氧化石墨烯复合材料载药微球的制备与性能研究

doi:10.12307/2022.272

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (22): 3467-3473.doi: 10.12307/2022.272

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氧化石墨烯复合材料载药微球的制备与性能研究

姜朝瑞，许燕，熊莹，张旭婧

新疆大学机械工程学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830047

收稿日期:2020-11-23 修回日期:2021-01-26 接受日期:2021-05-31 出版日期:2022-08-08 发布日期:2022-01-12
通讯作者: 许燕，教授，博士生导师，新疆大学机械工程学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830047
作者简介:姜朝瑞，男，1993年生，吉林省长春市人，硕士，主要从事梯度组织工程骨支架制备及性能研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金(2017D01C021)，项目负责人：许燕

Preparation and properties of graphene oxide/silk fibroin/rifampicin drug-loading microspheres

Jiang Chaorui, Xu Yan, Xiong Ying, Zhang Xujing

College of Mechanical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830047, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-11-23 Revised:2021-01-26 Accepted:2021-05-31 Online:2022-08-08 Published:2022-01-12
Contact: Xu Yan, Professor, Doctoral supervisor, College of Mechanical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830047, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Jiang Chaorui, Master, College of Mechanical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830047, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Science and Technology Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2017D01C021 (to XY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化石墨烯：是石墨烯经多次氧化得到的产物。作为石墨烯的衍生物，氧化石墨烯表面含有丰富的官能团如：羰基、羟基、环氧基等，可通过共价或非共价的方式实现与某些官能团连接，诸多官能团赋予其良好的生物相容性及油水两亲性。
载药微球：为新型的药物微载体，是以可降解高分子材料为基材，将药物分子吸附于表面或包埋其中形成微米级药物缓释微球，通过靶向运输至病灶区域，伴随微球的裂解及药物扩散，从而实现精准平稳释药。

背景：重度骨结核治愈率低且需要长期服药，但口服药物不良反应大。将载药缓释微球定量置于病灶处不仅可以确保药物浓度和精准治疗，还能有效调控药物释放速度，减少不良反应。
目的：优化氧化石墨烯/丝素蛋白/利福平微球的制备工艺。
方法：采用乳化法制备氧化石墨烯/丝素蛋白/利福平微球，在确定丝素蛋白浓度3.5%、水油比为1∶6、司盘80与石蜡比1∶10、温度为50 ℃、利福平与药物载体溶液比50 mg∶1 mL作为定量的前提下，考察不同搅拌速度(200，500，800 r/min)、不同有机溶剂与水相体积比(1∶1、4∶1、6∶1)及不同氧化石墨烯溶液与丝素溶液溶质比(0.1%，0.25%，0.5%)条件下制备出载药微球的微观形貌、载药率和包封率，确定较佳的制备工艺。
结果与结论：①扫描电镜显示，500 r/min制备的微球大小均匀，成球性较好；有机溶剂与水相体积比为4∶1制备的微球成球效率较好；氧化石墨烯溶液与丝素溶液溶质比为0.1%制备的微球成球率较高。②综合载药率和包封率检测结果，再结合氧化石墨烯/丝素蛋白微球的细胞毒性实验结果，选择在搅拌速度500 r/min、有机溶剂与水相体积比为4∶1、氧化石墨烯溶液与丝素溶液溶质比为0.1%的条件下制备微球，微球的成球率高，载药量为13.5%，包封率为61%，并且该微球在体外可稳定释放药物，在96 h内累计释药量约为67.3%，药物缓控释过程由扩散和溶蚀共同作用。
缩略语：氧化石墨烯/丝素蛋白/利福平：graphene oxide/silk fibroin/rifampicin，GO/SF/RFP

https://orcid.org/0000-0002-6255-4653 (姜朝瑞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 氧化石墨烯, 丝素蛋白, 载药微球, 乳化溶剂挥发法, 载药量, 包封率, 累积释药率, 释药机制

Abstract: BACKGROUND: The cure rate of severe bone tuberculosis is low and long-term medication is needed, but the adverse reaction of oral drugs is large. Quantitative placement of drug-loaded sustained-release microspheres in lesions can not only ensure drug concentration and precise treatment, but also effectively regulate the rate of drug release and reduce adverse reactions.
OBJECTIVE: To optimize the preparation process of graphene oxide/silk fibroin/rifampicin microspheres.
METHODS: Graphene oxide/silk fibroin/rifampicin microspheres were prepared by emulsion method. In determining the concentration of silk fibroin 3.5%, water oil ratio 1:6, Span80 and paraffin ratio 1:10, temperature of 50℃, rifampicin and drug carrier solution than 50 mg:1 mL as quantitative premise, the micromorphology, loading rate and encapsulation rate of the drug-loading microspheres were prepared at different stirring speeds (200, 500, 800 r/min), different organic solvents and water phase volume ratio (1:1, 4:1, 6:1) and different solute ratios of graphene oxide solution to silk fibroin solution (0.1%, 0.25%, 0.5%); and the better preparation technology was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the microspheres prepared at 500 r/min were uniform in size and had good pellet-forming property. When the volume ratio of organic solvent to water phase was 4:1, the pellet forming efficiency of microspheres was better. When the solute ratio of graphene oxide solution to silk fibroin solution was 0.1%, the pellet formation rate of microspheres was higher. (2) Comprehensive test results of drug-loading rate and coating rate, coupled with the graphene oxide/silk fibroin microspheres cytotoxicity experiment result, the microspheres were prepared under the condition of the stirring speed 500 r/min, organic solvent and water phase volume ratio of 4:1, graphene oxide solution and fibroin solution solute ratio of 0.1%. Microsphere formation rate was high; the loading rate was 13.5%; the encapsulation rate was 61%. The microspheres could stably release drugs in vitro, and the cumulative release dosage within 96 hours was about 67.3%. Drug release was processed by diffusion and dissolution.

Key words: graphene oxide, silk fibroin, drug-loaded microsphere, emulsifying solvent evaporation method, drug loading rate, encapsulation rate, cumulative release rate, drug release mechanism

中图分类号:

姜朝瑞, 许燕, 熊莹, 张旭婧. 氧化石墨烯复合材料载药微球的制备与性能研究[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3467-3473.

Jiang Chaorui, Xu Yan, Xiong Ying, Zhang Xujing. Preparation and properties of graphene oxide/silk fibroin/rifampicin drug-loading microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(22): 3467-3473.

图/表（结果） 9

2.1 GO/SF/RFP载药微球扫描电镜分析在制备工艺参数搅拌速度、有机溶剂与水相体积比、氧化石墨烯溶液与丝素蛋白溶液溶质比的交互作用中，应用单一因素法对微球的粒径及形貌表征进行考察，设置丝素蛋白浓度3.5%、水油比为1∶6、司盘80与石蜡比为1∶10、利福平与药物载体溶液比50 mg∶1 mL作为定量时，以搅拌速度(200，500，800 r/min)为自变量时，微球粒径随搅拌速度的提高呈现逐渐减小趋势，当搅拌速度过慢时乳化不充分，油水包裹状态不佳，微球大小不均；搅拌速度过快增加了微球发生碰撞的机会，易使已分散的微球重新凝聚和粘连，出现微球集聚团簇的现象，见图1A-C。
以有机溶剂与水相体积比(1∶1、4∶1、6∶1)为自变量时，当比例由1∶1变成4∶1时，有机溶剂的加入可促使丝素蛋白结晶的速率加快，从而提高了交联反应速度，因此成球效率在一定程度上有所提高；但当有机溶剂与水相的比例变为6∶1时，有机溶剂加入量过大导致丝素蛋白结晶速率过快，交联反应也过快，从而影响微球的形成，见图1D-F。
以氧化石墨烯溶液与丝素蛋白溶液溶质比(0.1%，0.25%，0.5%)为自变量时，随氧化石墨烯占比的提升，微球粒径并未发生明显变化，但成球效率会随氧化石墨烯溶液浓度的提升而降低，GO/SF/RFP载药微球表面的片层结构增多，同时微球形貌呈不规则球状甚至粘连现象严重，说明过高浓度的氧化石墨烯溶液不利于微球的形成，见图1G-I。因此在单因素的考察中，选取搅拌速度500 r/min、有机溶剂与水相比为4∶1、氧化石墨烯分散液与丝素蛋白溶液溶质比为0.1%为自变量作为优化参数进行综合考察，结果见图1J所示，优化后的微球显著改善了团聚粘连现象，保持了较好的粒径均匀性、个体完整性和分散性。

2.2 GO/SF/RFP载药微球红外光谱分析图2的红外光谱图显示，以丝素蛋白为基材的空白微球，分别在1 630 cm-1和1 524 cm-1处出现属于丝素蛋白β-折叠结构构象的C=O伸缩振动和N-H变形振动酰胺Ⅰ带特征峰，以及在1 234 cm-1处出现无规线团结构的酰胺Ⅲ带特征峰。而以氧化石墨烯/丝素蛋白为基材制备的空白微球中也相应地加入了氧化石墨烯的特征峰，如氧化石墨烯中的2 357 cm-1及2 334 cm-1处出现了明显的氧化石墨烯特征峰，以及在3 411 cm-1处的羟基O-H振动吸收峰明显增强。同时，氧化石墨烯在1 620 cm-1处的C-OH变形振动峰与丝素蛋白中1 630 cm-1处的C=O伸缩振动峰相结合，使丝素蛋白基材的酰胺特征峰前移至1 625 cm-1，以及使在1 527 cm-1处的β-折叠结构构象的N-H变形振动特征峰后移，并且两处峰值明显增强，说明空白微球中氧化石墨烯与丝素蛋白已充分复合。

图3的红外光谱图显示，药物利福平分别在 3 478，3 461，2 974，2 938，2 880， 1 726，1 641，1 243 cm-1处出现明显吸收峰；在氧化石墨烯/丝素蛋白/利福平载药微球的红外光谱图中，利福平在3 478，3 461 cm-1处的峰值明显减弱，但2 923 cm-1处的峰值明显增强；同时，在2 357 cm-1和2 337 cm-1处出现氧化石墨烯的特征峰，以及丝素蛋白的酰胺Ⅰ带特征峰前移至1 617 cm-1和后退至1 527 cm-1处，酰胺Ⅲ带特征峰前移至1 230 cm-1处并且3处峰值均明显增强，其原因为利福平中苯环和C=O与氧化石墨烯碳平面发生π-π堆积并形成氢键，说明利福平与氧化石墨烯/丝素蛋白复合材料成功结合。

2.3 氧化石墨烯/丝素蛋白微球细胞的毒性分析对微乳法制备的氧化石墨烯/丝素蛋白空白微球及制备应用到的食品级石蜡和司盘80等材料进行综合细胞毒性分析，重点验证氧化石墨烯含量对微球生物相容性的影响。
对比毒性反应分级标准及细胞相对增殖趋势可知，随氧化石墨烯含量的降低，微球毒性呈一定降低趋势，生物安全性能有所提高，见图4。当氧化石墨烯分散液与丝素蛋白溶液溶质比在0.25%-0.5%范围内，培养第5天时的细胞增殖率均在75%范围内，说明微球材料对细胞增殖有抑制作用，药物载体材料对细胞有中、低度的毒性；当氧化石墨烯分散液与丝素蛋白溶液溶质比为0.1%时，微球的细胞增殖率为87%左右，最终满足细胞生物安全性能要求，因此可作为生物材料应用于药物缓释载体材料研究。

2.4 GO/SF/RFP载药微球载药量及包封率结果分析不同条件下制备的GO/SF/RFP载药微球的载药量和包封率，见表1。

当搅拌速度较低时，仅有少量微球形成且粒径不均，载药率和包封率低；随着搅拌速度的上升，微球的载药量和包封率均有大幅增加，但在高速搅拌中微球发生粘连现象，微球成球效果差，导致包封率下降。
当加入与水相等体积的有机溶剂时，微球的载药量较高，但包封率较低，分析是由于少量有机溶剂未能完全清除油相，导致药物黏附在微球表面；当有机溶剂过量加入时，交联反应加快，微球粒径增大，使得载药量减少。因氧化石墨烯有较大的比表面积，可提高药物的负载，但过量的氧化石墨烯阻止丝素蛋白分子无规则结构向β-折叠结构转变，故载药量明显下降。
因此，综合单因素实验及细胞毒性实验结果，最终以搅拌速度为500 r/min、有机溶剂与水相体积比为4∶1、氧化石墨烯溶液与丝素蛋白溶液溶质比为0.1%制备GO/SF/RFP载药微球，其载药量为13.5%，包封率为61%。
2.5 GO/SF/RFP载药微球体外累积释药百分率将各时间节点吸取的溶液用紫外分光光度计测出吸光值，代入利福平药物标准曲线中计算出药物浓度，再运用累积释药率公式计算各时间节点释药率，并用Origin 2018软件拟合，绘制累积释药曲线。根据2010年《中国药典》规定，缓释制剂从释药曲线图中至少选出3个取样时间点，由第1个取样点开始考察药物是否有突释，第1个取样点为0.5-2 h，控释量应控制在30%；第2个取样点4-6 h，释放量应控制在50%；第3取样点7-10 h，释放量应控制在75%。
从图5可知，药物释放前期(0.5-2 h)的累积释药率为12%，由于药物浓度差导致释药速率较快，但无突释现象产生；4-6 h时的累积释药率为18%，满足《中国药典》规定控制释放量，至前12 h内累积释药率约为26.4%；随着浓度差越来越小，释药速率放缓，在96 h内累积释药率约为67.3%，具有稳定释药趋势，从而提高药物疗效。参考利福平在动物体内的最低抑菌浓度约0.06-0.5 mg/L，最低杀菌浓度约5 mg/L[16]，此次实验体外释药研究过程中最低释药浓度约17 mg/L，满足体内最低杀菌浓度。

2.6 GO/SF/RFP载药微球释药机制分析对于材料降解的缓控释微球，药物释放主要受控于扩散和溶胀作用。应用一级动力学模型、Higuchi模型、Peppas模型等对选取优化后制备的最优载药微球的药物释放进行释药动力学模拟，见表2，拟合结果见图6。

当相关系数R2更趋近于1时，说明实验数据拟合更符合该模型，因此通过相关系数R2对比分析，Peppas方程中R2=0.996 88，载药微球的药物释放机制更符合 Peppas模型，其中释药指数n用于表征药物的释放机制。其取值与几何特征相关，对于球体而言，当n取0.45和0.89时，药物释放规律分别作用扩散控制和溶蚀控制，当n介于二者之间时则表示为扩散和溶蚀的共同作用的结果，因此可根据Peppas方程中指数n=0.452 937粗略预测出微球中的药物释放由扩散和溶蚀机制共同作用。在此基础上，推广的幂指数模型在Peppas模型上又详细划分了扩散控制和溶蚀控制，拟合结果得R2=0.997 18，拟合效果优于Peppas模型，再次验证了载药微球的药物缓控释过程由扩散和溶蚀共同作用。更进一步，通过推广的幂指数方程Y=K1xm+K2x2m中扩散和溶蚀作用两者的比率R/F=K2xm/K1 (其中K1代表扩散常数、K2代表溶蚀常数、m是扩散指数)，对药物缓释中的主要释药作用结合体外释药实验表明，随药物缓释时间的延长，R/F比值越大，溶蚀对药物释放的作用越大。同时，R/F比值表明此方法制备的载药微球药物释放以扩散机制作为主导作用。

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引言

骨关节结核是最多见的肺外结核，如诊疗不及时极易造成病灶部位组织破坏、寒性脓肿，导致局部畸形或出现截瘫症状等[1]，但长期服用抗结核药物不仅无法满足病灶区所需药物浓度，还会因其毒副作用损伤体内部分器官，因此载药缓释微球的研发尤为重要，通过选取生物相容性良好、降解产物无毒的载体材料，搭载相应的药物在96 h内维持局部有效药物浓度[2]。但现阶段，采用不同方法制备出的载药微球存在一些弊端：微球降解产物无法代谢出体外；微球的载药量仅为3%-5%，且在缓释前期突释现象明显；微球在制备过程中易发生团聚和粘连，成球率低且粒径不均。针对上述问题，提出一种以氧化石墨烯和丝素蛋白复合材料搭载抗结核药物利福平的载药微球。
氧化石墨烯是由sp2碳原子构成的具有蜂窝状单层结构的二维纳米材料，表面存在大量的活性基团，如羟基、羧基、环氧基等[3-4]，较大的比表面积可以提高载药量，通过π-π堆积，静电引力作用可以增加难溶性药物的载药量[5-7]。KARKI等[8]利用聚乙烯吡咯烷酮和β-环糊精共价改性修饰氧化石墨烯，得到氧化石墨烯-聚乙烯吡咯烷酮和氧化石墨烯-β-环糊精并负载药物SN38，分析在不同pH值缓冲液中药物的释放，实现功能化氧化石墨烯对药物的负载、释放及杀伤人体乳腺癌细胞能力。LIU等[9]利用聚乙二醇修饰氧化石墨烯得到聚乙二醇-氧化石墨烯，然后通过π-π堆积作用吸附抗癌药物SN38，所得到的聚乙二醇-氧化石墨烯-SN38复合物对癌细胞有很强的灭杀能力。杨琳等[10]通过动物实验得出，在含药量相同的条件下，氧化石墨烯负载药物5-氟尿嘧啶较5-氟尿嘧啶的灭杀癌细胞能力更强。丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸以高度重复的多肽链组成，作为一种无毒的天然生物材料其有良好的生物相容性及可降解性[11-12]，在组织工程中常与其他材料结合后作为药物载体材料。刘纯等[13]采用乳化-化学交联固化法，以双氯芬酸钠为模型药物制备出双氯芬酸钠丝素蛋白/壳聚糖缓释微球，缓释微球的载药量和包封率分别为(9.88±0.49)%和(50.35±0.92)%，平均粒径为 (26.54±1.39) μm，发现丝素蛋白有望成为一种低毒性的新型缓控释载体材料。SUBIA等[14]利用戊二醛将丝素蛋白和白蛋白的混合溶液制备出负载甲氨蝶呤的载药微粒，体外释药行为表明约85%的药物在12 d后被释放出来，MTT比色法和FITC法证明载药粒子不影响细胞的生存能力和生物相容性。张云海[15]采用盐析法制备出丝素蛋白-Fe3O4磁性复合微球，微球通过静电吸附作用成功载药多柔比星，表现出良好的释放性能，细胞内吞实验表明磁性复合微球可以定位于细胞质，且由于丝素蛋白显著的生物相容性，复合微球对细胞没有毒性。
实验采用微乳法制备出氧化石墨烯/丝素蛋白/利福平(graphene oxide/silk fibroin/rifampicin，GO/SF/RFP)载药微球，通过不同工艺参数及生物安全性实验，确定最优制备工艺，同时分析载药微球各组分间的相互作用及药物缓释性能，为氧化石墨烯作为药物微载体提供新的实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计单因素实验。
1.2 时间及地点实验于2020年7-10月在新疆大学机械工程学院增材制造实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器 8028-Series高精度数字电子秤(浙江凯丰集团有限公司)；HC-1014离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；D1J1C-120S磁力搅拌器(浙江力辰仪器科技有限公司)；SUPRA 55vp扫描电子显微镜(国鼎环科技术有限公司)；HH-1数显恒温水浴锅(金坛市城东新瑞仪器厂)；754PC紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；LC-12N-50A立普型冷冻干燥机(浙江力辰仪器科技有限公司)；透析袋(相对分子质量6 000-8 000，北京索莱宝科技有限公司)。
1.3.2 主要药物与试剂氧化石墨烯分散液(200 mL，南京先丰纳米材料科技有限公司)；天然蚕茧(500 g，湖州新天丝生物技术有限公司)；利福平药物(25 g，上海源叶生物科技有限公司)；溴化锂(100 g，上海源叶生物科技有限公司)；无水碳酸钠(500 g，天津化工厂)；异丙醇(500 mL，天津市大茂化学试剂厂)；磷酸盐缓冲液(500 mL，美国海克隆公司)；司盘80(500 mL，日本东京化成工业株式会社)。
1.4 实验方法
1.4.1 氧化石墨烯溶液的准备将片径为0.2-4 μm、质量浓度为2 g/L的氧化石墨烯分散液，加入一定比例的去离子水，稀释成质量浓度为0.5 g/L，低温保存待用。
1.4.2 丝素蛋白溶液的制备首先将盛有碳酸钠溶液的烧杯置于磁力搅拌器中，设定温度为90 ℃；再把天然蚕茧投入烧杯中，搅拌30 min后用去离子水清洗，进行第一次脱胶，重复3次后将所得产物放入60 ℃恒温干燥箱；然后称取脱胶的蚕茧20 g投入盛有80 mL的溴化锂烧杯中，加热搅拌1.5 h，将所得溶液装入透析袋，用去离子水浸泡4 d，期间每4 h换一次水；最后将溶液装入离心管，2 500 r/min离心10 min，2次取上清液得到丝素蛋白溶液，测得丝素蛋白溶液浓度为3.5%。
1.4.3 GO/SF/RFP载药微球的制备首先将盛有一定量氧化石墨烯溶液的烧杯置于超声仪中，30 min后取出烧杯，加入丝素蛋白溶液共混后作为水相，把利福平原药加入其中并均匀搅拌30 min待用；然后向盛有一定量液体石蜡烧杯中加入司盘80油状液体，并用磁力搅拌器匀速搅拌15 min；接着用胶头滴管把溶有药物的水相缓慢滴加到含有司盘80的液体石蜡烧杯中，反应一段时间后加入有机溶剂异丙醇溶液，匀速搅拌50 min；最后把所得溶液装入离心管中，2 000 r/min离心10 min后去除上清液，再加入异丙醇溶液，2 000 r/min离心10 min；磷酸盐缓冲液清洗，2 000 r/min离心10 min，去除上清液后，将离心管底部沉淀用冷冻干燥机冻干12 h，即为GO/SF/RFP载药微球。
实验在确定丝素蛋白浓度3.5%、水油比为1∶6、司盘80与石蜡比为1∶10、温度为50 ℃、利福平与药物载体溶液比50 mg∶1 mL作为定量的前提下，分别设置搅拌速度为200，500，800 r/min，有机溶剂与水相体积比为1∶1、4∶1、6∶1，氧化石墨烯溶液与丝素蛋白溶液溶质比为0.1%，0.25%，0.5%为自变量，探究GO/SF/RFP载药微球的制备及载药量、包封率和累积释药率。
1.4.4 GO/SF/RFP载药微球电镜扫描为观察载药微球微观形貌，取少量微球置于导电接收台并做喷金处理，用扫描电子显微镜观察载药微球成球情况，随机选取不同区域进行图像采集。
1.4.5 GO/SF/RFP载药微球红外光谱测试将样品与溴化钾粉末混合后压成薄片，在红外光谱仪上扫描120次，分辨率4 cm-1，测定范围为4 000-500 cm-1。
1.4.6 GO/SF微球的细胞毒性检测为确保含有氧化石墨烯微球的有效生物安全性，运用CCK-8 检测液对含有不同浓度氧化石墨烯分散液的空白微球进行细胞毒性检测。
高温高压对空白微球进行消毒，按照50 g/L的浸提比例加入细胞培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中24 h，制备空白微球浸提液。培养新西兰大耳兔骨髓间充质干细胞(新疆医科大学动物实验中心)，制备细胞悬液，以2×104/cm2细胞密度将传至第3代的细胞接种到96孔板中，每孔100 µL，实验组加入空白微球浸提液，阴性对照组加入细胞培养液，以不含细胞仅加入细胞培养液的样本为空白对照，每组3复孔。将96孔板置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，3，5 d取出培养板，磷酸盐缓冲液柔轻漂洗后将样本分别转移到新的96孔板中，每孔加入10 µL的CCK-8溶液孵育3 h，在450 nm波长下用酶标仪分别测定各孔的吸光度值，利用公式计算细胞相对增殖率。当细胞相对增殖率≥100%时，毒性为0级，提示材料合格，无毒性；当细胞相对增殖率在75%-99%之间时，毒性为1级，提示材料合格，轻度毒性；当细胞相对增殖率在50%-74%时，毒性为2级，提示材料不合格，中度毒性；当细胞相对增殖率≤49%时，毒性为3级，提示材料不合格，重度毒性。
细胞增殖率(%)=(实验组平均A值-空白对照组平均A值)÷(阴性对照组平均A值-空白对照组平均A值)×100%
1.4.7 绘制利福平标准曲线称取10 mg利福平溶于磷酸缓冲液中，将混合液装入100 mL容量瓶中，摇晃瓶身使药物完全溶解后得到质量浓度为100 mg/L利福平溶液。用移液枪分别将1 000，1 250，1 500，1 750，2 000 µL的利福平溶液注入10 mL容量瓶，以磷酸盐缓冲液定容至10 mL，稀释得到质量浓度分别为10，12.5，15，17.5，20 mg/L的利福平磷酸盐缓冲液，利用紫外分光光度计在波长475 nm处测各容量瓶中液体的吸光度值。通过Origin 2018软件进行曲线拟合得到利福平药物标准曲线方程，Y=0.025 82X-0.020 51，相关系数R2=0.993。

1.4.8 GO/SF/RFP载药微球载药量及包封率称取冷冻干燥后的微球10 mg，投入10 mL磷酸盐缓冲液并用恒温振荡器振荡12 h，使载药微球充分溶解再吸出上清液，重复此操作8-10次并观察溶液变化。将每次吸出的上清液用紫外分光光度计检测吸光度值，利用利福平药物标准曲线计算溶液浓度，根据公式计算出载药量和包封率。

1.4.9 GO/SF/RFP载药微球体外缓释在透析袋中装入50 mg载药微球，向其中加入2 mL磷酸盐缓冲液，密封两端后将透析袋装入50 mL磷酸盐缓冲液密封瓶中。在2，4，8，12，24，48，72，96 h吸取5 mL溶液，之后再重新加入磷酸盐缓冲液；将各时间节点吸取的溶液用紫外分光光度计测出吸光度值，代入利福平药物标准曲线中计算出药物浓度，根据公式计算载药微球累积释药率。

式中Vt为释药介质的总体积(mL)，Ct为不同时间节点释药介质中的药物质量浓度(g/L)，Vi为每次取样体积(mL)，M 为载药微球的总质量(mg)，A 为载药微球的载药量。
1.5 主要观察指标 GO/SF/RFP载药微球的微观形貌、载药量、包封率和累积释药率。
1.6 统计学分析利用统计学软件SPSS 25.0进行单因素方差分析。

讨论

药物缓控释系统是将具有良好生物相容性和生物降解性的载体材料与药物通过物理或化学方法制备而成的，在体内通过扩散、渗透、降解等方式使药物以合适的速率及浓度平缓释放，可实现局部释药靶向治疗，提高药物的利用率[17-19]。目前，大分子载体系统、脂质体载体系统及载药微球系统成为药物缓控释系统中较受关注的3种[20]。载药微球系统能控制药物的释放速度，以达到长效缓释目的并提高治疗效果[21]。乳化法是当前最简单且高效的制备载药微球方法[22]。实验采用油包水型微乳，即水相分散在油相中，表面活性物质吸附在油水界面，一端作为极性端与水相相连，另一端作为非极性端与油相相连，通过高速搅拌乳化形成微球。
GO/SF/RFP载药微球作为一种疏水性抗癌药物新载体，在生物医学领域的应用前景十分广阔。通过共价和非共价修饰的氧化石墨烯不仅拥有较大的比表面积来提高药物的负载，还拥有较低的毒性、良好的靶向性、缓释性[23]、抑菌性及力学性能等特点[24-25]，成为生物医学领域的研究热点[26]。氧化石墨烯和丝素蛋白作为载体材料具有油水两亲性，通过π-π作用使利福平药物包覆在微球内，在提高载药量的同时可以促进细胞黏附和增殖[27-28]。在制备载药微球过程中，利用CCK-8测定载体材料的细胞毒性，通过96孔板中各孔吸光度，计算出细胞相对增殖率[29-30]，虽然在氧化石墨烯溶液与丝素蛋白溶液溶质比为0.25%时微球的载药量和包封率最高，但不满足细胞毒实验，故最终确定溶质比为0.1%；在选取搅拌速度为500 r/min、有机溶剂与水相体积比为4∶1制备出的GO/SF/RFP载药微球载药量为13.5%，包封率为61%，以此工艺制备的载药微球成球效果良好，未发生团聚和黏连现象；通过红外光谱分析载药微球各组分间结构特征及结合方式，得出基材间、基材与药物间有良好的结合性；在探究载药微球体外释药性能时，在96 h内累计释药量约为67.3%，且未发生明显的药物突释现象，能够在规定时间内稳定释放药物；采用一级动力学模型、Higuchi模型、Peppas模型对释药特性进行模拟分析，通过释药指数n区分不同释药机制[31]，确定药物缓控释过程由扩散和溶蚀共同作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

氧化石墨烯复合材料载药微球的制备与性能研究

Preparation and properties of graphene oxide/silk fibroin/rifampicin drug-loading microspheres

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