中药旋覆花治疗骨质疏松症作用机制的网络药理学分析

doi:10.12307/2021.297

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5662-5669.doi: 10.12307/2021.297

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中药旋覆花治疗骨质疏松症作用机制的网络药理学分析

安杨1，2，3，廖艺楠4，谢程欣2，李清龙2，黄戈2，金鑫2，尹东1，2

广西医科大学，1广西生物医药协同创新中心，3广西再生医学重点实验室，4药学院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西壮族自治区人民医院，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2020-10-15 修回日期:2020-10-17 接受日期:2020-11-13 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-05
通讯作者: 尹东，男，博士，主任医师，广西医科大学广西生物医药协同创新中心，广西壮族自治区南宁市 530021;广西壮族自治区人民医院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:安杨，男，1994年生，内蒙古自治区呼伦贝尔市人，蒙古族，广西医科大学在读硕士，主要从事关节外科疾病、骨科常见疾病及骨肿瘤的发病机制及治疗的基础研究

Mechanism of Inulae flos in the treatment of osteoporosis: an analysis based on network pharmacology

An Yang1, 2, 3, Liao Yinan4, Xie Chengxin2, Li Qinglong2, Huang Ge2, Jin Xin2, Yin Dong1, 2

1Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, 3Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, 4Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-10-15 Revised:2020-10-17 Accepted:2020-11-13 Online:2021-12-18 Published:2021-08-05
Contact: Yin Dong, MD, Chief physician, Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:An Yang, Master candidate, Guangxi Collaborative Innovation Center for Biomedicine, Guangxi Medical University, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
分子对接技术：分子对接技术常用于虚拟筛选方法中，精确确定天然产物小分子在靶标蛋白的结合位点及结合力的大小，从中筛选出与靶标蛋白高度结合的天然产物小分子化合物，在网络药理学中有很高的应用价值。
旋覆花：菊科旋覆花属植物旋覆花或欧亚旋覆花的干燥头状花序，性味苦、辛、咸，微温，归肺、脾、胃、大肠经，功能主治降气、消痰、行水、止呕；用于风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸桶楛闷、喘咳痰多、呕吐噫气、心下浩硬。

背景：骨质疏松症的治疗是困扰医学领域的一大难题，新药物的研发及应用一直是现代药理学及再生医学研究的重点。天然中草药旋覆花作为常用药材，其在骨质疏松症治疗中的价值尚未有人进行研究，从网络药理学水平分析二者间的关系，为新药研发及疾病治疗提供一定的理论依据。
目的：采用网络药理学方法探究旋覆花在骨质疏松症治疗中的应用前景。
方法：通过TCMSP数据库筛选旋覆花有效成分，TCMSP和Swiss Target Prediction数据库预测有效成分作用靶点，GeneCards数据库和DrugBank数据库预测骨质疏松症作用靶点，String数据库构建蛋白质互作网络分析，Cytoscape软件构建蛋白质互作网络图和药物-成分-靶点-疾病网络图，David数据库进行富集分析，autodock vina软件进行分子对接预测。
结果与结论：①共筛选出19个旋覆花的有效药物活性成分，180个旋覆花作用于骨质疏松症治疗的潜在作用靶点，如AKT1、TP53和VEGFA等；②槲皮素、木犀草素和山奈酚被认为是旋覆花对骨质疏松症治疗作用的关键有效成分；③富集分析结果表明，旋覆花对骨质疏松症治疗作用与细胞增殖与凋亡、衰老、激素水平及缺氧应激等生活过程有关，与PI3K-Akt、缺氧诱导因子1及FOXO等信号通路有着直接或间接的关联；④上述结果证实，旋覆花对于骨质疏松症的治疗有潜在的研究价值，文章结果为后续研究机制的研究提供了新思路和新方法。
https://orcid.org/0000-0003-2606-5200 (安杨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 中医药, 旋覆花, 骨质疏松, 信号通路, 槲皮素, 木犀草素, 山奈酚, 网络药理学, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: The treatment of osteoporosis is a major problem that plagues the medical field. In particular, the development and application of new drugs have always been the focus of modern pharmacology and regenerative medicine. As a common medicinal herb, Inulae flos has not been studied for its value in the prevention and treatment of osteoporosis. The relationship between the two is analyzed from the network pharmacology level to provide a certain theoretical basis for new drug development and disease treatment.
OBJECTIVE: To explore the application prospects of Inulae flos in the treatment of osteoporosis by means of network pharmacology.
METHODS: The active ingredients of Inulae flos were screened by TCMSP database. The targets of active ingredients were predicted from TCMSP and Swiss Target Prediction database, and the targets of osteoporosis were predicted by GeneCards database and DrugBank database. Protein-protein interaction network analysis was conducted with String database. Cytoscape software was used to construct a protein-protein interaction network diagram and a drug-component-target-disease network diagram. David database was used for enrichment analysis. Molecular docking prediction was completed using autodock vina software.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 19 effective pharmaceutical active ingredients of Inulae flos and 180 potential targets for osteoporosis treatment, such as AKT1, TP53, VEGFA. Quercetin, luteolin, and kaempferol are considered to be the key effective ingredients for the treatment of osteoporosis by Inulae flos. The results of enrichment analysis showed that the therapeutic effect of Inulae flos on osteoporosis may be related to cell proliferation and apoptosis, aging, hormone levels and hypoxic stress and other life processes, and may be directly or indirectly associated with mediating signaling pathways such as FOXO, PI3K-Akt, and hypoxia inducible factor 1. The therapeutic effect of Inulae flos on osteoporosis needs to be verified by more basic experiments. Our research provides new ideas and new methods for follow-up experiments.

Key words: traditional Chinese medicine, Inulae flos, osteoporosis, signaling pathway, quercetin, luteolin, kaempferol, network pharmacology, bioinformatics

中图分类号:

安杨, 廖艺楠, 谢程欣, 李清龙, 黄戈, 金鑫, 尹东. 中药旋覆花治疗骨质疏松症作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5662-5669.

An Yang, Liao Yinan, Xie Chengxin, Li Qinglong, Huang Ge, Jin Xin, Yin Dong. Mechanism of Inulae flos in the treatment of osteoporosis: an analysis based on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5662-5669.

图/表（结果） 10

2.1 旋覆花有效药物活性成分及其ADME分析结果作者通过TCMSP在线数据检索平台检索到与旋覆花有关的所有已报道的化学成分及其ADME参数，共收集到53个化学成分。根据OB≥30%和DL≥0.18两个参数，对旋覆花的成分进行筛选，得到19个有效药物活性成分，在Pubchem数据库查询每个成分的Smile化学表达式。整理所得到的有效药物活性成分的编号、名称、OB(%)、DL和Smile化学表达式，见表1。

2.2 旋覆花有效药物活性成分对骨质疏松症潜在靶点的筛选作者通过TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库预测旋覆花有效作用成分的潜在作用靶点，整理后去除重复项，共筛选出262个靶点；利用GeneCards数据库和DrugBank数据库预测骨质疏松症的潜在治疗靶点，整理后去除重复项，得到4 310个预测的治疗靶点。使用Venny平台将旋覆花有效成分的潜在作用靶点与骨质疏松症的潜在治疗靶点取交集，最终得到180个旋覆花治疗骨质疏松症的潜在作用靶点，见图1。

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络的构建及关键有效药物成分的筛选作者通过4个数据库的数据，确认了180个旋覆花治疗骨质疏松症的潜在作用靶点。然后使用Cytoscape 3.7.2软件，将药物-成分、成分-靶点、疾病-靶点的信息导入后，进行可视化调整，得到旋覆花治疗骨质疏松症的药物-成分-靶点-疾病网络图，见图2。作者把有效药物成分节点设置为连接的潜在靶点越多，节点越大，可以观察到quercetin (MOL000098，槲皮素)、luteolin (MOL0000006，木犀草素)、kaempferol (MOL000422，山奈酚)3个成分显著大于其他节点，说明此3个节点为药物成分的关键节点，所对应的单体可视为旋覆花治疗骨质疏松症的关键有效药物成分，见图3。

2.4 旋覆花对骨质疏松症作用靶点的蛋白互作网络及关键靶点分子对接结果得到了180个旋覆花治疗骨质疏松症的潜在作用靶点，使用String数据库对这些靶点进行分析，得到蛋白质相互作用网络，共涉及到178个靶点，3 409对蛋白互作关系。使用Cytoscape 3.7.2软件对所得到的结果进行可视化调整，得到潜在作用靶点的PPI网络图，见图4，其中靶点颜色越深，代表其Degree值越高，而Degree高低代表了蛋白相互作用的可信度。随后作者使用“Cytohubba”插件，筛选出PPI网络图中Degree值前30的靶点，见图5。在图5可以观察到，AKT1，TP53，VEGFA等靶点在网络中的Degree值都排名靠前，可以认为是旋覆花对骨质疏松症作用靶点中的关键靶点。

作者使用autodock vina软件对Degree前10的靶点与3个关键活性节点进行了分子对接结果预测，见表2，图6，一般认为结合能越低，配体与受体结合的构象越稳定，≤?20.9 kJ/mol (?5.0 kcal/mol )说明两者可以结合，≤ ?29.3 kJ/mol (?7.0 kcal/mol) 说明有较好的结合能力，结果显示关键靶点和关键成分均可以结合，其中PTGS2，CASP3和EGFR与3个活性成分有较好的结合能力。
2.5 GO分析和KEGG通路富集分析结果 David数据库一直被广泛用于对基因和靶点进行功能和通路富集分析。作者在David 6.8数据库在线平台对旋覆花对骨质疏松症的潜在作用靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，P < 0.01为筛选参数。使用
ImageGP在线作图工具将GO和KEGG分析的结果进行可视化调整，制成对应的气泡图。

GO分析选取BP、CC和MF中可信度前10的蛋白质群注释，见图7。在生物过程中，潜在作用靶点主要富集在药物反应、凋亡过程的负调控等过程中；细胞成分分析中，靶点蛋白集中在胞质溶胶、质膜和核中；而分子功能分析显示，在蛋白质结合过程中可以观察到大量的靶点富集。KEGG通路富集分析的结果选取可信度排名前30位的通路，见图8。靶点基因主要富集在癌症通路、乙型肝炎和PI3K-Akt通路等，这些可视为旋覆花参与调控骨质疏松症治疗时的关键通路。

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引言

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，在中老年人中很常见，但一般只有在骨折发生后，此疾病才被患者意识到。骨质疏松的特征是骨量减少，骨组织微结构恶化，从而增加骨脆性和骨折风险[1]。随着年龄的增长，骨质疏松的发病率也会逐渐升高，老年患者的骨质疏松由于其病情的严重程度、发病率、死亡率和就医的经济成本等原因，成为了医学领域的一大挑战[2]。根据国家卫健委2018年发布的调查结果显示，中国50岁以上的人群骨质疏松患病率为19.2%，65岁以上人群患病率达到32.0%，女性患病率显著高于男性[3]。目前，适量的锻炼配合充足的钙和维生素D补充治疗，仍然是预防和治疗骨质疏松症的最重要策略[4]。不过对于有些老年患者来讲，仅仅采用上述疗法不足以满足其治疗需求[5]。随着再生医学学科的兴起和不断发展，研究者们发现，抑制破骨细胞以及促进成骨细胞的形成和功能，是骨质疏松发生发展和治疗的关键所在[6]。有研究通过对传统中药单体进行筛选和体内外实验，发现文多灵和柳穿鱼黄素可以通过抑制RANKL诱导的破骨细胞形成等途径，抑制体内骨丢
失[7-8]。因此，中医药疗法在骨质疏松治疗中有非常大的研究价值和应用前景。
旋覆花(Inulae Flos)，菊科旋覆花属植物旋覆花(Inula japonica Thunb.)或欧亚旋覆花(Inula Britannica L.)的干燥头状花序，在亚洲、非洲和欧洲均有广泛分布，是中医治疗中的常用药材。《神农本草经》中对旋覆花的论述：主结气胁下满，惊悸,除水，去五脏间寒热，补中，下气。随着现代药理学的发展，旋覆花中提取的黄酮类、倍半萜内酯类、三萜、甾体和挥发油成分，其药理价值也在不断地被挖掘。JIN等[9]通过对RAW 264.7细胞进行处理，发现旋覆花的两种萃取产物对脂多糖诱导的核转录因子κB活性具有较强的抑制作用。DONG等[10]发现旋覆花中提取的黄酮类化合物对脂多糖诱导的急性肝衰竭有很明显的预防和治疗作用。旋覆花中提取的1-O-乙酰基大花旋覆花内酯可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2的表达表现出强烈的抗炎作用[11]。旋覆花中的成分在抗肿瘤、保肝等方面也有一定的效用。
近年来，支架植入和局部药物递送相结合促进骨质疏松性骨缺损愈合，是组织工程研究中的热点问题。而结合的骨再生诱导因子中，中药单体是常用药物之一，将其以纳入凝胶或涂层的方式与组织工程支架相结合，可以达到缓释效果[12]。旋覆花的化学成分复杂，但其药理作用在诸多疾病上都有所体现。文章利用网络药理学的相关数据库和平台，从分子水平推测旋覆花在骨质疏松治疗中的潜在价值，并且分析有效活性成分及其作用机制，为后期应用于组织工程研究和骨质疏松治疗提供新的依据和作用靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 旋覆花有效药物活性成分的筛选作者使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，Traditional Chinese
Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索旋覆花(Inulae Flos)的化学成分[13]，以药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug likeness，DL) ≥ 0.18作为条件，筛选出旋覆花的有效药物活性成分。对筛选出药效成分的名称和编号进行记录后，登录Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索[14]，记录所有有效药物活性成分的smile化学表达式和结构图，整理制作旋覆花有效药物活性成分数据表。
1.2 旋覆花有效成分作用靶点的筛选作者在TCMSP在线数据库对1.1中筛选出的旋覆花有效作用成分进行查询，获得其对应的靶点蛋白，记录；同时在Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中，检索有效药物活性成分的smile化学表达式和结构图，以Probability≥0.7为准入参数，对其作用靶点进行预测、记录。整理2个数据库中预测出的靶点，使用EXCEL 2019软件去除重复值，得到旋覆花有效成分的作用靶点。
1.3 骨质疏松症治疗靶点的预测作者使用关键词“Osteoporosis”，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)进行检索[15-16]，汇总2个数据库中检索出的骨质疏松症的治疗靶点，使用EXCEL 2019软件去除重复项，得到骨质疏松症的疾病治疗靶点。
1.4 药物-成分-靶点-疾病网络的构建及关键有效药物成分的筛选作者使用Venny 2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，将1.2与1.3中得到的靶点取交集，得到180个有效成分和疾病潜在作用靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件处理数据[17]，构建药物-成分-靶点-疾病网络图。在图中作者进行了设置，当有效药物成分节点连接的潜在靶点越多，节点越大，观察明显大于其他成分的关键节点，对应旋覆花治疗骨质疏松症过程中的关键有效药物成分。
1.5 旋覆花对骨质疏松症作用靶点的蛋白互作网络及关键靶点分子对接预测 String数据库(Version: 11.0；https://string-db.org/)是一个储存已知和预测未知蛋白质相互作用的在线平台[18]。作者将1.4中得到的潜在作用靶点导入String数据库(Version: 11.0)，构建旋覆花对骨质疏松症治疗靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI网络)。将结果以.tsv格式导出后，使用Cytoscape软件进行可视化调整并作图。使用“Cytohubba”插件，导出所有靶点Degree值最高的前30个靶点。采用“Cytohubba”插件通过Closeness，Degree，Radiality，Betweenness和Clustering Coefficient等参数，对各个节点在全网络中的关键性进行评估，Degree值越高，蛋白间相互作用的可信度越高。因此，作者导出的前30个靶点可以认定为该网络中的关键靶点。选取Degree值前10的蛋白靶点与所得到的3个关键活性成分，在Pubchem和PDB数据库下载上述成分的3D结构，使用autodock vina软件进行分子对接结果预测[19]。
1.6 基因本体论(gene ontology，GO)分析和KEGG通路富集分析使用David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对旋覆花作用于骨质疏松症的180个潜在作用靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析[20]，P < 0.01为筛选参数。GO分析主要包含3个方面：生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。KEGG富集分析潜在靶点富集的相关生物通路。使用ImageGP在线作图工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/)对GO分析和KEGG分析的结果进行可视化转换，制作气泡图。其中GO分析各自选取BP、CC及MF中可信度前10的蛋白质群注释，KEGG分析的结果选取可信度前30的通路。
1.7 主要观察指标旋覆花有效药物活性成分及其ADME指标、旋覆花有效药物活性成分用于治疗骨质疏松症的潜在作用靶点、关键有效药物成分和关键靶点分子的筛选及分子对接结果、GO和KEGG通路富集结果。

讨论

骨质疏松症的治疗一直是困扰医学界的一个难题，而新的治疗药物的研发一直在不断进展。在20世纪80年代，医生只能通过为绝经后妇女提供雌激素，少部分会配合使用降钙素、钙和维生素D补充剂，来治疗骨质疏松。自2017年开始，骨质疏松症治疗的选择开始变得多样化[21-23]，除了传统的雌激素等以外，还加入了选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐(阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐和唑来膦酸)及人抗核因子受体激活剂B配体的单克隆抗体(RANKL)。甲状旁腺激素相关肽类似物(Abaloparatide)和人源化硬化素单克隆抗体(Romosozumab)已经经过临床试验，开始逐步应用于临床。经典药物的使用存在各种各样的风险，如双膦酸盐可能提高颌骨坏死和不典型股骨骨折的风险，因此目前治疗使用率逐渐降低[19]。新药的研发会持续进行下去，这将是一个困难并且漫长的过程。
旋覆花是常见的中药，在中医治疗中被广泛应用。《中国药典》(2020版)记载，旋覆花性味苦、辛、咸，微温，归肺、脾、胃、大肠经，功能主治降气、消痰、行水、止呕[24]，用于风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸痛痞闷、喘咳痰多、呕吐噫气、心下结硬。现代药理学将挖掘中药包含的化学成分及其在疾病预防和治疗中所能起到的药理作用，视为很重要的一项研究内容。旋覆花中的化学成分在抗炎、抗肝衰竭、抗肿瘤及保肝等方面有一定的药理效用，但是其本身在骨质疏松症治疗中的应用尚未有人研究。作者希望通过此研究挖掘旋覆花在骨质疏松症治疗中的潜力，以期找到新的骨质疏松症治疗可用的药物。
文章参考网络药理学的新理念和技术，通过中药在线数据库对旋覆花的有效药物活性成分进行筛选，初步筛选出19个旋覆花药效成分，预测出262个旋覆花药效成分的潜在作用靶点；通过对GeneCards数据库和DrugBank数据库进行检索，预测出4 310个骨质疏松症治疗的潜在作用靶点；取交集后，得到了180个旋覆花作用于骨质疏松症的潜在靶点。通过数据分析和药物-成分-靶点-疾病网络中的相关度分析，观察到quercetin (MOL000098)、luteolin (MOL0000006)和kaempferol (MOL000422)此3个成分的共作用靶点数显著高于其他药效成分，可以认为此3个单体是旋覆花作用于骨质疏松症治疗过程中的关键有效药物成分。而分子对接结果显示，此3个活性成分与关键作用靶点之间的结合能力良好，这也进一步验证了作者的上述结论。
Quercetin中文名槲皮素，是一种天然黄酮类化合物，YUAN等[25]通过体内和体外实验验证，槲皮素能改善绝经后骨质疏松症模型大鼠骨结构和功能，增强骨髓间充质干细胞活性和成骨分化能力，这个作用可能与拮抗肿瘤坏死因子α诱导的核转录因子κB/β-Catenin信号通路有关。DERAKHSHANIAN等[26]通过大鼠体内实验，验证了槲皮素对治疗糖皮质激素性骨质疏松症有着比经典药物阿仑膦酸钠更好的效果和预后。槲皮素可以有效清除衰老、死亡的骨髓间充质干细胞，并且通过激活雌激素受体介导的信号通路从而促进骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞分化，有利于骨组织结构及功能的改善，在骨质疏松预防和治疗中有很重要的作用[25-27]。Luteolin中文名为木犀草素，也是一种天然黄酮类化合物，有研究通过体外细胞实验，表明木犀草素可减轻甲基乙醛对成骨细胞MC3T3-E1的细胞毒作用，有可能作为一种预防糖尿病骨病变的药物[28]。有研究通过体内外实验，提出木犀草素有可能通过减少破骨细胞分化和功能来预防绝经后骨质疏松症的骨丢失[29]。JING等[30]在进行体内外实验后，提出木犀草素通过抑制氧化应激促进细胞增殖，通过调节ERK/LRP-5/GSK-3β的表达促进成骨细胞的分化，在治疗糖皮质激素诱导的骨质疏松症中具有很重要的研究意义。Kaempferol中文名为山奈酚，同样是天然黄酮类化合物。有研究通过大鼠实验，验证了山奈酚对雌激素缺乏所致大鼠骨结构紊乱有一定的治疗作用[31]。KIM等[32]通过细胞实验，指出山奈酚通过降解p62/SQSTM1来激活细胞凋亡，抑制破骨细胞生成。有研究提出山奈酚可以刺激雌激素信号转导，继而激活Wnt信号转导通路，从而达到骨保护的作用[33]。WONG等[34]总结各学者的研究，提出山奈酚的抗骨质疏松作用是通过调节雌激素受体、骨形态发生蛋白2、核转录因子κB、丝裂原活化蛋白激酶和哺乳动物雷帕霉素靶标信号通路来实现的。山奈酚对骨骼有良好的作用，对治疗骨质疏松症有潜在的效果。
作者对GO分析结果进行分析发现，旋覆花对于骨质疏松症的潜在作用靶点主要集中在细胞增殖与凋亡、衰老、雌激素、细胞对缺氧的反应等生物过程中。细胞增殖与凋亡和骨质疏松症的发生发展和治疗是息息相关的，成骨细胞凋亡在骨的发育和维持中起着重要作用，最初聚集在吸收窝处的成骨细胞有60%-80%会因凋亡而死亡，性激素缺乏、糖皮质激素过量或衰老引起的骨丢失部分归因于成骨细胞和骨细胞的凋亡，甲状旁腺激素、双膦酸盐和降钙素通过抑制成骨细胞和骨细胞的凋亡对骨产生合成代谢作用[35]。而大多数成年人的骨骼疾病都与破骨细胞的过度活跃有关，治疗骨质疏松症的关键就与抑制破骨细胞的增殖和活化息息相关[36]。众所周知，激素因素和衰老都是骨质疏松症的重要病因或诱因，而雌激素缺乏症在骨质疏松症的发展中更是起到关键作用[37-38]。旋覆花可以作用于与这些因素相关的靶点，这在将其应用于骨质疏松症治疗中，有着至关重要的作用。氧化应激与骨质疏松症的关系也是十分密切的，它可以改变骨重建过程，导致破骨细胞和成骨细胞活性之间的失衡，引发代谢性骨疾病，并导致骨骼系统紊乱的发病机制，以骨矿密度降低和骨量减少为特征的骨质疏松症就是其中最显著的表现[39]。GO分析的结果表明，旋覆花的潜在治疗靶点在与细胞缺氧有关的生物过程中也有所富集，这表明旋覆花对骨质疏松症的治疗与抑制氧化应激过程有关。
信号通路一直是现代分子生物学的研究热点，也是生物信息学分析中从来都不可缺少的一个关键部分。作者通过KEGG通路富集分析，观察到旋覆花对骨质疏松症的治疗作用，可能与许多通路有关，其中能参与调控骨质疏松症的信号通路主要包括PI3K-Akt信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、破骨细胞分化、Toll样受体信号通路、FoxO信号通路、T细胞受体信号通路和肿瘤坏死因子信号通路。PI3K-Akt信号通路被多种细胞或因子刺激所激活，调节细胞的转录、翻译、增殖、生长和存活等基本功能。XI等[40]通过体内外研究表明，PI3K/Akt细胞信号通路可以通过促进成骨细胞增殖、分化和成骨而抑制骨质疏松。缺氧诱导因子1是一种缺氧诱导因子，与细胞氧化应激反应息息相关。ZHU等[41]通过模拟缺氧模型，分析后得出缺氧诱导因子11α通过激活MLO-Y4细胞中的JAK2/STAT3途径来促进RANKL的表达，从而影响破骨细胞的发生。破骨细胞具有骨吸收作用，骨质疏松症的发病就与破骨细胞过度分化有关[35]。T细胞是免疫系统有效应答的关键细胞之一，Toll样受体家族也与微生物病原体和先天性免疫应答有关。先天性免疫应答(IIR)有助于炎症的发展和维持，而炎症反应与骨骼代谢也密切相关[42-43]。在肌肉骨骼系统中，软骨细胞和成骨细胞配备了建立这些先天性免疫应答所必需的分子库，其中包括几种toll样受体的表达。具体而言，间充质干细胞、成骨细胞和骨细胞中的Toll样受体4(TLR4)激活已参与了分解代谢和合成代谢过程[44]。针对Toll样受体通路进行靶向作用，对于调节成骨细胞代谢和炎症反应、缓解骨质疏松症很可能有潜在的疗效。FOXO信号通路家族在细胞凋亡、细胞周期调控、糖代谢、抗氧化能力和寿命等细胞生理事件中调控基因的表达，可以在成骨细胞中促进蛋白质合成并随后抑制细胞周期停滞来保持氧化还原平衡[45-46]。对FOXOs功能丧失或获得模型进行研究表明，FOXOs调节骨细胞功能及其细胞间信号转导，进而控制影响骨骼发育，改变骨量，并导致几种骨骼疾病，如骨关节炎、年龄相关性或雌激素缺乏性骨质疏松症[47]。肿瘤坏死因子是细胞凋亡以及炎症和免疫的主要介体，它与多种人类疾病的发病机制有关，包括败血症、糖尿病、癌症、骨质疏松症、多发性硬化症、类风湿关节炎和炎症性肠病[48]。ZHA等[49]通过对绝经后骨质疏松症妇女和骨代谢正常的同龄妇女进行比对，得出结论，肿瘤坏死因子α可以通过激活核转录因子κB和PI3K/Akt信号传导协同促进RANKL诱导的破骨细胞形成。综上所述，旋覆花对于骨质疏松症的治疗作用，在分子水平上与上述信号通路有着直接或间接的关联。
文章针对性地预测了旋覆花对于骨质疏松症治疗作用大量的靶点和通路，但仍有一些局限性。下一步的研究需要以筛选出的关键靶点与通路为基础，进行药理学实验，验证槲皮素、木犀草素和山奈酚等应用于骨质疏松症治疗的具体机制及其药效强度。可以通过对小鼠造模，注入不同浓度药物后，通过micro-CT观察其在不同浓度和时间梯度下胫骨骨体积和骨参数的变化，通过ELISA实验验证其作用前后蛋白表达水平的变化，如果给药组与不给药组之间存在明显的破骨细胞数量与活性的差别，那么就可以证明其在骨质疏松症治疗中的潜在价值。接下来还可以对药物与已知生物材料相结合，验证其在组织工程再生中的应用价值。
综上，文章创新性的利用网络药理学技术和计算机分子对接技术对旋覆花的有效药效活性成分及其作用靶点和骨质疏松症的治疗靶点进行筛选和预测，为后续应用旋覆花治疗骨质疏松症提供了理论基础。虽然研究指出了很多作用靶点和信号通路，但具体的治疗效果和机制，仍然需要借助下一步的药理实验以及与生物材料结合等方式加以验证，来为应用于临床治疗提供更有力的依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中药旋覆花治疗骨质疏松症作用机制的网络药理学分析

Mechanism of Inulae flos in the treatment of osteoporosis: an analysis based on network pharmacology

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