过氧乙酸/乙醇对异体皮性能的影响

doi:10.12307/2022.200

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (10): 1537-1543.doi: 10.12307/2022.200

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

过氧乙酸/乙醇对异体皮性能的影响

胡凯1，2，陈维明1，2，骆井万1，2，李淼1，2，汪晶晶1，2，李矛3，沈亚俊4，陈金发2，白玉龙1，2

1常州市亘从生物力学研究中心，江苏省常州市 213003；2上海亚朋生物技术有限公司，上海市 201201；3首都医科大学附属北京同仁医院，北京市 100730；4首都医科大学附属北京口腔医院，北京市 100050

收稿日期:2020-11-05 修回日期:2020-11-06 接受日期:2020-12-07 出版日期:2022-04-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 白玉龙，常州市亘从生物力学研究中心，江苏省常州市 213003；上海亚朋生物技术有限公司，上海市 201201
作者简介:胡凯，男，1993年生，安徽省安庆市人，汉族，2019年上海师范大学毕业，硕士，主要从事生物医用材料的研究与转化
基金资助:
2020年上海市科技型中小企业技术创新资金(200H1029400)，项目负责人：陈维明

Effect of peracetic acid/ethanol on the properties of allogeneic skin

Hu Kai1, 2, Chen Weiming1, 2, Luo Jingwan1, 2, Li Miao1, 2, Wang Jingjing1, 2, Li Mao3, Shen Yajun4, Chen Jinfa2, Bai Yulong1, 2

1Changzhou Gencong Biomechanics Research Center, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China; 2Shanghai Yapeng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201201, China; 3Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China; 4Beijing Dental Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

Received:2020-11-05 Revised:2020-11-06 Accepted:2020-12-07 Online:2022-04-08 Published:2021-10-25
Contact: bai yulong, Changzhou Gencong Biomechanics Research Center, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China; Shanghai Yapeng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201201, China
About author:Hu Kai, Master, Changzhou Gencong Biomechanics Research Center, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China; Shanghai Yapeng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201201, China
Supported by:
Technology Innovation Fund for Small and Medium-sized Science and Technology Enterprises in Shanghai in 2020, No. 200H1029400 (to CWM)

摘要/Abstract

摘要： 文题释义：
异体脱细胞真皮基质：取材于人类捐献者的新鲜皮肤，采用物理、化学及生物等方法除去了皮肤的表皮及可引起宿主免疫排斥反应的细胞和脂肪等成分，得到的一种真皮细胞外基质，其具有人类皮肤相似的结构和组成，生物相容性好，具有一定的力学性能，能够用于疝修补、医美等领域。
异体皮敷料：取材于人类捐献者的新鲜皮肤，采用物理、化学及生物等方法除去了皮肤中可引起宿主免疫排斥反应的细胞和脂肪等物质及灭活病原微生物和细菌。异体皮敷料用作烧伤、创伤创面暂时性覆盖，可有效阻隔外界接触，为创面局部提供了一个生理环境，防止创面干燥和过湿，促进正常宿主抗微生物能力和创面愈合能力。因此，异体皮敷料的表皮完整性、无细胞毒性是关键。

背景：过氧乙酸/乙醇是一种理想的动物源及同种异体组织病毒灭活试剂，其对病原微生物杀灭效果显著，但是未见其对异体皮其他性能影响的研究报道。
目的：研究过氧乙酸/乙醇处理对异体皮性能的影响。
方法：配制3种不同浓度的过氧乙酸/乙醇溶液，2.3 g/L过氧乙酸+体积分数24%乙醇(设为P/E-1)、1.8 g/L过氧乙酸+体积分数4.8%乙醇(设为P/E-2)、15.33 g/L过氧乙酸+体积分数24%乙醇(设为P/E-3)。采用不同浓度的过氧乙酸/乙醇溶液分别处理异体皮15，30，45，60 min，通过外观、组织学染色、力学性能、糖胺聚糖含量检测等评价皮肤结构性能变化，并检测经处理后皮肤的化学试剂残留情况和细胞毒性。

结果与结论：①各浓度过氧乙酸/乙醇溶液处理不同时间的异体皮外观无明显差异；②苏木精-伊红染色显示，与未处理的异体皮相比，P/E-1与P/E-2处理15 min后的皮肤细胞外基质结构无明显变化，处理15 min以上的皮肤细胞外基质结构相对疏松，但保留了结构的完整性；P/E-3处理15 min时，皮肤真皮层中出现大孔，处理15 min以上后真皮层出现较多孔洞，细胞外基质结构被严重破坏；③同一浓度溶液处理下，处理时间越长，皮肤的糖胺聚糖含量、拉伸强度和弹性模量越低；相同处理时间下，P/E-1处理组拉伸强度最大、P/E-3处理组最小，P/E-2处理组断裂伸长率最大、P/E-3处理组最小，P/E-3处理组韧性最小；④试剂残留检测显示，过氧乙酸和乙醇可从异体皮去除，残留量在规定的限度要求内，无明显的细胞毒性；⑤结果显示在相同的处理时间下，P/E-1组皮肤的性能及结构与原材料最接近。

https://orcid.org/0000-0003-1694-7779 (胡凯)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 病毒灭活, 异体皮, 脱细胞真皮基质, 过氧乙酸/乙醇法

Abstract: BACKGROUND: The peracetic acid/ethanol is an ideal reagent for inactivating viruses of animal derived tissues and allogeneic tissues. It is effective in killing pathogenic microorganisms. However, its effect on other properties of allogeneic skin has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of peracetic acid/ethanol treatment on the performance of allogeneic skins.
METHODS: Three different concentrations of peracetic acid/ethanol solutions were prepared, which were 2.3 g/L peracetic acid + 24% v/v ethanol (set as P/E-1), 1.8 g/L peracetic acid + 4.8% v/v ethanol (set as P/E-2) and 15.33 g/L peroxyacetic acid + 24% v/v ethanol (set as P/E-3). Allogeneic skin was treated with different concentrations of peracetic acid/ethanol for 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively. The structural properties of the skin were evaluated via appearance, histological staining, mechanical test and glycosaminoglycan content test. Besides, chemical reagent residues and cytotoxicity in the treated skin were also studied.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) No significant difference in the epidermal appearance of skin were observed at all investigated concentrations of peracetic acid/ethanol. (2) Hematoxylin-eosin staining showed no obvious changes in the extracellular matrix structure of skin after 15 minutes of P/E-1 and P/E-2 treatment compared with untreated allogeneic skin, and the extracellular matrix structure of skin treated with more than 15 minutes was relatively loose which preserved an integral structure. However, microporous appeared in the dermis while it was treated for 15 minutes, especially after 15 minutes, more holes appeared in the dermis and the extracellular matrix structure was seriously destroyed. (3) The longer the treatment time at the same concentration, the lower the glycosaminoglycan content and the lower the mechanical strength and modulus. With the same treatment time, the tensile strength of the P/E-1 treatment group was the largest, while the P/E-3 treatment group was the smallest; the elongation at break of the P/E-2 treatment group was the largest, while the P/E-3 treatment group was the smallest; and E-3 treatment group had the least toughness. (4) Reagent residual assay showed that peracetic acid and ethanol have been verified to be removed from the allogeneic skin after washing, with low cytotoxicity within limits required. (5) The results displayed under the same processing time, the skins of P/E-1 group have the closest properties and structure compared to the raw material.

Key words: material, virus inactivation, allogeneic skin, acellular dermal matrix, peracetic acid-ethanol

中图分类号:

胡凯, 陈维明, 骆井万, 李淼, 汪晶晶, 李矛, 沈亚俊, 陈金发, 白玉龙. 过氧乙酸/乙醇对异体皮性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1537-1543.

Hu Kai, Chen Weiming, Luo Jingwan, Li Miao, Wang Jingjing, Li Mao, Shen Yajun, Chen Jinfa, Bai Yulong. Effect of peracetic acid/ethanol on the properties of allogeneic skin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(10): 1537-1543.

图/表（结果） 6

2.1 各组异体皮的形貌观察 4组不同处理时间的异体皮的外观图如图1所示，浸泡一定时间后对表皮进行拍照观察，经处理表皮外观与P/E-0组无大差异，说明过氧乙酸和乙醇浸泡对异体皮的表皮无影响。

对处理后的皮肤组织进行苏木精-伊红染色，结果如图2所示。从图中可以看出，相比于P/E-0组，P/E-1、P/E-2组处理15 min后皮肤的细胞外基质结构无较大差异，处理15 min以上皮肤的细胞外基质结构相对疏松，但还是保留了结构的完整性；P/E-3组在处理15 min时真皮层中出现大孔，处理15 min以上后真皮层出现较多孔洞，细胞外基质结构被严重破坏；此外还可以看出，所有异体皮在处理后真皮层和表皮层之间未见空隙，表明表皮层仍与真皮层相连。

2.2 各组异体皮的力学性能处理15，45 min主要是判断表皮和微观结构的变化，通常情况下过氧乙酸/乙醇病毒灭活时间为30 min或60 min，在此也只进行这两个时间段的拉伸性能检测。4组材料的力学性能检测结果如图3所示，总体上，过氧乙酸/乙醇浸泡后的皮肤拉伸强度、拉伸模量和韧性均有所下降；同一组中，过氧乙酸/乙醇处理时间越长拉伸性能越差。
拉伸强度：相同处理时间下，3个处理组的拉伸强度与P/E-0组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；处理30 min时，P/E-1组、P/E-2组与P/E-3组的拉伸强度比较差异有显著性意义(P < 0.05)；P/E-2组处理30 min与处理60 min的拉伸强度比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
断裂伸长率：相同处理时间下，3个处理组的断裂伸长率与P/E-0组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；处理
30 min时，P/E-2组与P/E-3组的断裂伸长率比较差异有显著性意义(P < 0.05)；处理60 min时，P/E-1组、P/E-2组与P/E-3组的断裂伸长率存在明显差异(P < 0.05)；P/E-3组处理30 min
与处理60 min的断裂伸长率比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
弹性模量：除了P/E-1组(处理30 min)、P/E-3组(处理60 min)外，其余组的弹性模量与P/E-0组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；处理30 min时，P/E-1组与P/E-2组的弹性模量比较差异有显著性意义(P < 0.05)；处理60 min时，P/E-1组、P/E-2组与P/E-3组弹性模量比较差异有显著性意义(P < 0.05)；P/E-1组处理30 min与处理60 min的弹性模量比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
韧性：除了P/E-1组(处理30 min)外，其余组的韧性与P/E-0组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；处理60 min时，P/E-1组、P/E-2组与P/E-3组的韧性比较差异有显著性意义
(P < 0.05)。

2.3 各组异体皮的糖胺聚糖含量检测结果处理15，45 min主要是判断表皮和微观结构的变化，通常情况下过氧乙酸/乙醇病毒灭活时间为30 min或60 min，在此只进行这两个时间段的糖胺聚糖含量检测。4组皮肤的糖胺聚糖含量检测结果如图4所示，处理30 min时，P/E-2组的糖胺聚糖含量最高，P/E-3组与P/E-0组的糖胺聚糖含量比较差有显著性意义(P < 0.05)，P/E-2组与P/E-3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；处理60 min时，各处理组与P/E-0组的糖胺聚糖含量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；P/E-3组处理30 min与处理60 min的糖胺聚糖含量比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 各组经处理后异体皮的化学残留量各处理组异体皮均浸泡于过氧乙酸/乙醇混合溶液中，经过清洗处理后皮肤中的过氧乙酸含量分见表1。

可以看出，3组样品中过氧乙酸水平由小到大依次为P/E-1组、P/E-2组、P/E-3组，其中，P/E-1组、P/E-2组与P/E-3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
3组处理样品中乙醇质量浓度由小到大依次为P/E-2、P/E-1、P/E-3，P/E-2低于25 mg/L，P/E -1组在低于25-50 mg/L之间，P/E-3组在500-5 000 mg/L之间。
2.5 各组经处理后异体皮的细胞毒性检测结果各处理组异体皮经过清洗处理后的细胞毒性检测结果见图5，各组细胞形态良好，细胞存活率均大于80%，细胞毒性分级不大于1级。

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2020年7-11月在上海亚朋生物技术有限公司研发实验室完成。
1.3 材料异体皮由上海亚朋生物技术有限公司提供，实验中使用的异体皮经过切除脂肪处理，保留了真皮层和表皮层，其厚度为0.5-0.7 mm。
过氧乙酸(≥15%，上海哈勃化学技术有限公司)；无水乙醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；α-MEM 培养基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone)；摇床(YQI-II，江苏东鹏仪器制造有限公司)；光学显微镜(Nikon Eclipse E100，尼康，日本)；电子万能实验机(CTM8010，上海协强仪器制造有限公司)；冷冻干燥机 (FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司)；多功能酶标仪(INFINITE 200 PRO，TECAN，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 过氧乙酸/乙醇处理皮肤配制3种浓度的过氧乙酸/乙醇溶液，P/E-1：过氧乙酸质量浓度2.3 g/L，乙醇体积分数为24%；P/E-2：过氧乙酸质量浓度1.8 g/L，乙醇体积分数为4.8%；P/E-3：过氧乙酸质量浓度15.33 g/L，乙醇体积分数为24%。未经试剂处理组记为P/E-0。
将异体皮浸没于盛有过氧乙酸/乙醇溶液的碘量瓶中，置于摇床中(25 ℃)180 r/min分别震荡15，30，45，
60 min；然后取出异体皮，置于盛有纯水的碘量瓶中，在摇床中(25 ℃)180 r/min震荡15 min，倒去纯水；再加入等量的纯水，重复上述操作3次。其中异体皮与纯水的料液比为1 cm2 ∶5 mL。
1.4.2 处理前后皮肤的形貌观察
外观：在过氧乙酸/乙醇处理前后对异体皮拍照，大体观察处理前后皮肤的外观形貌。
组织学检测：将4组样品用固定液固定24 h，切取
5 mm×5 mm装入脱水盒进行脱水、石蜡包埋、切片处理，切片厚度为5 μm。苏木精-伊红染色后每个切片选3个视野，在200倍光学显微镜下观察组织结构并进行图像采集。
1.4.3 处理前后皮肤的力学性能检测 4组样品的尺寸(长、宽和高)均使用游标卡尺测量。使用电子万能实验机在室温下进行拉伸实验，拉伸速率为20 mm/min，夹持器间的初始距离为25 mm。拉伸强度为样品的最大拉伸强度，断裂伸长率为最大拉伸强度时对应的应变，拉伸模量为应力-应变曲线上线性部分的斜率，范围为最大载荷的20%-50%。韧性定义为应力-应变曲线所围面积，由Origin software计算得出。每组4个平行样，结果取平均值。
1.4.4 处理前后皮肤的糖胺聚糖含量检测将4组待测样品置于冷冻干燥机内24 h去除水分，并称取一定质量的干组织，加入蛋白酶K 100 μL、蛋白酶K缓冲液200 μL和焦碳酸二乙酯水800 μL至最终反应体积为1 110 μL，水浴锅至样品完全消化，消化液作试样液进行糖胺聚糖含量检测。
糖胺聚糖含量检测原理如BRIAN等[17]报道，采用二甲基亚甲基蓝分光光度法测定。先配制500 mL的PBE缓冲液(Na2HPO4 7.1 g，Na2EDTA 1.86 g)，HCl调节pH值至6.5±0.1；再配制1 000 mL的DMMB溶液(HCl 95 mL，glycine 3.04 g，NaCl 2.37 g，DMMB 16 mg)，HCl调节pH值至3；配制糖胺聚糖标准工作液(Cysteine-HCl 17.5 mg，PBE缓冲液
10 mL，糖胺聚糖200 mg)。以糖胺聚糖标准工作液为母液，用PBE进行稀释，配制糖胺聚糖梯度溶液。再以糖胺聚糖溶液∶2.3 mol/L NaCl溶液 ∶DMMB溶液为25 μL∶5 μL∶
200 μL的体积比配制检测液，以520 nm为吸收波长，用酶标仪进行吸光度检测，得出糖胺聚糖标准线性方程。再将样品溶液按照糖胺聚糖溶液：2.3 mol/L NaCl溶液∶DMMB溶液为25 μL∶5 μL∶200 μL的体积比进行检测，代入标准曲线得出溶液糖胺聚糖浓度，换算成材料干质量糖胺聚糖含量。每组3个平行样，结果取平均值。
1.4.5 处理后皮肤的化学残留量检测仅检测处理60 min的3组实验样品，将样品分别置于15 mL离心管中，按照
3 cm2/mL的料液比加入纯水，在37 ℃、200 r/min条件下摇床震荡72 h，取浸提液作为试样液进行检测。
过氧乙酸：过氧乙酸残留检测参照碘量法[18]，即检测试样液中的强氧化物(过氧乙酸)含量。取试样液1 mL于100 mL容量瓶中，用纯水稀释至25 mL，在瓶中加入10%硫酸溶液5 mL、100 g/L碘化钾溶液5 mL、3%钼酸铵溶液3滴，混匀，置于暗处10 min后，加水50 mL，再加入10 g/L淀粉指示剂0.5 mL，溶液变蓝。滴加0.01 mol/L硫代硫酸钠标准溶液至蓝色消失，记录消耗的硫代硫酸钠标准溶液毫升数(V)，按照公式计算试样液中的过氧乙酸含量：
X=V×0.01×38.03×1 000 (mg/L)
其中，38.03为与1.00 mL硫代硫酸钠标准溶液相当的过氧乙酸质量(mg)。每组检测样品3个平行样，结果取平均值。
乙醇：乙醇残留检测参照《中华人民共和国药典》(2015版)第四部康卫皿扩散法，此法为半定量法，但实验设置多组浓度的乙醇标准溶液，通过测定标准溶液的吸光度来确定试样液中乙醇的浓度范围。配制的乙醇标准溶液质量浓度分别为5 000，500，250，50，25 mg/L，作为标准溶液。具体步骤：在康卫皿外圈均匀涂抹凡士林，量取重铬酸钾-硫酸溶液2.0 mL加入内圈中，量取饱和碳酸钠溶液1.5 mL加入到外圈中，再加入检测溶液于外圈，立即加盖玻璃板(粗糙面向下)密封扩散皿，摇匀。在水浴锅中80 ℃反应30 min后，取内圈溶液100 μL于96孔板中，用酶标仪在波长650 nm处测定吸光度值。其中，检测溶液为乙醇标准溶液和试样液。所有检测一次完成，保证实验结果具有可比性。
1.4.6 处理后皮肤的细胞毒性检测将处理60 min并清洗后的3组异体皮，经25 kGy辐照灭菌后按照GB/T 16886.5-2017
进行细胞毒性检测。按照皮肤产品的使用方式，先将产品在无菌生理盐水中浸泡30 min再进行浸提，浸提比为3 cm2/mL，
浸提介质为含体积分数10%胎牛血清的α-MEM 培养基，浸提温度为(37±1) ℃，浸提时间(24±2) h。
将小鼠成纤维细胞(上海亚朋生物技术有限公司提供)在补充有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM 培养基中培养，并置于37 ℃、体积分数5%CO2 的湿度培养箱中。使用0.25%胰蛋白酶溶液传代细胞。将100 μL的L929细胞悬浮液接种于96 孔板中，细胞浓度为1.0×108 L-1，
待到孔板中细胞长满后弃去培养基，用PBS洗涤孔2次，然后加入100 μL试样液(阴性对照组加入新鲜培养基)。继续培养24 h后吸出培养基，将细胞与50 μL的1 g/L MTT溶液共培养4 h，然后除去MTT溶液，将100 μL异丙醇加入到每个孔中。使用酶标仪在570 nm 波长下测量吸光度(A值)，计算细胞存活率：细胞存活率=100×A570e÷A570b，其中A570e为实验样品100%浸提液吸光度，A570b为阴性对照样品吸光度。按照GB/T 16886.5-2017规定，存活率在80%以上为实验样品无细胞毒性作用。
1.5 主要观察指标经不同浓度过氧乙酸/乙醇处理后皮肤的结构性能变化和细胞毒性。
1.6 统计学分析所有结果表示为x±s，并通过单尾Student-t检验评估两组之间的显著性差异。显著性差异值分别设置为P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001。

讨论

异体皮产品主要分为两类，一类是异体脱细胞真皮基质，另一类是带有表皮层和真皮层的异体皮敷料，两类产品结构不同用途也有差异，导致其对性能的要求也不尽相同。从结构上看，异体皮敷料包括表皮层和真皮层，真皮基质仅存在真皮层，因此，此处所用的异体皮为异体皮敷料。
根据法规要求，病毒灭活工艺验证的指示病毒应至少包括人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的指示病毒及非包膜病毒[19]，在此基础上再综合考虑产品用途及加工方式，选择合适的病毒灭活方法。异体皮是一种软组织，无法耐受热灭活法的高温环境，且不适于采用气体如环氧乙烷和过氧化氢等病毒灭活方法。乙醇对包膜病毒具有足够活性的证据非常广泛，对非包膜病毒如猪细小病毒、脊髓灰质炎病毒的杀伤力有限[20]。低pH值(3-5)对胶原膜的病毒灭活时间过长[21]。过氧乙酸/乙醇法的优点在于灭活的病毒种类较多[14-16]，且有研究表明，异体皮胶原蛋白对过氧乙酸/乙醇的病毒灭活能力无影响[16]，但是过氧乙酸/乙醇对异体皮性能的影响尚不清楚。基于此，采取调节过氧乙酸/乙醇浓度和浸泡时间的处理方式，对异体皮的外观、微观形貌、力学性能及清洗后的化学残留和细胞毒性进行了探究。
使用化学试剂进行病毒灭活时需要选择合适的浓度和处理时间，从而保证产品的安全性和有效性，这是至关重要的。过氧乙酸的病毒灭活能力已被证实，EDUARD等[22]研究表明，过氧乙酸浓度为80×10-6时对人类诺如病毒具有杀伤效果；AMTMANN等[23]使用一定浓度的过氧乙酸对锦鲤疱疹病毒和病毒性出血性败血病病毒处理，发现过氧乙酸浓度在大于0.1%体积分数时可灭活这两种病毒，而浓度低于0.01%时两种病原体的滴度降低幅度约为或小于两个幅度；JEONG等[24]进行了过氧乙酸梯度浓度实验，证明在0-500×10-6范围内，鼠诺如病毒1滴度随过氧乙酸浓度的升高而下降越大。过氧乙酸灭活病毒的原理是其强氧化性能够破坏病毒的蛋白质。病毒暴露在溶液中相对容易灭活，但是在同种异体组织中病毒灭活相对困难，因为过氧乙酸需要渗入组织内部。乙醇可降低溶液的表面张力，促进溶液渗透进入组织，因此常用过氧乙酸和乙醇联合使用灭活同种异体组织病毒。
有文献报道，0.2%过氧乙酸/体积分数24%乙醇溶液可在5 min后完全灭活同种异体肌腱中的人类免疫缺陷病毒，在30 min后猪细小病毒、伪狂犬病毒和牛病毒性腹泻病毒滴度下降达到灭活要求[14]。相比于同种异体肌腱，过氧乙酸/乙醇对猪小肠黏膜进行病毒灭活的浓度更低，0.18%过氧乙酸/体积分数4.8%乙醇溶液可在30 min内灭活猪细小病毒、伪狂犬病毒和鼠白血病反转录病毒[25]。对同种异体骨来说，刘明等[26]使用10 g/L过氧乙酸/体积分数24%乙醇浸泡4 h才能够将猪细小病毒、伪狂犬病毒和牛病毒性腹泻病毒灭活。不同组织中，过氧乙酸/乙醇病毒灭活的浓度是有差异的，过氧乙酸/乙醇溶液对不同组织进行病毒灭活的时间也有所不同。对于异体皮而言，影响过氧乙酸/乙醇渗透的主要因素是其厚度和组分。首先，猪小肠黏膜与皮肤结构相似，厚度相仿，且SVEN等[16]研究表明胶原蛋白对过氧乙酸的病毒灭活能力没有不利影响，参照此浓度，实验采用1.8 g/L过氧乙酸和体积分数4.8%乙醇对异体皮进行了浸泡处理；其次，相比于同种异体肌腱，异体皮的厚度更薄、结构相对疏松，理论上是更易于过氧乙酸/乙醇渗透，因此也选择0.2%过氧乙酸/体积分数24%乙醇(即2.3 g/L过氧乙酸/体积分数24% 乙醇)作为研究浓度。考虑到过氧乙酸浓度越高更易于灭活病毒[24]，在此设置高浓度过氧乙酸溶液组(15.33 g/L过氧乙酸/体积分数24%乙醇)对异体皮进行浸泡处理，探究过氧乙酸/乙醇对异体皮的性能影响。前期研究表明，30 min内过氧乙酸/
乙醇能够灭活大部分病毒，此处将处理时间定为60 min，当满足异体皮的病毒灭活时间。
异体皮敷料具有表皮层，表皮对多种物理和化学性刺激有很强的耐受力，能阻挡异物和病原侵入、防止组织液丧失，表皮结构完整才能够保证敷料用作表面覆盖物 [27]。实验结果显示，异体皮处理前后外观无明显差异，说明3种浓度下的过氧乙酸/乙醇对表皮无影响，满足异体皮敷料的表皮完整性要求。与P/E-0 组比较，P/E-1组、P/E-2组皮肤的细胞外基质结构相对疏松，但仍保留了细胞外基质结构的整体结构。SHIUHYANG等[28]指出相对疏松的结构可以提供合适的空隙，利于细胞的渗透。但是此次实验P/E-3组皮肤细胞外基质结构破坏严重，对异体脱细胞真皮基质而言，维持其细胞外基质结构能够为细胞生长提供合适的环境，有助于伤口愈合[29]。WANG等[30]研究也表明，细胞外基质对成纤维细胞的生长具有促进作用。P/E-3组浓度下的过氧乙酸/乙醇显然不适合用于脱细胞真皮，对于细胞外基质结构破坏，可能是由于过氧乙酸在常温下易挥发且分解生成O2所致。张帅[31]的研究显示，15%的过氧乙酸在2 h、20 ℃时可分解产生9.440 mg/L
的O2，在3 h、30 ℃时可分解产生13.585 mg/L的O2。P/E-1组、P/E-2组的过氧乙酸含量相对较少，P/E-3组的过氧乙酸含量较多，无论是挥发还是分解程度远大于另两个实验组，对细胞外基质的破坏则更大。实验组细胞外基质结构被破坏，导致实验组异体皮力学性能有所变化，原材料组(P/E-0)的强度、模量和韧性均大于实验组。与文献报道的人皮肤拉伸强度(12.76±1.60) MPa和弹性模量(48.63±5.50) MPa相比[32]，P/E-0组的异体皮拉伸强度和弹性模量分别为(22.48±1.53)，(51.29±16.94)MPa，P/E-0组的异体皮拉伸强度要更大。在此情况下，处理30 min的P/E-1、P/E-2组皮肤拉伸强度均大于文献报道，但是弹性模量低于文献报道。当然，乙醇的存在也对皮肤的力学性能有所影响，乙醇能够使胶原蛋白等蛋白质肽链间生成氢键而使力学性能有所变化[33-34]。P/E-1组、P/E-3组的乙醇体积分数均为24%，P/E-2组的乙醇体积分数为4.8%，在此情况下P/E-1、P/E-3组发生交联的程度大于P/E-2组，结果体现在P/E -1组的强度和弹性模量均高于P/E-2组，P/E-3组的弹性模量大于P/E-2组的原因可能是乙醇处理后P/E-3组皮肤的刚度得到了增强[35]。P/E-3组的强度、断裂伸长率和韧性最差，是由于细胞外基质结果破坏太严重导致。此外研究表明，真皮层含有的糖胺聚糖除了能够促进创面愈合外[35]，糖胺聚糖含量还与杨氏模量呈正相关[36]。P/E-3组处理60 min后的皮肤糖胺聚糖含量显著下降(P < 0.01)，而另外两处理组的糖胺聚糖含量无显著下降，从这一点看，过氧乙酸浓度过高、处理时间过长会降低皮肤中糖胺聚糖含量，也导致模量降低。为确保医疗产品的安全性、有效性，应对制备过程中引入的化学试剂进行控制。3组异体皮的过氧乙酸残留量高低依次为P/E-1组、P/E-2组、P/E-3组，乙醇残留量高低依次为P/E -2组、P/E -1组、P/E-3组，结果符合各组化学试剂浓度关系。此次实验中过氧乙酸残留量相比文献报道过氧乙酸在同种异体组织移中的残余量限度5×10-6略
高[37-38]，但是细胞毒性分级不大于1级，可能的原因是：在进行细胞毒性前参考敷料产品临床使用情况，材料先使用无菌生理盐水清洗半小时后再做浸提，且浸提液与细胞仅作用1 d；检测所用样品在提取浸提液时，在37℃、200 r/min条件下摇床震荡72 h，故此数值要高，当然在清洗过程中异体皮仅清洗了1 h，为保证异体皮残留量不高于过氧乙酸溶液的细胞毒性浓度1×10-6 [38]，可在生产过程中延长清洗时间。
综上所述，实验通过调节浓度和处理时间探究过氧乙酸/
乙醇对异体皮的性能影响，为其作为异体皮肤的病毒灭活试剂提供借鉴和指导。结果表明，处理时间越长异体皮的性能越差；相同处理时间下，P/E-1组皮肤的性能与结构相较于原材料最接近。合理选择过氧乙酸/乙醇对异体皮产品的生产至关重要。异体皮的两类产品中，异体脱细胞真皮基质因无表皮层，在生产过程中化学试剂的渗透效率高于异体皮敷料，为保证产品性能如细胞外基质结构、力学性能、糖胺聚糖含量等，化学处理的时间可相应缩短。异体皮敷料最主要的功能是创面覆盖，表皮层应当确保完整，在此基础上可以增加化学试剂浓度，提高化学试剂的渗透效率，以保证病毒灭活效果。实验尚有不足之处，未对异体皮在过氧乙酸/乙醇不同浓度和时间下的病毒灭活效果进行验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

过氧乙酸/乙醇对异体皮性能的影响

Effect of peracetic acid/ethanol on the properties of allogeneic skin

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