胶原蛋白海绵的制备及安全性评价

doi:10.12307/2022.271

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (22): 3460-3466.doi: 10.12307/2022.271

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胶原蛋白海绵的制备及安全性评价

刘超远，高田芳，黄伟

杭州协合医疗用品有限公司，浙江省杭州市 310018

收稿日期:2020-11-23 修回日期:2021-01-23 接受日期:2021-05-27 出版日期:2022-08-08 发布日期:2022-01-12
通讯作者: 黄伟，高级工程师，杭州协合医疗用品有限公司，浙江省杭州市 310018
作者简介:刘超远，男，1992年生，河南省平顶山市人，汉族，2019年四川大学毕业，硕士，助理工程师，主要从事生物医学材料研究。

Fabrication and safety evaluation of collagen sponge

Liu Chaoyuan, Gao Tianfang, Huang Wei

Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd., Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China

Received:2020-11-23 Revised:2021-01-23 Accepted:2021-05-27 Online:2022-08-08 Published:2022-01-12
Contact: Huang Wei, Senior engineer, Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd., Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China
About author:Liu Chaoyuan, Master, Assistant engineer, Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd., Hangzhou 310018, Zhejiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
胶原蛋白海绵：在动物跟腱、皮、鱼鳞等含有胶原较多的机体组织中，通过酸法、酶法、碱法或酸酶结合法等方法提取，并通过盐析、透析等纯化工艺得到的胶原溶液，最后将此溶液通过冷冻干燥工艺得到三维网孔状的固体。实验中胶原蛋白的提取采用的是酸酶结合法，在温和的条件下进行，可以有效保持胶原蛋白的活性。
冷冻干燥工艺：胶原蛋白的热变性温度较低，因此其脱水过程适合用低温低压的冷冻干燥工艺进行。实验中将胶原蛋白冻干液置于大型冷冻干燥机中，迅速低温凝固，保持形态；再经抽真空方式将原冻干液中的水分通过冷凝器吸收并除去，原水汽聚集的部位留下孔洞结构，即得到了蓬松的海绵结构固体。

背景：自动物体提取胶原蛋白并经冻干工艺得到胶原蛋白海绵，可赋予材料良好的临床止血性能，同时可实现在机体中的自身降解，但所提取的胶原蛋白也存在携带病毒及体内免疫原性风险。经过酸酶结合工艺处理去除胶原端肽、并灭活病毒，实现材料良好的生物安全性。
目的：规模化生产制备胶原蛋白海绵，并对其进行免疫原性及病毒灭活有效性的整体生物安全性评价。
方法：通过酸酶结合法从牛跟腱中提取胶原蛋白，经冷冻干燥工艺得到胶原蛋白止血海绵。将1，4片胶原蛋白海绵分别埋植于Wistar大鼠腹部皮下，埋植1，4，8，12周后对大鼠体征、血常规、T淋巴细胞增殖、免疫球蛋白含量等指标进行检测。取3批次的牛跟腱粉碎后中间体样品，分别浸泡于伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和猪脑心肌炎病毒液中，检验酸酶结合法处理的胶原蛋白海绵对病毒灭活的有效性。
结果与结论：①于无菌车间规模化提取胶原蛋白，经冷冻干燥后得到胶原蛋白海绵，并完成内外包装和辐照灭菌的生产全过程；②埋植1，4片胶原蛋白海绵大鼠的生理体征、血常规、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞增殖状态及免疫球蛋白含量等指标均表现正常；③酸酶法工艺灭活的3批次牛跟腱粉碎后中间体样品均无可以检测到的病毒，可使病毒滴度下降4个logs以上；同时，对未能检测到的病毒滴度样品进行了敏感细胞接种盲传3代，结果未显示细胞病变；④免疫原性和病毒灭活检测表明，所制备的胶原蛋白止血海绵有着良好的生物安全性。

https://orcid.org/0000-0002-2290-7987(刘超远)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 胶原蛋白, 海绵, 止血材料, 端肽, 免疫原性, 冷冻干燥, 酸酶结合法, 病毒灭活

Abstract: BACKGROUND: Collagen could be extracted from the animal, and the collagen sponge could be fabricated by vacuum freeze-drying technology, which is used in clinical hemostasis. Besides, it would be degraded in vivo. However, there are some concerns about collagen biomaterials, owing to the potential risk of carrying viruses and immune rejection. The biological safety of collagen hemostatic sponge was achieved by removing the terminated peptide and inactivating the virus.
OBJECTIVE: To investigate the immunogenicity and the validity of virus inactivation of collagen hemostatic sponge in commercial process.
METHODS: The collagen was extracted from bovine tendons through acid-enzymatic hydrolysis. After the vacuum freeze-drying technology, the porous collagen hemostatic sponge was prepared. The immunogenicity was investigated by insert 1 or 4 pieces of collagen sponge in Wistar rats subcutaneously. The physical sign, blood routine examination, T lymphocyte proliferation, and immunoglobulin content were examined at 1, 4, 8 and 12 weeks. Pseudorabies virus, vesicular stomatitis virus, porcine parvovirus and porcine encephalomyocarditis virus were chose as indicator virus to investigate the validity of virus inactivation by three batches of crushed bovine tendons.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The collagen sponge was extracted and fabricated by freeze-drying technology in clean workshop in commercial process. The irradiation sterilization was conducted after the whole process of packaging of the collagen sponge. (2) After inserting 1 or 4 pieces of collagen sponge, the physiological signs, routine blood tests, NK cell killing activity, T lymphocyte proliferation, and immunoglobulin content of the rats were found to be normal. (3) There was no detectable virus, which could reduce the titer of these four kinds of indicator virus by more than four logs, after the acid-enzymatic process of collagen sponge. In addition, sensitive cells inoculation and blind cultivation for three generations were performed on the virus titer samples that could not be detected, and the results showed no cytopathic effect. (4) Immunogenicity and virus inactivation test results showed that the prepared collagen hemostatic sponge had good biological safety which could be used in clinical hemostasis.

Key words: collagen, sponge, hemostatic materials, terminated peptide, immunogenicity, freeze-drying, acid-enzymatic hydrolysis, virus inactivation

中图分类号:

刘超远, 高田芳, 黄伟. 胶原蛋白海绵的制备及安全性评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3460-3466.

Liu Chaoyuan, Gao Tianfang, Huang Wei. Fabrication and safety evaluation of collagen sponge[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(22): 3460-3466.

图/表（结果） 5

2.1 胶原蛋白海绵的免疫安全性
2.1.1 大鼠体征变化情况对6组大鼠术后进行不同时间的状态及体质量监测，发现实验前后饮食状况正常，均未出现伤口感染。通过计算大鼠初始体质量和术后不同时间点体质量，得出体质量的增长率，结果见图1。

可以看出，各组大鼠体质量都随时间延长呈增加趋势，高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组和空白对照组大鼠的体质量增长趋势一致，同时这4种处理类型的组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明医用胶原蛋白海绵的植入并未对大鼠的饮食、生长造成影响。
2.1.2 大鼠血常规分析借助血细胞计数仪对大鼠外周血进行了白细胞计数、淋巴细胞百分率、中性粒细胞百分率等进行了结果统计分析，其结果见图1。
外周血白细胞计数：术后1，4，8，12周，医用胶原蛋白海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组和空白对照组的白细胞水平均在正常值范围[对应值为(2.9-20.9)×109 L-1]内，且4组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。此外，免疫抑制剂给药组大鼠白细胞数低于正常值范围，且与免疫刺激剂给药组的白细胞计数比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
淋巴细胞检测：术后1，4，8，12周，医用胶原海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组和空白对照组的淋巴细胞百分率均在正常值范围(56.7%-93.1%)，且组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。此外，在第8周时，免疫抑制剂给药组较其他各组低，并且低于正常值范围，与免疫刺激剂给药组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
外周血的中性粒细胞百分率：术后1，4，8，12周，医用胶原蛋白海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组、空白对照组的中性粒细胞百分率相对稳定，基本都在正常值范围(5.3%-38.1%)内。此外，第8周时，免疫抑制剂给药组的淋巴细胞百分率低于其余各组，并且低于正常值范围，与免疫刺激剂给药组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
以上血细胞检测结果表明，医用胶原蛋白海绵埋植大鼠体内后大鼠的外周血白细胞计数、淋巴细胞百分率、中性粒细胞百分率等数据结果同假手术对照组、空白对照组之间无明显差异，基本都维持在正常值范围内，表明了胶原蛋白海绵的植入未对血常规方面产生异常影响。
2.1.3 NK细胞杀伤活性测定自然杀伤细胞(NK细胞)杀伤活性结果，见图2A。可以看出，在术后1，4，8，12周，医用胶原海绵高剂量埋植组和低剂量埋植组的NK细胞杀伤活性同假手术对照组、空白对照组相近，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。但另一方面从数据的均值上分析发现，第8-12周实验组的NK细胞杀伤活性有上升的趋势。研究表明，胶原蛋白是LAIR-1的高亲和性受体，而LAIR-1在机体中发挥着免疫抑制的作用[23]。将胶原蛋白与LAIR-1结合，对静止NK细胞及活化的NK细胞在行使对靶细胞杀伤时产生明显的抑制作用[24-26]。基于此，作者做出推断：胶原蛋白海绵植入前期对NK细胞活性产生抑制，因而表现为NK细胞杀伤活性较低；随着胶原蛋白在体内的降解(8周前)及胶原蛋白在植入位点的逐渐消失(8-12周)，在组织受损部位将重新表现出一定的杀伤活性；同时通过对比低剂量埋植和高剂量埋植组发现，高剂量埋植组在第8，12周的NK细胞杀伤活性较低剂量埋植组低，与其在体内降解仍有残留有关，也有效地支持此推论。
结果表明，埋植医用胶原蛋白海绵的大鼠靶细胞表面自身MHC-I类分子与NK细胞表面抑制性受体之间的平衡仍能保持良好，故而胶原蛋白海绵的植入对大鼠NK细胞杀伤活性无明显影响。
2.1.4 T淋巴细胞增殖实验 T淋巴细胞增殖实验结果如图2B所示。可以看出，在术后第1，4，8，12周，医用胶原海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组与假手术对照组、空白对照组的T细胞增殖刺激指数值接近(P > 0.05)；而前8周时，免疫抑制给药组的T淋巴细胞增殖刺激指数值同免疫刺激给药组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

这些结果表明，医用胶原海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组和空白对照组的淋巴细胞对刺激的反应性及功能状态相一致，即胶原蛋白海绵的埋植对大鼠T淋巴细胞增殖状态无明显影响。
2.1.5 免疫球蛋白含量检测免疫球蛋白含量变化的结果如图3A，B所示。可以看出，在术后第1，4，8，12周，医用胶原海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组与假手术对照组、空白对照组的血清IgG蛋白含量接近(P > 0.05)。同样，对IgM蛋白进行含量分析，亦显示出埋植组与对照组无明显差异。此外，对免疫刺激和免疫抑制组对比发现，免疫抑制给药组的血清IgM含量在前8周时显著低于免疫刺激给药组(P < 0.05)。以上血清免疫球蛋白含量统计结果表明，埋植医用胶原蛋白海绵对大鼠免疫球蛋白的分泌无明显影响。
2.1.6 补体C3蛋白含量检测从图3C中可以看出，术后第1，4，8，12周，医用胶原海绵高剂量埋植组、低剂量埋植组、假手术对照组及空白对照组的血清补体蛋白含量变化趋势较为一致。在4个时间点，6种不同大鼠处理方式的大鼠补体C3蛋白含量无明显差异。这样的结果表明，医用胶原蛋白海绵的埋植对大鼠体内补体C3蛋白含量无明显影响。

2.2 胶原蛋白海绵病毒灭活分析在此次胶原蛋白海绵的病毒灭活工艺验证中选择了可能存在污染及其相似病毒的代表性指示病毒：伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和脑心肌炎病毒。对不同病毒灭活时间的伪狂犬病毒滴度进行测试，其结果如图4所示。可以看出，经酸酶法工艺灭活的3批次胶原蛋白海绵样品均无可以检测到的病毒，可使伪狂犬病毒的滴度下降4个logs以上。对于未能检测到的病毒滴度样品进行敏感细胞接种，盲传3代[22，27]，结果未显示细胞病变。

类似地，对另外3种指示病毒进行病毒灭活检测，结果如图4所示。可以看出，胶原蛋白海绵经酸酶工艺灭活处理后，均无可以检测到的病毒，可使对应病毒的滴度下降4个logs以上。对于未能检测到的病毒滴度样品进行敏感细胞盲传3代，结果亦均未观察到细胞病变。
2.3 材料的生物相容性由大鼠皮下埋植实验与病毒灭活分析实验可得，实验规模化生产制备的胶原蛋白海绵具有良好的生物安全性。

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引言

手术止血在临床中一直扮演着不可或缺的角色，提供较为理想的止血过程不仅可避免患者因失血过多导致的休克乃至死亡，同时也为手术提供相对清晰的视野，利于手术过程的进行[1-2]。近年来，随着科技的快速发展，临床止血方面的研究应用也有着显著进步，涌现出了多种效果良好的止血材料。理想型的止血材料在实现快速、有效止血的同时，也需具良好的生物相容性和生物可降解性[3-4]。市面上呈现出了以医用胶原蛋白海绵、纤维素类、淀粉类等具有代表性的多样性可降解止血产品[5-7]。与其他止血类材料相比，胶原蛋白海绵具有良好的吸湿性、生物相容性及生物可降解性等性能[7-8]；而且，胶原蛋白也是人体含量最为丰富的蛋白，占人体蛋白含量的25%-30%[9-10]。多孔状的胶原蛋白海绵具有良好的吸水性能，可大量吸收血液中的水分，形成血痂堵塞血管；同时在发生血管损伤后，胶原蛋白可与血小板受体结合，从而促进血小板的黏附聚集，进而启动内源性止血机制，两者的有机结合了实现伤口的快速止血过程[3，11-14]。亦有研究表明，胶原蛋白能够促进成纤维细胞和巨噬细胞的迁移，刺激机体中胶原蛋白的再生及对细胞碎片的清理，从而促进组织的修复愈合[15-16]。胶原蛋白海绵在发挥良好的止血性能的同时，还可有效促进伤口的愈合[17-18]，因而在临床止血方面有着良好的应用前景。动物源性生物材料一般比非动物源性材料有更好的生物相容性，但也伴随着携带外源因子、病毒等的风险，因此对材料的免疫安全及病毒性检测评价尤为重要[19-21]。国家药品监督管理局为此制定了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，对产品的病毒感染风险方面进行了明确规定，病毒滴度需降低4个logs以上，表示病毒的灭活有效[22]。目前，虽然对胶原蛋白的提取研究较多且主要集中于基础实验研究，但对于大规模生产的海绵产品的性能研究甚少；此外，对于提取胶原蛋白的免疫原性和病毒灭活综合研究鲜有报道。实验以牛跟腱为原料，结合实际规模化生产过程，阐述胶原蛋白海绵的制备，并对其免疫安全性及酶酸法处理的病毒灭活状况进行评价。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料免疫原及安全性评价，实验数据采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点材料制备在杭州协合医疗用品有限公司，动物及病毒验证在中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，于2014年7月至2015年11月进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠96只，雌雄各半，体质量100-140 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK-(军)2012-0004。
1.3.2 主要材料、药物与试剂西咪替丁(海南制药厂有限公司，141106)；环磷酰胺(山西普德药业有限公司，04131201)；氯化钠(浙江省医药工业有限公司)；无水氯化钙、无水乙醇、冰乙酸、氢氧化钠及无水磷酸氢二钠(浙江常青化工有限公司)；胃蛋白酶(sigma公司)；牛跟腱(河南省伊赛牛肉股份有限公司)；注射用环磷酰胺(山西普德药业有限公司)；注射用西咪替丁(海南制药厂有限公司)；伴刀豆凝集素 A(sigma公司)；Rat IgG ELISA 试剂盒(eBioscience公司)；Rat IgM ELISA试剂盒(eBioscience公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI1640培养基(HyClone公司)。
1.3.3 主要仪器真空乳化搅拌机(TFZRJ-1000，温州天富机械有限公司)；冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司)；组织捣碎机(CB15E)，美国Waring)；不锈钢过滤器(定制)；不锈钢透析槽(定制)。
1.4 实验方法
1.4.1 胶原蛋白海绵的制备采用酸酶结合法从牛跟腱中提取胶原蛋白。首先进行牛跟腱预处理，剔除筋膜等杂质成分；其次，将牛跟腱切成薄片，依次经醋酸、体积分数75%乙醇和CaCl2溶液各浸泡清洗15 min，去除血色、并至无明显气味，再用组织捣碎机将切片粉碎；然后将牛跟腱经2%醋酸溶胀，5-10 ℃条件下胃蛋白酶消化酶解60-75 h；随后将酶解液经筛网过滤除去不溶性颗粒物；然后用醋酸溶液调整滤液呈中性(即胶原蛋白的等电点位置)，再经5 ℃左右低温过夜NaCl盐析；盐析后对上层析出物收集，并用100目绢丝挤干，然后再次粉碎并用醋酸溶液透析3次，每天更换一次透析液以除去NaCl，得到高纯度的胶原蛋白；透析完成后以10∶1比例添加PBS，进行装盘冻干，即得到胶原蛋白海绵。
将制备的胶原蛋白海绵裁切成50 mm×50 mm尺寸，并用铝箔袋于万级无菌车间进行内包，最后经电子束辐照灭菌后进行外包。
1.4.2 胶原蛋白海绵的免疫安全性检测通过向96只SPF级Wistar大鼠体内埋入胶原蛋白海绵来评价海绵材料的免疫安全性。首先经腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后腹部正中皮肤切口，埋植材料于皮下，最后缝合皮肤切口，并给予正常的饮水进食。设置了低剂量埋植组(埋植1片胶原蛋白海绵)、高剂量埋植组(埋植4片胶原蛋白海绵)、空白对照组(不做任何手术处理)、假手术对照组(不作埋植，其余操作与埋植组相同)、免疫抑制给药组(连续4 d腹腔注射西咪替丁200 mg/kg)及免疫刺激给药组(连续4 d腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg)，每组16只。
埋植1，4，8，12周后(每组每个时间点选4只大鼠)对大鼠体征、血常规、NK细胞杀伤活性(处死取出脾脏，制备脾淋巴细胞，按照效靶比40∶1加入到靶细胞K562细胞，采用流式细胞仪检测靶细胞的死亡率)、T淋巴细胞增殖、免疫球蛋白含量(心脏采血制备血清，然后用IgG及IgM试剂盒分别检测大鼠血清中IgG和IgM的蛋白含量)等指标进行测定。其中，T淋巴细胞增殖采用MTT法进行，先对从大鼠脾脏中获取的脾细胞进行计数，然后用培养基调整细胞浓度至2×109 L-1，接种于96孔板中；设置刺激组(加入20 mg/L的伴刀豆凝集素A)与未刺激组(无伴刀豆凝集素A加入)，在含有体积分数5%CO2的37 ℃培养箱中培养48 h；在培养结束前4 h向各孔板中加入5 g/L的MTT液，37 ℃培养4 h；之后吸取孔板中的液体并加入DMSO，每孔150 μL，震荡混匀后用酶标仪测量A值，最终结果以刺激指数表示。刺激指数=(刺激组A值-对照组A值)÷刺激组A值×100%。
1.4.3 胶原蛋白海绵的病毒灭活工艺验证受口蹄疫、疯牛病等高致病性传染病的影响，胶原蛋白的病毒灭活验证亦是对牛源提取胶原产物的重要评价手段。这里，选用理化性质具有代表性的伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和猪脑心肌炎病毒4种指示病毒(其中，伪狂犬病毒、猪细小病毒经猪肾传代细胞常规培养并产生细胞病变获取病毒株，水泡性口炎病毒经绿猴肾细胞常规培养并产生细胞病变获取病毒株，猪脑心肌炎病毒经仓鼠肾细胞常规培养并产生细胞病变获取病毒株)，对3批牛跟腱粉碎后中间体样品在不同时间点的灭活效果进行病毒灭活工艺验证研究。
取3批牛跟腱粉碎后中间体样品，按0.5 g样品加入3 mL指示病毒液浸泡于指示病毒中，室温放置60 min。然后取上述样品液，加入2%醋酸10 mL(每克样品加20 mL醋酸的比例)，在5 ℃水浴中溶胀30 min。再加入含胃蛋白酶的2%醋酸溶液3 mL(以1 g原始样品加入6 mL含胃蛋白酶的醋酸溶液计)，5 ℃条件下处理3 d，期间取出晃匀。以0，4，8，24，48，72 h为时间点取上步的混合样品，调节pH至中性，4 000 r/min离心15 min，取上清液，除菌过滤后在-70 ℃环境中保存，以用于检验酶酸处理不同时间的残余病毒滴度。
1.5 主要观察指标所制备的胶原蛋白海绵在植入大鼠体内后相关的免疫安全反应，以及胶原蛋白海绵经4种指示病毒验证的病毒灭活有效性。
1.6 统计学分析数据以x±s的形式表示，采用单因素方差(ANOVA)和最小显著性差异(LSD)检验。当P < 0.05时表示差异有显著性意义。使用SPSS 13.0 for Windows统计软件包。

讨论

胶原蛋白是人和动物体内含量较高的蛋白质，在动物皮层、软骨、肌腱等部位广泛存在[12]，其良好的生物相容性、可降解性、促进伤口愈合、美白保湿等优异性能使其在组织工程、医疗美容等行业有着广泛的关注和研究[7-8，28-29]；但其存在的免疫原性也可能导致机体的过敏、排斥等免疫反应，势必对其实际应用造成不良影响[30-31]。胶原蛋白存在的免疫原性作用位点主要为末端的非螺旋区，在胶原蛋白的提取过程中亦有杂蛋白及外源DNA等免疫原性物质的残留等[31-32]。SHINICHIRO团队对去除端肽后的胶原蛋白的免疫原性进行了研究，结果发现，不经化学修饰作用的去端肽胶原蛋白对人及动物的外周血单核细胞不产生任何免疫刺激[33]。疯牛病、口蹄疫以及禽流感等疾病的流行引起人们对动物源性胶原蛋白生物医学应用的担忧，因此需要对提取的胶原产品中潜在的病毒进行有效的消除[34-35]。
常见的胶原蛋白提取方法包括酸法、中性盐溶法及酸-酶结合法等，而酸-酶结合法是提取高纯度非变性胶原蛋白最常用的方法[36-38]。首先经醋酸处理使可溶性胶原蛋白从牛跟腱中溶出，再结合胃蛋白酶将不溶性胶原蛋白酶解提取；同时用胃蛋白酶来实现胶原蛋白中非螺旋区端肽的去除，以此来消除胶原蛋白末端的免疫原性；此外，由于动物源性组织潜在的病毒威胁，采用酸酶结合法对提取的胶原蛋白海绵的病毒灭活有效性进行了验证。
此次实验在前期研究的基础上对工艺进行放大，以实现规模化工业生产胶原蛋白海绵制品，从牛跟腱的预处理开始到海绵内包完成，整个阶段均在万级无菌车间进行，最后再经辐照灭菌和外包，得到成品。对规模化生产的胶原蛋白海绵产品进行相关的生物学性能评价，更具有实际应用的客观性。从工业化生产的角度研究所提取的胶原蛋白海绵的生物安全性。对于动物源性材料，免疫原性及潜在的病毒传播关系到其应用的重要因素，此次实验从免疫安全性及可能携带的病毒威胁两方面对制备的胶原蛋白的生物安全性能进行综合研究，为临床研究奠定坚实的基础，沟通起基础研究到临床应用的跨度。
NK细胞为机体非特异性免疫的一种主要细胞，可通过直接溶解以及参与细胞因子的分泌来杀伤肿瘤细胞等[39-40]。正常生理状态下，靶细胞表面的自身MHC-Ⅰ类分子与NK细胞表面抑制性受体结合传导抑制性信号，从而抑制NK细胞功能，靶细胞不受NK细胞攻击；而在病理状态下这种平衡被打破，NK细胞可能对靶细胞行使杀伤功能[41]。故此，取脾脏细胞进行NK细胞的杀伤活性测试。在体外实验时，T淋巴细胞经某些物质刺激后细胞的代谢、形态等相继发生变化，并伴随着细胞内蛋白和核酸合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显及染色质疏松等现象[42]。体液免疫主要由B细胞介导，即在T细胞辅助下，接受抗原的刺激后B细胞开始一系列增殖、分化，形成记忆细胞和浆细胞，浆细胞产生的抗体与抗原特异性结合，从而完成免疫过程。免疫球蛋白检测的意义在于机体在抗原刺激下产生的自身抵抗，其含量的波动与疾病状态有关。补体是除了免疫球蛋白外的另一种参与免疫反应的大分子物质。对于Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应的自身免疫疾病中，活动期补体额消耗增加导致补体C3含量下降，随着疾病的缓解补体可恢复至正常水平，因此从补体的变化可以了解疾病的进展及治疗效果。基于此，对所制备的胶原蛋白海绵进行了相关的免疫原性研究。
实验将所制备的胶原蛋白海绵植入大鼠体内，测量了在埋植胶原蛋白海绵不同时间的各组大鼠体征饮食状态、血常规、NK细胞杀伤活性等参数，结果表明胶原蛋白海绵的埋入没有对大鼠的生长和固有免疫功能产生明显影响；同时通过T淋巴细胞增殖、补体C3蛋白含量、免疫球蛋白IgG和IgM含量等检测胶原蛋白海绵对大鼠免疫细胞的作用，结果表明胶原蛋白的埋植对这些指标不产生明显影响，即胶原蛋白海绵在大鼠体内的免疫原性较低。此外，对胶原蛋白海绵进行病毒灭活工艺验证，结果显示经酸酶结合法处理制备的胶原蛋白海绵均无可以检测到的伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和猪脑心肌炎病毒指示病毒，可使伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和猪脑心肌炎病毒的滴度下降4个logs以上；而且经敏感细胞盲传3代，亦未观察到细胞病变。表明所制备的胶原蛋白海绵经酸酶法工艺灭活上述4种指示病毒有效。
从工业生产和实际应用角度出发，经过长期实践将基础研究进行工艺放大，形成稳定的胶原蛋白海绵规模化生产工艺。沟通起基础实验研究到商品化生产的到临床的跨度，在万级无菌车间中经酸酶法提取胶原蛋白，并通过冷冻干燥制备出胶原蛋白海绵。根据需要对胶原蛋白海绵裁切成特定的规格型号，经内包、辐照灭菌和产品外包后得到胶原蛋白海绵成品。对所制备的胶原蛋白海绵进行了免疫安全性研究和病毒灭活工艺验证，结果表明对大鼠无明显的免疫毒性，无明显的不良免疫反应；并且经酸酶工艺灭活伪狂犬病毒、水泡性口炎病毒、猪细小病毒和猪脑心肌炎病毒4种指示病毒有效，证明了所制备的医用胶原蛋白止血海绵具有良好的生物安全性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

胶原蛋白海绵的制备及安全性评价

Fabrication and safety evaluation of collagen sponge

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