医用胶原蛋白海绵外敷糖尿病足溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶2，9的变化

doi:10.12307/2022.201

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (10): 1544-1550.doi: 10.12307/2022.201

• 细胞外基质材料 extracellular matrix materials • 上一篇下一篇

医用胶原蛋白海绵外敷糖尿病足溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶2，9的变化

赵紫熙，徐俊，丁敏，李喜文，张靖航，王鹏华

天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津市内分泌研究所，国家卫健委激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室，天津市 300134

收稿日期:2020-10-15 修回日期:2020-10-17 接受日期:2020-11-25 出版日期:2022-04-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 王鹏华，硕士，主任医师，硕士生导师，天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津市内分泌研究所，国家卫健委激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室，天津市 300134
作者简介:赵紫熙，女，1989年生，辽宁省海城市人，汉族，天津医科大学在读硕士，医师，主要从事糖尿病及糖尿病足诊治研究
基金资助:
国家自然科学基金委员会项目(81670766)，项目负责人：王鹏华

Changes of type I and III collagen and matrix metalloproteinase 2 and 9 on the wound of diabetic foot ulcer with external application of medical collagen dressing

Zhao Zixi, Xu Jun, Ding Min, Li Xiwen, Zhang Jinghang, Wang Penghua

Key Laboratory of Hormone and Development of National Health Commission (Tianjin Medical University), Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Department of Diabetic Foot of Zhu Xianyi Memorial Hospital of Tianjin Medical University (Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University), Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin 300134, China

Received:2020-10-15 Revised:2020-10-17 Accepted:2020-11-25 Online:2022-04-08 Published:2021-10-25
Contact: Wang Penghua, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Key Laboratory of Hormone and Development of National Health Commission (Tianjin Medical University), Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Department of Podiatry of Zhu Xianyi Memorial Hospital of Tianjin Medical University (Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University), Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin 300134, China
About author:Zhao Zixi, Master candidate, Physician, Key Laboratory of Hormone and Development of National Health Commission (Tianjin Medical University), Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases, Department of Diabetic Foot of Zhu Xianyi Memorial Hospital of Tianjin Medical University (Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University), Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin 300134, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81670766 (to WPH)

摘要/Abstract

摘要： 文题释义：
基质金属蛋白酶2、9：正常情况下，基质金属蛋白酶可直接参与降解细胞外基质成分，降解胶原蛋白，影响组织重塑，它与基质金属蛋白酶抑制剂两者的动态平衡维持细胞外基质的稳定。在糖尿病足溃疡伤口中，升高的基质金属蛋白酶2、9会导致蛋白水解的活性增加、水解胶原蛋白的能力增强，使伤口愈合过程的某些因子失活，并且由于胶原蛋白含量的减少，对基质金属蛋白酶的抑制作用也明显减弱，影响组织合成。
Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白：是参与创面修复的重要细胞外基质成分，在创面的愈合过程中发生动态变化。胶原由成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌，参与形成肉芽组织，故胶原蛋白的生成与成纤维细胞增殖密切相关。在伤口中Ⅰ型胶原蛋白起支架作用，Ⅲ型胶原蛋白决定胶原纤维的直径大小和弹性。

背景：胶原蛋白已被广泛应用于口腔、血管、神经、骨及软骨组织等领域中，但胶原蛋白海绵在糖尿病足溃疡伤口的应用鲜有研究。
目的：分析医用胶原蛋白海绵对糖尿病足溃疡伤口肉芽组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及基质金属蛋白酶2、9表达的影响。
方法：选择2019年1-12月天津医科大学代谢病医院足病科收治的46例糖尿病足溃疡患者，其中男25例，女21例，类随机法分2组治疗，对照组换药清创，实验组在对照组治疗的基础上创面填充胶原蛋白海绵。治疗前及治疗后第3，7，14天记录创面面积，计算创面愈合率；同时取创面肉芽组织，免疫组织化学染色观察基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的表达情况，Western blot检测分析Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达情况。研究已通过天津医科大学朱宪彝纪念医院伦理委员会批准。
结果与结论：①随着治疗时间的延长，两组创面愈合率增加，试验组治疗后3，7，14 d的创面愈合率高于对照组(P < 0.05)；②随着治疗时间的延长，两组创面肉芽组织中的基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9沉积减少，实验组治疗后各时间点的基质金属蛋白酶2、9表达少于对照组(P < 0.05)；③随着治疗时间的延长，两组创面肉芽组织中的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增加，实验组治疗后各时间点的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达表达高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，医用胶原蛋白海绵可减少创面组织中基质金属蛋白酶2/9的表达，有助于Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成，提高创面愈合率。

https://orcid.org/0000-0003-2262-4845 (赵紫熙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 胶原蛋白, 糖尿病足溃疡, 创面愈合, 基质金属蛋白酶, 细胞外基质

Abstract: BACKGROUND: Collagen has been widely used in the fields of oral cavity, blood vessel, nerve, bone and cartilage, but the application of collagen sponge in ulcer wound of diabetic foot is seldom studied.
OBJECTIVE: To analyze the effect of medical collagen sponge on the expression of type I and III collagen and matrix metalloproteinase 2 and 9 in granulation tissue of diabetic foot ulcer wound.
METHODS: Forty-six patients with diabetic foot ulcers, 25 males and 21 females, admitted to the Department of Podiatry, Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University from January to December 2019 were randomly divided into two groups. The control group received dressing change and debridement. The experimental group was treated with collagen sponge on the basis of the control group. Wound area was recorded before treatment and 3, 7, 14 days after treatment. Wound healing rate was calculated. Granulation tissue was taken and immunohistochemical staining was used to observe the expression of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9. Western blot analysis was used to measure type I and III collagen protein expression. This study was approved by the Ethics Committee of Zhu Xianyi Memorial Hospital of Tianjin Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The wound healing rate of the two groups increased with the time of treatment. The wound healing rate of the test group was higher than that of the control group at 3, 7, and 14 days after treatment (P < 0.05). (2) With the treatment time prolonged, the deposition of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9 in wound granulation tissue decreased in both groups. The expression of matrix metalloproteinase 2 and 9 in the experimental group was lower than that in the control group at various time points (P < 0.05). (3) The expression of type I and type III collagen in the wound granulation tissue increased with the treatment time, and the expression of type I and type III collagen in the experimental group was higher than that in the control group (P < 0.05). (4) The results showed that medical collagen sponge could reduce the expression of matrix metalloproteinase 2/9 in wound tissue, promote the synthesis of type I and III collagen, and improve the wound healing rate.

Key words: material, collagen, diabetic foot ulcer, wound healing, matrix metalloproteinase, extracellular matrix

中图分类号:

赵紫熙, 徐俊, 丁敏, 李喜文, 张靖航, 王鹏华. 医用胶原蛋白海绵外敷糖尿病足溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶2，9的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1544-1550.

Zhao Zixi, Xu Jun, Ding Min, Li Xiwen, Zhang Jinghang, Wang Penghua. Changes of type I and III collagen and matrix metalloproteinase 2 and 9 on the wound of diabetic foot ulcer with external application of medical collagen dressing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(10): 1544-1550.

图/表（结果） 10

2.1 参与者数量分析按意向性分析处理，46例患者均进入结果分析，无脱落。
2.2 试验流程图见图2。
2.3 两组一般临床资料比较两组患者在性别、年龄、糖化血红蛋白、踝肱指数、溃疡面积等方面比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2，具有可比性。

2.4 两组创面愈合情况创面床准备好时，两组患者的创面经清创等治疗后均无明显大面积坏死。治疗后第3天，试验组患者创面少量渗出，肉芽组织新鲜；对照组创面炎性渗出相对多，肉芽组织色发白。治疗后第7天，试验组创面无明显渗出，肉芽组织色红、新鲜，呈颗粒状；对照组创面炎性渗出较前减少，肉芽组织颜色好转。治疗后第14天，试验组创面无渗出，肉芽组织变多，色红、饱满，呈颗粒状；对照组创面渗出减少，肉芽组织较试验组少，颜色粉红。两组治疗前后的创面大体情况，见图3。
2.5 两组创面愈合率比较两组治疗前的足部溃疡面积大小无明显差别(P > 0.05)；治疗后第3，7，14天，试验组创面愈合率均高于对照组(P < 0.05)，见表3。

2.6 两组创面组织中基质金属蛋白酶2、9的表达两组治疗前创面的基质金属蛋白酶2阳性表达无明显差异；经治疗后，试验组、对照组创面中的基质金属蛋白酶2沉积逐渐变少，平均吸光度值均低于治疗前(P < 0.001)，两组治疗后各时点的基质金属蛋白酶2平均吸光度值比较差异有显著性意义 (P < 0.001)，见图4。重复测量方差分析结果显示，两组组内不同时间点的基质金属蛋白酶2吸光度值比较有明显差异(F=497.793，P=0.000)，两组间在不同治疗方法、不同时间点存在交互作用(F=81.138，P=0.000)，两组间不同治疗方法有明显差异(F=21.736，P=0.003)，见表4。

两组治疗前创面的基质金属蛋白酶9阳性表达无明显差异；经治疗后，试验组、对照组的基质金属蛋白酶9沉积逐渐变少，平均吸光度值均低于治疗前(P < 0.001)，两组治疗后各时间点的基质金属蛋白酶9平均吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.001)，见图5。
两组间不同时点的基质金属蛋白酶9表达存在明显差异(F=555.945，P=0.000)，两组间在不同治疗方法、不同时间点存在交互作用(F=136.438，P=0.000)，两组间不同治疗方法有明显差异(F=41.402，P=0.001)，见表5。

2.7 两组创面组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达两组各时间点Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的Western blot检测结果如图6所示。经图像扫描系统分析其相对值如表6所示，试验组治疗后的Ⅰ型胶原蛋白的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白相对表达值均高于治疗前(P < 0.001)，且在第7-14天时增生最为明显；对照组经治疗后的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白相对表达值也均高于治疗前 (P < 0.001)；试验组治疗后第7，14天的型胶原蛋白表达高于对照组(P < 0.001)，治疗后第3，7，14天的Ⅲ型胶原蛋白表达高于对照组(P < 0.001)。重复测量方差分析结果显示，两组组内不同时间点的Ⅰ型胶原蛋白表达存在明显差异(F=391.110，P=0.000)，两组间在不同治疗方法、不同时间点存在交互作用(F=37.329，P=0.000)，两组间在不同治疗方法有明显差异(F=38.674，P=0.000)；两组组内不同时间点Ⅲ型胶原蛋白存在明显差异(F=381.794，P=0.000)，两组间在不同治疗方法、不同时间点存在交互作用(F=48.774，P=0.000)，两组间不同治疗方法有明显差异(F=29.848，P=0.000)。
2.8 材料生物相容性试验中无任何患者出现与胶原蛋白海绵相关的不良反应。

参考文献

[1] 付小兵.如何在中国建立规范化的体表慢性难愈合创面防控培训与教育体系: 我们的初步实践与体会[J].感染•炎症•修复,2019, 20(1):23-26.
[2] 宁光,毕宇芳.中国成人糖尿病流行与控制现状[A].中国疾病预防控制中心达能营养中心.营养与糖尿病并发症——达能营养中心第十六届学术会议论文集[C].中国疾病预防控制中心达能营养中心:中国疾病预防控制中心达能营养中心,2013:5.
[3] REIBER GE, RAUGI GJ. Preventing foot ulcers and amputations in diabetes. Lancet. 2005;366(9498):1676-1677.
[4] LAVERY LA, ARMSTRONG DG, WUNDERLICH RP, et al. Risk factors for foot infections in individuals with diabetes. Diabetes Care. 2006;29(6): 1288-1293.
[5] MURPHY-LAVOIE HM, BHIMJI SS. Diabetic, Foot Infections. Statpearls. Treasure Island (FL): Statpearls publishingLLC, 2017.
[6] WHITING DR, GUARIGUATA L, WEIL C, et al.IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 2011;94(3):311-321.
[7] APELQVIST J, BAKKER K, VAN HOUTUM WH, et al. International consensus and practical guidelines on the management and the prevention of the diabetic foot. International Working Group on the Diabetic Foot. Diabetes Metab Res Rev. 2000;16 Suppl 1:S84-92.
[8] HUSSAIN Z, THU HE, SHUID AN, et al. Recent Advances in Polymer-based Wound Dressings for the Treatment of Diabetic Foot Ulcer: An Overview of State-of-the-art. Curr Drug Targets. 2018;19(5):527-550.
[9] KOZLOWSKA J, SIONKOWSKA A, SKOPINSKA-WISNIEWSKA J, et al. Northern pike (Esox lucius) collagen: Extraction, characterization and potential application. Int J Biol Macromol. 2015;81:220-227.
[10] An B, Lin YS, Brodsky B. Collagen interactions: Drug design and delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2016;97:69-84.
[11] 刘慧玲,王栋,章金刚.胶原蛋白在临床医学中的应用[J].北京生物医学工程,2005,24(3):239-241.
[12] CALVI EN, NAHAS FX, BARBOSA MV, et al. Collagen fibers in the rectus abdominis muscle of cadavers of different age. Hernia. 2014;18: 527-533.
[13] 卫秀洋,王万明,陈勇忠,等.胶原蛋白海绵复合bFGF 促进兔胫骨外露创面愈合的实验研究[J].中国医药指南,2012,10(23):399-401.
[14] SIGNORELLI SS, MALAPONTE G, LIBRA M, et al. Plasma levels and zymograhic activities of matrix metalloproteinases 2and 9 in type 2 diabetics with pedpheral arterial disease. Vase Med. 2005;10:1-6.
[15] 宋飞,简华刚.糖尿病足溃疡创面床准备及清创处理[J].创伤外科杂志,2011,13(2):180-182.
[16] SOOD A, GRANICK MS, TOMASELLI NL. Wound Dressings and Comparative Effectiveness Data. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014;3(8):511-529.
[17] 林源,王润秀,农庆文,等.糖尿病创面愈合过程的动态组织学特征[J].中国临床康复,2005,9(3):118-120,273.
[18] GARY SIBBALD R, WOO KY. The biology of chronic foot ulcers in persons with diabetes. Diabetes/metabolism research and reviews. Diabetes Metab Res Rev. 2008;24 Suppl 1:S25-30.
[19] 陈端凯,岑小宁,包崇婵,等.MEBT/MEBO通过PTEN/AKT通路对慢性难愈合创面中基质金属蛋白酶表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2020,40(4):459-464.
[20] 陈运起,郑伟民.老年冠状动脉不同病变程度患者治疗后斑块稳定性的临床分析[J].中华老年心脑血管病杂志,2020,22(11): 1209-1211.
[21] 韩隆胤,钱凯,杜彦仪,等.断藤益母汤对胶原诱导性关节炎大鼠软骨破坏的作用及机制研究[J/OL].中华中医药学刊:1-14[2020-11-12].http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1546.R.20201020.0927.034.html.
[22] LIU Y, MIN D, BOLTON T, et al. Increased Matrix Metalloproteinase-9 Predicts Poor Wound Healing in Diabetic Foot Ulcers. Diabetes Care. 2009;32(1): 117-119.
[23] 任国强,李炳辉,李恭驰,等.糖尿病创面基质金属蛋白酶9 对血管内皮生长因子表达的影响[J].中华损伤与修复杂志(电子版), 2017,12(2):123-127.
[24] YANG K, LIU X, LIU Y, et al. DC-SING and Toll-like receptor 4 mediate oxidized low-density lipoprotein-induced inflammatory responses in macrophages. Sci Rep. 2017;7(1):3296.
[25] REISS MJ, HAN YP, GARCIA E, et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 2009;147(2): 295-302.
[26] 冯洁,农晓琳.基质金属蛋白酶及其抑制剂在糖尿病皮肤创面愈合中作用的研究进展[J].山东医药,2018,58(38):106-109.
[27] SHARMA AC, SRIVASTAVA RN, SRIVASTAVA SR, et al. Evaluation of the association between a single-nucleotide polymorphism of bone morphogenetic proteins 5 gene and risk of knee osteoarthritis. J Postgrad Med. 2017;63(3):151-156.

引言

材料方法

1.1 设计前瞻性研究。
1.2 时间及地点试验于2019年1-12月在天津医科大学朱宪彝纪念医院完成。
1.3 对象选择2019年1-12月于天津医科大学代谢病医院(今为天津医科大学朱宪彝纪念医院)足病科住院治疗的共计46例糖尿病足溃疡患者，每一位患者经综合治疗后使代谢稳定，感染得到有效控制，创面床准备好后，根据入院顺序类随机分成试验组(23例)与对照组(23例)。研究已通过天津医科大学朱宪彝纪念医院伦理委员会批准，所有纳入的患者均已知晓研究内容并签订知情同意书。
纳入标准：年龄≥18岁；确诊为2型糖尿病足病，Wagner分级处于2级、3级的患者或者4级截趾术后的患者。
排除标准：年龄过大不具有参考价值的患者；重度缺血者(踝肱指数<0.4)，坏疽严重、感染至踝以上不能保肢者；伴有溶血性贫血和/或严重营养不良，经治疗后依据IDSA分级系统感染仍为重度的患者。

1.4 材料医用胶原海绵，见图1，规格 50 mm×50 mm×5 mm，注册证编号：国械注准20143642302，无锡贝迪生物工程股份有限公司生产，其材料学特点，见表1；山羊抗小鼠IgG(H+L)HRp(ZSGB-BIO.Co.Ltd，Cat#：ZB2305)；山羊抗兔IgG(H+L)HRp(ZSGB-BIO.Co.Ltd，Cat#：ZB2301)；β-actin鼠单克隆抗体(ZSGB-BIO.Co.Ltd，Cat#：TA-09)；TYPEⅢ兔多克隆抗体(proteintech-BIO.Co.Ltd，Cat#：22734-1-Ap)；TYPEⅠ兔多克隆抗体(proteintech-BIO.Co.Ltd，Cat#:14695-1-Ap)；二抗(北京中杉金桥生物公司，pV9001)；切片机(RM2015 Leica Germany)；Mini-pROTEAN Tetra Electrophoresis(BIO-RAD USA)。

1.5 方法
1.5.1 全身治疗所有患者入院后均予标准化治疗，包括降糖、抗感染、改善循环、营养神经、降压、抗板、调脂、纠正低蛋白血症及贫血、纠正水电解质紊乱等。
1.5.2 局部治疗所有主管医师每日查看每例患足伤口，进行换药治疗。用碘伏消毒，生理盐水冲洗；必要时清创，方法可选用外科清创、生物敷料清创、酶清创等方法(患者疼痛明显时，需在局麻下进行)。对于存在坏死组织的创面应用“蚕食法”，遵守“从四周到中心的”原则进行清创；对于存在脓腔的创面，根据情况张力较高的选择“十字”切开，或找寻最低点切开引流治疗，彻底引流出脓液或分泌物；位于足底的伤口，切口应尽量避开承重部位；根据病情及时手术治疗。所有患者避免下地行走，足部创面减压。糖尿病足溃疡创面床准备良好，应符合以下特点：创周无红肿、硬结、肥厚，创面无坏死组织、无脓性分泌物、无渗血渗液，无坏死的骨质、筋膜、肌腱组织外露，伤口有湿润的环境，肉芽组织无水肿及过度生长、不易碎，颜色红、呈颗粒状。周围上皮组织移行。
1.5.3 分组治疗所有入组的患者创面床准备好以后，对照组患者继续行换药治疗；试验组在此基础之上创面填充医用胶原蛋白海绵，根据创面的大小、形状、深度，使用无菌剪刀裁剪成合适的大小，密切贴敷在创面缺损的部位，不留空隙，对于有深度的创面，应从基底部开始，随伤口愈合情况逐层填充。表面喷洒少许生理盐水稍微湿润，使用医用无菌纱布覆盖，无菌绷带加压包扎。每日换药观察创面，当胶原与组织相容后，若创面仍有缺损时可继续填充胶原，直到创面愈合。
1.5.4 标本获取各组创面分别于创面床准备好时及治疗后第3，7，14天观察和记录伤口愈合情况并拍照。每时间点分别切取创面中心胶原蛋白海绵周围的肉芽组织2份，大小约5 mm×3 mm×2 mm，一份保存于 -80 ℃行Western blot检测，另一份行免疫组化染色。
1.5.5 计算创面愈合率对各时点的创面进行拍照，用图像处理软件Image J测量治疗前及治疗后第3，7，14天溃疡创面的面积，并计算创面愈合率。用(最初创面面积-各时点未愈合创面面积)/最初创面面积计算创面愈合率。
1.5.6 免疫组织化学染色免疫组化分子基质金属蛋白酶2/9的表达。①烤片：切片置于75 ℃烘箱中烘烤1 h，室温冷却30 min；②透明：切片置于二甲苯(Ⅰ)和(Ⅱ)中各浸泡
15 min，重复3次；③脱蜡至水：切片分别置于不同梯度(体积分数100%，95%，90%，80%，70%)乙醇脱蜡至水各 5 min， PBS冲洗3 min，重复3次；④抗原修复：切片置于柠檬酸缓冲液中(pH=6.0)，置于微波炉中96 ℃修复3次，每次5 min，后自然常温冷却至37 ℃左右， PBS冲洗3 min，重复3次；⑤过氧化氢孵育：避光加入50 µL的体积分数3%H2O2，常温避光孵育30 min，震荡器PBS冲洗3 min，重复3次；⑥封闭：滴加封闭血清室温孵育30 min，滤纸轻擦，勿洗；⑦孵育一抗：分别滴加基质金属蛋白酶2/9抗体，抗体的稀释浓度均为1∶200，加50 µL，每组均设一个空白对照，4 ℃冰箱放置过夜；次日取出，37 ℃复温45 min，震荡器中PBS冲洗5 min，重复3次；⑧孵育二抗：滴加50 µL辣根过氧化物酶标记的二抗， 37 ℃恒温孵育30 min，震荡器中PBS冲洗5 min，重复3次；⑨每张切片中滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液各50 µL，常温15 min，震荡器中PBS冲洗3次，每次3 min；⑩DAB显色：每张切片上滴加DAB工作液50 µL，室温孵育5-10 min，蒸馏水冲洗显色液；⑪细胞核染色：染色1 min用水冲洗；⑫盐酸乙醇分化：1%的盐酸乙醇中迅速分色3 s，用水冲洗，再用温水冲洗，使胞核返蓝；⑬脱水：不同梯度乙醇(体积分数70%，80%，90%，95%及100%)中脱水；⑭透明：二甲苯(Ⅲ)和(Ⅳ)各浸泡5 min；⑮封固：将中性树胶滴到组织上，从一侧将盖玻片盖上。显微镜下观察免疫组化标记定位于细胞浆，染色阳性区域表现为棕色或棕褐色沉淀。在100倍显微镜下，创面随机取5个视野，应用Image pou plus 6.0版本计算机图像分析系统测量阳性区域面积，计算平均吸光度值。
1.5.7 Western blot检测 Western blot检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。①标本组织解冻后，提取样品总蛋白，蛋白定量后调整样品浓度，蛋白抽提方法如下：称取50 mg组织，匀浆5-20 min直至组织充分研磨破碎，加入500 µL RAPI蛋白裂解液冰上裂解20 min后，将匀浆液吸出放入1.5 mL离心管中；②4 ℃12 000 r/min离心15 min，取上清置于新的离心管中，-20 ℃保存。使用BCA法进行蛋白定量；③根据SDS-PAGE上样量需要，取适量样品加入4×loading buffer后，100 ℃煮沸变性10 min；④SDS-PAGE电泳：根据分子质量配制10%分离胶凝胶，浓缩胶浓度为4%。上样量为30 µg，每孔上样量相等。电泳条件：浓缩胶恒压80 V，约40 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部；⑤转膜：湿转法。根据蛋白marker中分子质量位置裁取含有目的蛋白的胶。裁剪滤纸及PVDF膜。PVDF膜放入甲醇中灭活15 s，一起于转移缓冲液中平衡15 min。按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸顺序放入转膜仪石墨板上。设置恒流350 mA，冰浴转膜2 h；⑥封闭：转膜结束后取下PVDF膜，做好标记，浸没在Western blot 封闭液Ⅱ(TBST溶解的5%脱脂奶粉，pH=7.5)中室温轻摇1 h；⑦一抗孵育：用TBST稀释一抗，β-actin 鼠抗单克隆抗体稀释比例：1∶1 000，Ⅰ型胶原兔抗多克隆抗体稀释比例1∶2 000，Ⅲ型胶原兔抗多克隆抗体稀释比例1∶500，放4 ℃过夜孵育。洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；⑧二抗孵育：用TBST稀释二抗，用羊抗鼠-HRP
1∶20 000，羊抗兔-HRP 1∶20 000(根据一抗进行选择)室温孵育 60 min；⑨洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；⑩ECL反应、曝光扫描：一张8 cm×6 cm大小的膜用1 mL ECL(500 µL A液+500 µL B液)室温避光反应2 min，曝光 2 min。曝光后把胶片放入显影液中，出现条带时用蒸馏水终止显影，放入定影液中定影。用扫描仪将显影结果转化为图片，用Gene Sys软件进行定量分析。
1.6 主要观察指标两组创面愈合率、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达水平。
1.7 统计学分析所有数据采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。计量资料行正态性检验，正态分布资料以x±s表示。计量资料两组资料方差齐的数据采用t检验；不同时点的计量资料比较采用重复测量的方差分析；计数资料用百分数表示，两组间比较采用χ2检验，且认为P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病足是糖尿病患者最严重的并发症之一，也是糖尿病患者住院医疗费用高昂的常见原因[6]。糖尿病足起初由OAKLEY提出，1999年世界卫生组织(WHO)将其定义为踝关节或踝关节以下，下肢远端神经病变和(或)不同程度的周围血管病变基础上，合并足部皮肤及软组织感染、溃疡和(或)深层组织的破坏的临床综合征[7]。与急性伤口不同，糖尿病足溃疡对传统敷料提出了实质性挑战，并要求开发出更新颖、更先进的愈合模式，由于糖尿病足溃疡感染波及骨、肌腱、筋膜等组织，需要进行手术或清创治疗，导致这些患者伤口缺损较大、易形成窦道。HUSSAIN等[8]研究得出，理想的伤口敷料应提供相对潮湿的伤口内环境、减轻渗出、刺激组织再生的功能，这就需要胶原蛋白海绵的填充治疗。近年来，含有胶原蛋白的各种生物填充材料或生物敷料被越来越多地应用，且取得了理想的治疗效果。胶原蛋白是一种天然聚合物，是含量最多的蛋白质，大量存在于人体组织如皮肤、血管、肌腱、骨、软骨和骨骼组织中[9]，占机体总蛋白的20%-30%。目前研究发现的胶原蛋白大约有28种亚型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白，占总胶原的80%-90%[10]。胶原蛋白对机体发挥着重要作用，它具有特殊的结构性和生物特性，并且有很高的抗张强度，起着支撑器官、保护机体的功能[11]，在维持细胞正常功能、维持皮肤弹性、肌肉强度及韧性及组织修复等方面发挥着重要的作用[12]；而且可被机体降解，降解产物可被机体吸收，为创面修复提供多种物质支持[13]。
创面的愈合过程十分复杂，是由多种细胞分裂增殖、分化、迁移凋亡，细胞外基质的合成与降解，多种生长因子、蛋白及蛋白激酶相互作用共同参与的过程[14]。在创面愈合过程中，其他原因如细菌定植导致慢性炎症产生、肉芽组织老化、新生血管生成减少，致使创面缺血、胶原蛋白降解增多或者生成减少、生长因子等创面促愈合因子分布异常，也会导致创面延迟愈合甚至不愈合[15]。而糖尿病足溃疡创面由于不能有序及时的从炎症期进入增殖期，所以愈合较慢[16]。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，基质金属蛋白酶2、9是参与创面修复的重要因素，在创面愈合过程中发生动态变化。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，由成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌，在各种细胞因子调控转导下表达，可以帮助成纤维细胞迁移和生长，参与形成肉芽组织。试验使用的医用胶原蛋白海绵主要成分为Ⅰ型胶原蛋白。试验结果显示，在伤口的早期阶段，两组患者创面内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量较少，经过治疗后第3天，两组患者创面形成的Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白均开始增高，并且胶原蛋白治疗组要高于标准治疗的对照组；随时间推移，在治疗后第7，14天Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量继续不断变高，第7-14天最为明显，其中各时点胶原蛋白治疗组的蛋白表达量均要高于标准治疗的对照组，这也与以往的研究结果过相一致。林源等[17]通过研究发现，糖尿病足溃疡创面的胶原蛋白稀疏，在愈合早期创面胶原蛋白同正常创面一样为网状结构，正常创面随着治疗进展胶原蛋白数量逐渐增多，但糖尿病足溃疡创面的胶原蛋白生成速度慢、数量少、极性差。GARY SIBBALD等[18]发现创面局部微环境常会发生异常改变，包括局部高血糖、糖基化终末产物、氧化应激、异常的炎性因子等，这些因素可降解创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白或导致其功能异常，致使创面迁延不愈。作者注意到，试验过程中伤口愈合第3天开始Ⅲ型胶原蛋白的表达要比Ⅰ型胶原蛋白高，说明创面肉芽组织趋于成熟。另外，作者发现标准治疗对照组患者足部溃疡的愈合速度及创面面积缩小程度都逊于胶原蛋白治疗组，这说明使用胶原蛋白海绵治疗糖尿病足溃疡创面是有效的，通过促进创面肉芽组织胶原蛋白及成纤维细胞的不断生成，缺损组织得到逐步填充，加快了创面愈合率。
陈端凯等[19]认为基质金属蛋白酶2、9 调节及重塑细胞外基质的这一功能，在创面修复过程中起到关键的作用。基质金属蛋白酶2、9作为一种炎性因子能特异性降解细胞外基质[20-21]，所以试验通过填充胶原蛋白来增加细胞外基质、抑制基质金属蛋白酶2、9的表达。试验结果表明，治疗前两组患者创面中的基质金属蛋白酶表达无统计学差异。最初伤口中基质金属蛋白酶2、9处于高水平状态，这通常与伤口内的细菌增殖和有关[22]，任国强等[23]研究也发现，在有大量细菌生长的糖尿病创面中基质金属蛋白酶9的水平较高。随着感染控制、伤口愈合，两组患者创面内的基质金属蛋白酶含量逐渐下降，使用胶原蛋白海绵治疗后第3，7，14天，试验组患者创面内的基质金属蛋白酶含量下降较对照组更明显。研究发现，基质金属蛋白酶9可以对胶原基质降解[24]。此次试验结果也与既往REISS等[25]的研究结果保持一致，通过填充胶原蛋白海绵来增加组织中胶原蛋白含量，消耗基质金属蛋白酶2、9达到抑制基质金属蛋白酶2、9的目的，且通过病理结果也显示出新生的粗大胶原纤维，这些均提示，填充胶原蛋白海绵后通过影响创面基质金属蛋白酶2、9表达重塑创面的细胞外基质。
试验还有不足之处，还应完善基质金属蛋白酶9 /基质金属蛋白酶抑制剂1的比值，比值过高提示创面愈合不良，二者保持稳定的平衡状态才不至于损伤血管，共同调节和维持血管的完整性[26]。基质金属蛋白酶抑制剂可与基质金属蛋白酶相互结合形成特异性复合物，从而阻断基质金属蛋白酶与底物的结合过程，有效维持关基质物质合成与降解之间的平衡状态[27]。试验证实，使用胶原蛋白海绵来促进糖尿病足溃疡伤口愈合的有效性，也证实了胶原蛋白海绵通过调节基质金属蛋白酶2、9及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量达到加速创面愈合的目的，这将会为治疗糖尿病足溃疡的实际应用提供有力的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

医用胶原蛋白海绵外敷糖尿病足溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶2，9的变化

Changes of type I and III collagen and matrix metalloproteinase 2 and 9 on the wound of diabetic foot ulcer with external application of medical collagen dressing

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[1]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.
[2]	刘欢, 李涵, 马云豪, 仲维剑, 马国武. 部分脱矿牙本质颗粒在上颌窦提升中的成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 354-359.
[3]	吴沥豪, 邵安良, 许林, 任康, 王洪建, 陈亮, 许零. 复合大孔聚多糖可吸收止血材料免疫毒性反应的评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 329-334.
[4]	毕锦桐, 胡欣, 刘金纾. 口腔修复陶瓷材料的磨损性能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 406-412.
[5]	蒋海芳, 刘融, 胡鹏, 陈伟, 魏在荣, 杨成兰, 聂开瑜. 3D打印技术在唇腭裂精准与个性化治疗中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 413-419.
[6]	张皓博, 赵宇楠, 杨学军. 细胞焦亡在椎间盘退变中的作用及治疗意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1445-1451.
[7]	李志一, 贺鹏程, 边天月, 肖玉霞, 高璐, 刘华胜. 铁死亡机制研究的文献计量学与可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1202-1209.
[8]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[9]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[10]	李为明, 许青文, 李奕俊, 孙岩波, 崔进, 徐鹏远. 深层海水通过激活PI3K/Akt通路促进糖尿病小鼠创伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 724-729.
[11]	殷婷婷, 杜大勇, 蒋知新, 柳杨, 刘奇林, 李运田. 粒细胞集落刺激因子改善急性心肌梗死模型大鼠的心肌纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 730-735.
[12]	沈松, 徐彬. 经皮椎体成形骨水泥呈弥散型分布可减少邻近椎体再骨折的发生率[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 499-503.
[13]	侯万星, 李洪伟, 郑欣, 朱先任. 经皮椎体强化后骨水泥椎间盘渗漏与治疗前MRI发现的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 504-509.
[14]	杨斯迪, 王倩, 许诺, 王榕焓, 靳传奇, 陆颖, 董明. 上调骨形态发生蛋白2促进成骨细胞增殖分化的硅酸钙类材料Biodentine[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 516-520.
[15]	乐国平, 张明, 席立成, 罗瀚文. 盐酸万古霉素@聚乳酸-羟基乙酸共聚物-壳聚糖-透明质酸复合缓释微球的制备及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 528-534.