCR检测，诱导14 d后进行茜素红染色，以只加入α-MEM培养基未进行成骨诱导者为对照组。
1.4.3 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平取出6孔板细胞，使用RIPA提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度；先通过60 V电压电泳30 min再120 V电压电泳1 h；然后转膜1 h，封闭1 h，使用RUNT相关转录因子2、β-catenin和actin一抗孵育过夜，二抗孵育1 h后洗涤曝光。
1.4.4 qRT-PCR检测成骨相关基因表达水平取出6孔板细胞，弃培养基，加入1 mL Trizol溶液充分混匀，转移至离心管中，加入200 μL氯仿轻轻振荡后高速离心；轻轻取出离心后的离心管，将上层澄清上清吸出倒入新的离心管中，加入500 μL异丙醇，振荡混匀后离心，离心结束后观察是否出现沉淀，若有沉淀即可弃上清；沿管壁缓慢加入1 mL体积分数为75%乙醇，用移液枪轻轻吹打离心管底部使沉淀漂起后即可离心去净残余上清液；按照上述步骤再次清洗1次；再次离心1次，并用移液枪将残留液体吸除，晾干，加入适量提前预热的DEPC水进行溶解并测定其浓度；使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，再将cDNA作为模板，进行qRT-PCR检测碱性磷酸酶、骨桥蛋白和RUNT相关转录因子2等成骨相关基因的表达，引物序列见表2。

1.4.5 碱性磷酸酶染色取出24孔板细胞，用移液枪吸除培养基，加入PBS清洗3次；弃除PBS后即可加入适量40 g/L多聚甲醛固定30 min；去除多聚甲醛溶液，使用PBS洗除残留的多聚甲醛，洗涤3次；弃PBS后从边缘缓慢加入BCIP/NBT染色工作液，避光孵育30 min；将染色液吸出，加入适量的PBS进行洗涤终止染色反应并洗去多余底色后即可拍照。
1.4.6 茜素红染色取出24孔板细胞，用移液枪吸除培养基，加入PBS清洗3次；弃除PBS后即可加入适量40 g/L多聚甲醛固定30 min；去除多聚甲醛溶液，使用PBS洗除残留的多聚甲醛，洗涤3次；弃除PBS后从边缘缓慢加入500 μL茜素红染液，避光孵育30 min；将染色液吸出，加入适量的PBS进行洗涤终止染色反应并洗去多余底色后即可拍照。
1.4.7 细胞增殖实验将第3代骨髓间充质干细胞以2×103/孔接种在96孔板中，使用CCK-8试剂盒检测1，3 d的细胞增殖活力。在1，3 d同一时间点取出细胞去除孔板内培养基，PBS轻轻洗2次，然后加入100 μL配制好的CCK-8工作液，在细胞培养箱中避光孵育2 h；孵育结束后，将反应完的工作液转移到新的孔板中，在450 nm波长处测定吸光度值。
1.4.8 小鼠股骨行Micro-CT分析高脂饲养20周后，Mirco-CT扫描正常饮食组和高脂饮食组小鼠(每组5只)股骨，扫描设置相同的参数，扫描体素尺寸分辨率为9 μm，射线管电压50 kV，电流200 μA，射线投影捕获时间设置为0.5 s，扫描旋转角度为360°。
扫描图像通过计算机软件NRecon/NReconServer重建，随后通过CTan软件分析，使用Date view确定股骨远端生长板位置，股骨远端距生长板60层位置设置为分析区域的底层，距生长板210层位置设置为分析区域的顶层，描绘出这部分的松质骨作为分析区域，然后通过计算获得骨密度、骨体积、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨面积与骨体积比值和骨小梁分离度，最后重建出三维图像。
1.4.9 组织形态学染色 Micro-CT扫描分析后取出股骨进行组织形态学染色。将股骨置于40 g/L多聚甲醛中固定24-48 h，PBS清洗3遍，放入14% EDTA脱钙液进行脱钙处理14 d，每天更换脱钙液，待小鼠股骨变软，PBS清洗3次，分别进行乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片和染色等步骤；苏木精-伊红染色时，二甲苯脱腊2次，每次30 min，分别置于体积分数为100%，95%，85%，75%乙醇和ddH2O内进行复水，苏木精染色5 min，流水冲洗，1%盐酸水溶液分化3次，每次2-5 s；流水冲洗，饱和碳酸锂溶液返蓝10 s，伊红染液染色1 min，体积分数为75%，85%，95%乙醇以及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后通风橱内风干3 d，正置荧光显微镜拍照。
1.5 主要观察指标 ①两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力、成骨基因表达；②两组小鼠股骨Micro-CT分析、苏木精-伊红染色结果。
1.6 统计学分析所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计学分析，结果用x±s表示，运用配对t检验检测两组间的变量差异，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞在骨再生过程中具有十分重要的作用，其中主要包括软骨内骨化和膜内骨化。骨髓间充质干细胞是成骨细胞和脂肪细胞共同的祖先，饮食诱导的肥胖动物模型与人体肥胖的生理状态最为接近，因此该实验通过高脂饮食诱导肥胖小鼠模型研究骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。与正常饲料饲养的正常小鼠相比，高脂饲料组的肥胖小鼠体质量显著增加。肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶表达量显著高于正常小鼠；茜素红染色结果显示肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后具有更多的钙结节；
qRT-PCR结果显示，肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶、RUNT相关转录因子2和骨桥蛋白等成骨特异性基因的表达量显著高于正常小鼠，说明肥胖小鼠骨髓间充质干细胞具有更强的成骨分化能力。Micro-CT分析发现与正常小鼠相比，肥胖小鼠具有更高的骨密度和骨质，肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强，骨形成增加，进一步引起小鼠骨密度、骨体积分数和骨小梁数目增加。骨量通常根据双能X射线片或外周定量CT技术进行评估，在生长发育时期，骨骼的再吸收作用和骨矿物质的沉积对机械负荷是非常敏感的，FORST[24]指出，当骨骼所承受的机械载荷大幅度增加时，会导致骨量的增加。研究表明，在肥胖条件下，增加的肌肉和脂肪质量在重力作用下，对骨骼系统(特别是腿骨)施加更大的静态机械负荷，另外增加的肌肉也可以通过收缩施以动态的机械负荷，刺激成骨细胞，促进骨矿物质的积累[25-26]，与该研究一致，肥胖可以促进骨量的增加。
研究发现，肥胖儿童与正常体质量儿童相比有相对较高的全身面积骨密度、髋关节面积骨密度和腰椎面积骨密度[27]，并且在成年以后，超重儿童相比于非肥胖儿童具有较高的骨量水平[28-37]。
如果儿童或青年时期，通过一定的饮食习惯增加达到一定的肥胖度，增加峰值骨量的预期值，这将对后期的骨代谢产生积极的影响。文献证明，正常小鼠和肥胖小鼠骨髓单核/巨噬细胞加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体激活蛋白配体破骨向诱导后，两者的破骨细胞数目和骨吸收功能之间没有明显差异[38-39]。因此，肥胖小鼠骨量增加可能是因为骨髓间充质干细胞成骨分化能力提高，导致骨形成能力增强。
该实验仅对成骨特异性蛋白RUNT相关转录因子2和Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin进行了研究，未对其他信号通路进行研究，后续将对肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化相关机制进行深入探究。同时，骨髓间充质干细胞还具有成脂分化能力，因此后续还需进一步探究肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化之间的相互作用关系。
综上所述，高脂饮食20周诱导的肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强，骨形成增强，骨量升高，但是具体机制尚不明确，仍需要进一步深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in obese mice

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