2.1   两组患者基线资料分析   见表1。两组患者的基线资料差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。



2.2   股骨头标本大体观察及苏木精-伊红染色结果   两组股骨头切片标本均可见坏死区、硬化区和正常区，均有骨小梁破坏及囊变，软骨下可见淡黄色坏死组织，坏死区下可见灰白色硬化带。激素性股骨头坏死、硬化区交界处可见坏死骨吸收、肉芽组织形成及血管新生；酒精性股骨头坏死、硬化区交界处则坏死骨吸收、血管新生不明显。苏木精-伊红染色结果发现两组坏死区骨质结构紊乱，骨髓坏死，骨陷窝空虚，但激素组骨小梁结构和连续性破坏更为严重，见图1。



2.3   Western blotting半定量分析    两组股骨头坏死区、硬化区和正常区的Western Blot蛋白免疫印迹条带灰度值结果，见图2A；结果发现激素组股骨头骨组织的坏死区、硬化区和正常区Piezo1的表达均高于酒精组(均P < 0.05，其中坏死区P=0.011，硬化区P=0.014，正常区P=0.001)，同时两组坏死区Piezo1蛋白的表达大于硬化区，硬化区则大于正常区，见图2B。



2.4    免疫组化分析    光镜下免疫组化结果显示股骨头组织标本中坏死区、硬化区及正常区Piezo1的阳性染色分布，可以发现骨小梁、成骨细胞和骨髓均有Piezo1的表达存在。相较而言，激素组股骨头坏死棕色区域染色较深，股骨头坏死区、硬化区和正常区阳性表达较酒精组更为明显，见图3。

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股骨头坏死是一种好发于中青年患者的难治性、致残性骨病，其特征是骨细胞凋亡和骨微结构破坏，股骨头负重能力降低并发展为头部塌陷及髋关节畸形，引起髋关节功能障碍[1]。滥用激素、酗酒是股骨头坏死的主要危险因素[2]。至目前为止，股骨头坏死发生的生理病理机制仍不清楚[3]，其临床早期诊断及治疗方法仍具有挑战性。骨坏死发生后股骨头骨组织结构和强度损伤，触发机体修复反应，发生骨吸收囊变、新生血管长入等炎症反应，促进新骨形成[4]，若骨形成修复不足，坏死股骨头无法适应承载的机械负荷时，软骨下骨小梁发生累积性应力骨折，则会发生塌陷，开启骨关节炎进程。塌陷是股骨头坏死病情进展的一个重要转折点[5]，对股骨头坏死塌陷等病理改变的充分认识有助于保髋治疗的成功[6]。因此，探索促进成骨修复避免塌陷的治疗方法是亟待解决的问题，而了解在骨形成修复和塌陷过程中的分子机制是探索治疗方法的前提。

机械应力是股骨头坏死塌陷及骨重塑中的重要调节因素。然而，对塌陷及成骨相关机械转导的分子调控仍然知之甚少。前期研究发现激素性与酒精性股骨头坏死具有不同的成骨修复反应，激素性股骨头坏死可能遵循爬行替代成骨规律，而酒精性股骨头坏死因骨形成减弱的特点其成骨修复可能是激发、提高自身组织的成骨能力[7]。沈莹姗等[8]辨析了激素性与酒精性股骨头坏死不同修复方式引起血瘀形成的原因，这些发现对认识成骨修复过程具有一定的指导作用。探索激素性与酒精性股骨头坏死分子水平表达差异可能有助于解释两者不同的骨形成修复特点。然而，股骨头坏死塌陷及骨形成重塑发生前后是否有相应分子通道启动尚不清楚。近年来研究发现，Piezo家族机械敏感通道是与骨发育和成骨细胞分化相关的关键机械刺激传感蛋白[9]。Piezo1能够感应骨骼机械应力转化为细胞内信号并调控成骨细胞的功能和骨形成。据报道，成骨细胞和骨细胞中Piezo1对出生后小鼠骨形成及骨吸收的调节具有重要作用[10-12]，此外，Piezo1在骨质疏松和膝骨关节炎的发病中具有重要作用[13-15]。基于Piezo1与细胞机械力学转导的相关性，推测Piezo1可能在股骨头坏死塌陷过程中发挥作用，并参与成骨修复的过程。该研究将通过组织病理学、分子生物学技术观察激素性与酒精性股骨头坏死患者骨组织标本中Piezo1的表达状态，为深入了解股骨头坏死塌陷发生的力学相关分子机制及促成骨修复具有重要意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   分组对照观察，组间比较进行独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。
1.2   时间及地点   股骨头标本来自于2020年8月至2021年4月因股骨头坏死在广东省中医骨伤研究院接受人工全髋关节置换术的患者。
1.3   对象
1.3.1   标本来源  

纳入标准：①经影像科及关节中心医师据X射线片诊断为激素性或酒精性股骨头坏死，且国际骨循环学会(ARCO)分期为Ⅲ期的患者；②行人工全髋关节置换术者。

排除标准：①存在心脑血管、神经系统疾病、严重肾脏疾病、甲亢或痛风性关节炎的患者；②存在创伤、肿瘤、感染等可能影响骨组织分子检测结果因素的患者。

选取30例接受人工全髋关节置换患者的股骨头标本，其中男20例，女10例；分为激素组15例，酒精组15例；患者股骨头坏死均为国际骨循环协会(ARCO)Ⅲ期，并收集患者相应的临床和影像学资料。两组患者的基线资料差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

所有患者均已签署知情同意书，并且实验方案通过广州中医药大学第三附属医院伦理委员会批准(NO.K[2019]072)，并在中国临床试验注册中心注册(ChiCTR-RPC-15006290)。
1.3.2   主要仪器及试剂   Leica组织切片机、Leica TP1020自动组织处理机、Leica Autostainer XL自动染色机、WD-9413B型凝胶成像系统(北京六一仪器厂)；光学显微镜(DP70，日本Olympus公司)；兔抗Piezo1(MA5-32876，Life Technologies)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(A16096，Invitrogen)；GAPDH内参蛋白(CPA9066，sabbiotech)。
1.4   方法   
1.4.1   病理学观察   使用硬组织切片机将两组股骨头标本切片，大体观察股骨头切片内坏死、硬化及正常区情况，并将患者股骨头中坏死区、硬化区及正常区不同位置的骨组织标本置于40 g/L多聚甲醛溶液室温固定24 h，10%EDTA液脱钙，经体积分数75%，85%，95%，100%的乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚切片，常规苏木精-伊红染色，镜下观察。
1.4.2   Western blot检测Piezo1蛋白的表达   从液氮中取出股骨头冰冻切块，于切片坏死区、硬化区、正常区不同位置钳取骨组织并用天平称质量，每1 mg 组织加3.5 μL裂解液，并加入PMSF、Cocktail蛋白酶抑制剂，于已预冷研磨钵中充分研磨、匀浆，冰上裂解30 min，将液体转移至1.5 mL Ep管中，4 ℃ 12 000 r/mim高速离心30 min，取上清液按BCA法配制蛋白标准溶液，用酶标仪测吸光度后推算出各蛋白浓度，计算出蛋白浓度标准化体积，随后分别制备10%分离胶及5%浓缩胶，与适量比例的loading buffer充分混匀上样，开始SDS-PAGE电泳，设置跑胶条件为上层胶电压为80 V，时间为20 min，下层胶为110 V，时间为90 min，然后100 V电压转膜，取出PVDF膜，切膜，体积分数3%牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭1 h，加入一抗(兔抗Piezo1，1∶500)4 ℃孵育过夜，之后TBST 洗涤 3 次，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，TBST 漂洗后予以增强化学发光液于凝胶成像仪中曝光显影，并用Image J软件分析各组不同区域目标条带灰度值，同时计算各组Piezo1蛋白相对于GAPDH内参蛋白的表达量。
1.4.3   免疫组化检测Piezo1蛋白的表达   取5 μm厚不同区域骨标本组织的石蜡切片，于60 ℃恒温箱中烤片30 min，二甲苯中脱蜡，常规体积分数100%-70%由高至低浓度乙醇梯度水化，于0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液高压修复，冷却完成后PBS洗涤3次，每次5 min，然后加入体积分数3% H2O2除去内源性过氧化物酶，阻断非特异性抗原结合，并加入一抗，4 ℃孵育过夜，室温下加入生物素化二抗30 min，二抗加入前后PBST漂洗3次，随后滴加二氨基联苯胺(DAB)溶液显色，苏木素复染，常规脱水，干燥后封固，在光学显微镜下检测Piezo1蛋白的表达。
1.5   主要观察指标   ①股骨头标本大体观察及坏死区苏木精-伊红染色结果；②股骨头标本中不同区域Piezo1蛋白的半定量表达及定位表达。
1.6   统计学分析   使用SPSS 26.0统计软件，计量资料以x±s表示，采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。P < 0.05为有统计学差异。文章统计学方法已通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

机械应力是股骨头坏死塌陷及重塑中的重要调节因素。然而，对塌陷相关机械转导的分子调控仍然知之甚少。在这项研究中，发现力学感应蛋白Piezo1在ARCO Ⅲ期激素及酒精性股骨头坏死患者股骨头标本中高表达，这可能与细胞破骨及成骨活动介导的骨重塑过程活跃、骨修复活动代偿性增加相关。骨重塑首先由破骨细胞发起[16]，破骨细胞黏附后才进行成骨活动，这可能导致塌陷。塌陷是股骨头坏死诊断治疗的中心点，股骨头坏死后股骨头内会发生动态骨再生、重塑的修复反应，在破骨细胞协同下，成骨细胞在骨表面沉积、构建新生骨及矿化周围骨结构，联合深嵌于成熟骨内的骨细胞，最终促进新骨形成，重新协调骨骼组织内稳态及改善微环境，从而防止股骨头塌陷或者阻止塌陷进一步加重。据报道，激素、酒精均可抑制骨髓间充质干细胞从而影响骨的形成与修复[17-18]，而股骨头塌陷的发生与机械应力刺激、坏死组织修复能力相关[19-20]。因此，作者团队认为Piezo1与股骨头坏死的塌陷过程存在一定的相关性，Piezo1可能是感应股骨头坏死塌陷的力学敏感蛋白。研究者发现，不同区域组织标本中Piezo1存在差异，部位尤以坏死区明显，这可能与坏死区机械应力集中、细胞膜上机械转导信号刺激最为强烈相关，而硬化区、正常区负重应力依次降低，故正常区相较坏死区表达最轻；同时值得注意的是，激素性和酒精性股骨头坏死患者骨组织中Piezo1表达存在差异，激素组患者股骨头坏死区、硬化区和正常区Piezo1的表达均高于酒精组，且在骨髓、成骨细胞及骨小梁中表达较高。结合前期的研究，激素性股骨头坏死以骨吸收增强为特点、破骨活动活跃为主要表现形式[7]，相较酒精组而言，激素组塌陷后骨吸收及骨形成协调性好，血运肉芽组织较酒精组丰富，这可能提示激素组Piezo1较高的表达量代表了较为活跃的骨形成修复特点，而酒精组相对较低Piezo1表达，可能与参与坏死骨组织重塑的低反应性相关。故两组骨组织中 Piezo1的差异表达可能与它们不同的骨形成修复特点有关。

哺乳动物生理病理过程中涉及许多类型机械转导，如声音、气流、力、本体感觉等，然而，机械力如何塑造生物学过程的了解仍然有限[21]。哺乳动物特殊蛋白质Piezo1的突破性发现开创了机械转导的新纪元[22]。据报道，Piezo1的结构和序列上不同于其他已知离子通道，是镶嵌于细胞膜上的一种新型机械敏感孔道蛋白，2010年首次被patapoutian团队发现[23]，Piezo1同源三聚体构成了一个三叶螺旋桨式结构[24]，其跨膜段的数量多，形成独特的纳米碗状结构[25]，可感受骨骼中的重力、压应力以及流体剪切力等生物力学机械信号，并在毫秒内快速响应，其螺旋桨叶片等组成部分发生形态结构变化，中心成孔区打开引起Ca2+，K+等阳离子内流，从而发生机械生化、电信号转导，完成对骨组织精细的机械力感知及阳离子门控通道功能。Piezo1在呼吸、消化、心血管、泌尿、运动等多个系统的器官、组织中均有分布，其中对骨骼的影响最大，在人间充质干细胞、成骨、破骨、软骨细胞等非神经元细胞中稳定表达[26]，因此，它的功能主要是感知、转导细胞膜上的机械信号，影响细胞增殖、分化、凋亡等生命活动，并在生物骨生长发育和骨量维持中起重要作用。临床上激素、酒精常诱导股骨头缺血坏死，力学刺激下发生塌陷。股骨头塌陷对于机械力学刺激的感知依赖于细胞机械离子通道的信号转导，结合此次研究结果，推测Piezo1可能可以敏锐地感知股骨头坏死的塌陷，同时研究发现激素性和酒精性股骨头坏死的塌陷骨组织标本均有Piezo1的表达，这提示Piezo1可能参与了股骨头坏死骨形成部分的修复过程，它可能主要通过影响细胞分化、增殖等促进成骨来发挥作用。

机体中成骨细胞、破骨细胞和其他骨细胞受到各种内源性和外环境因素的影响，而Piezo1作为骨骼机械力的传感蛋白分子，可感知机械负荷从而调节骨稳态，研究发现Piezo1维持骨稳态的关键作用是通过成骨细胞、骨细胞的机械感应调节来实现的，同时承受高生物力学负荷骨骼区域Piezo1可调控转录辅助因子YAP1和TAZ激活下游Wnt信号通路从而参与调节间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨细胞增殖和分化[10]。SUGIMOTO等[27]发现Piezo1感受流体静水压的机械刺激促进间充质干细胞中骨形态发生蛋白2表达和成骨细胞分化，抑制脂肪细胞分化，调控间充质干细胞的分化命运，此外，使用Yoda1(Piezo1的激活剂)也可以获得与静水压机械刺激相同的效果。最近研究发现Piezo1还在软骨内骨化及骨重塑过程中发挥作用，促进骨小梁的形成[28]。此外，WANG等[12]研究发现成骨细胞中的Piezo1调控Ⅱ型和Ⅸ型胶原蛋白表达，并且这些胶原亚型又反过来调节破骨细胞分化，这提示Piezo1可以通过骨骼中的成骨细胞-破骨细胞间串扰来协调骨稳态。机械应力及细胞感应机械力分子  Piezo1的缺乏则会导致骨质流失及骨代谢紊乱。Li等[10]研究发现航天飞行过程中，由于重力的减弱，Piezo1的活性和表达降低，导致骨流失的增加。另一项研究发现，向成年小鼠施用 Piezo1 激活剂则会模拟机械负荷的影响促进骨的合成及增加骨量，Piezo1在成骨细胞和骨细胞缺失会降低骨质，改变骨基质的完整性，并且钝化骨骼对机械负荷的反应[10]。综上，Piezo1在骨骼细胞感知机械负荷中起着十分重要的作用，可通过调节成骨细胞活性及间接调控破骨细胞活性促进骨形成，可能介导协调股骨头坏死塌陷及成骨修复的骨稳态。

一些研究发现Piezo1通道在血管生理学中也起着关键的整合作用[29-30]，CHEN等[31]使用具有内皮细胞特异性Piezo1通道缺失的小鼠来检查Piezo1在骨折愈合中的作用，结果发现内皮细胞中的Piezo1可促进血管生成来支持骨折修复。有研究报道，Piezo1可以感知身体运动，有利地重置对血管收缩及舒张的控制，增强体能，而缺乏内皮Piezo1的小鼠体能受损[32]。另一项研究表明Piezo1缺陷小鼠胚胎在妊娠中期死亡，并伴有血管重塑缺陷，这提示Piezo1机械敏感离子通道是小鼠血管发育所必需的[33]。因此，这可能是未来Piezo1机械敏感通道除骨形成外的重要研究方向。然而，此次研究仍有一定的局限性，首先，没有测量塌陷前期股骨头坏死患者骨组织中Piezo1的表达，这可能需要通过其他可替代方法，如血清样本化验等检测Piezo1在股骨头坏死早期的表达情况；第二，并没有判断患者具体的股骨头坏死部位和塌陷程度，不同的骨坏死部位可能影响Piezo1的表达，尤其当累及股骨头前侧或外侧承重柱的病理性骨小梁骨折时，负重时股骨头主体骨架更易发生塌陷，塌陷后两组Piezo1的表达可能存在差异，同时患者具体塌陷程度的不同可能也会导致表达差异；最后，关于Piezo1在股骨头坏死中的具体调控作用及机械信号转导机制，这还需要进一步的研究。

综上，尽管学者对股骨头坏死的认识在不断提高，但该病的治疗仍然困难[34]。研究人股骨头坏死组织细胞中的生物力学信号转导机制是股骨头坏死未来的一个重要方向。在这项研究中，发现力学感应蛋白Piezo1在股骨头坏死患者中高表达，其中激素组患者中的表达高于酒精组，这可能归因于两者不同的骨形成修复特点。作者认为Piezo1可能通过感知应力刺激促进股骨头坏死成骨修复，调节骨稳态，尤其是在激素性股骨头坏死中，此研究有望为激素性股骨头坏死的防治提供新思路，深入研究Piezo1在股骨头坏死机械应力转导作用将对认识股骨头坏死的塌陷机制具有重要的现实意义。同时Piezo1有望成为治疗早期股骨头坏死的潜在预防靶点。未来随着骨骼机械转导的确切途径和促进股骨头坏死成骨修复介导因素的进一步揭示，期待开发激活成骨目标途径的药物制剂来治疗股骨头坏死，提高修复骨的抗塌性能预防塌陷，从而实现“无塌髋关节”。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

Piezo1：一种由FAM38A基因编码的镶嵌于细胞膜上的新型机械敏感孔道蛋白，广泛分布在呼吸、消化、心血管、泌尿、运动等全身多个系统的组织器官中。Piezo1跨膜段的数量多，可感知哺乳动物的生物力学机械信号，从而发生机械生化、电信号转导及阳离子门控通道功能，是近年来医学研究领域的热点。

股骨头坏死：是指由于不同病因破坏了股骨头血液供应，导致股骨头发生部分或完全性缺血，逐渐发展为股骨头塌陷，最终发生髋关节骨关节炎。股骨头坏死的常见原因有激素、酒精和创伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

股骨头坏死的治疗仍是骨科领域的难题，其塌陷相关机制尚不明确。机械应力是股骨头坏死塌陷及重塑中的重要调节因素，然而，对塌陷相关机械转导的分子调控仍然知之甚少。作者团队认为Piezo1与股骨头坏死的塌陷过程存在一定的相关性，Piezo1可能是感应股骨头坏死塌陷的力学敏感蛋白。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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