丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤：可能的分子机制及生物学过程

doi:10.12307/2021.296

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (35): 5656-5661.doi: 10.12307/2021.296

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丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤：可能的分子机制及生物学过程

温明韬1，许波1，李嘉程1，刘金豹1，李刚2

1山东中医药大学，山东省济南市 250355；2山东中医药大学附属医院骨科，山东省济南市 250014

收稿日期:2020-11-30 修回日期:2020-12-05 接受日期:2021-01-16 出版日期:2021-12-18 发布日期:2021-08-05
通讯作者: 李刚，博士，教授，博士生导师，山东中医药大学附属医院骨科，山东省济南市 250014
作者简介:温明韬，男，1995年生，山东省聊城市人，在读硕士，主要从事骨与关节创伤的基础与临床研究
基金资助:
国家自然科学基金项目(81774333，81373660) ，项目负责人：李刚

Tanshinone IIA treats vascular system injury: possible molecular mechanism and biological processes

Wen Mingtao1, Xu Bo1, Li Jiacheng1, Liu Jinbao1, Li Gang2

1Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2020-11-30 Revised:2020-12-05 Accepted:2021-01-16 Online:2021-12-18 Published:2021-08-05
Contact: Li Gang, MD, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Wen Mingtao, Master candidate, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774333 and 81373660 (both to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
丹参酮ⅡA：为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，是中药丹参的重要药效活性物质基础之一，属于脂溶性菲醌类化合物，发挥保护心脏和神经、抗癌、抑菌等作用。
分子对接：是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
背景：丹参酮ⅡA是中药丹参分离得到的最丰富的脂溶性成分之一，发挥保护心脏和神经、抗癌、抑菌等作用，目前还没有系统分析丹参酮ⅡA在血管损伤治疗方面的作用机制研究。
目的：旨在通过生物信息学和分子对接技术系统探索丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤的作用机制。
方法：研究利用TCMSP数据库检索丹参酮ⅡA的口服利用吸收度(OB)和类药性(DL)，从GEO数据库下载编号GSE85871基因芯片，借助R语言分析其差异基因以获得丹参酮ⅡA的潜在靶点，利用DAVID 6.8数据库对潜在靶点完成GO分析和KEGG通路分析，利用CTD数据库挖掘与丹参酮ⅡA相关的疾病，利用Cytoscape软件构建丹参酮ⅡA的多靶点、多通路、多疾病可视化网络，采用AutoDock Vina进行蛋白与小分子对接验证。
结果与结论：①丹参酮ⅡA的口服利用吸收度值为49.89%、类药性值为0.4，具有良好的药物作用；②筛选出132个潜在靶点，在上述靶点及PPI网络中主要表现在基因共表达和物理互作，潜在靶点生物过程及通路主要富集在卵巢类固醇生成、细胞周期及类固醇激素生物合成等；③丹参酮ⅡA与乳腺肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、胶质瘤、血管系统损伤、左室肥厚、白血病及听力损失等疾病治疗相关；④分子对接结果显示丹参酮ⅡA与血红素加氧酶1、分泌型磷蛋白1等血管系统损伤相关蛋白具有较好的结合活性；⑤借助生物信息学手段和分子对接技术能系统地分析丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤可能的分子机制与生物学过程，为后续的进一步研究奠定了思路与基础。
https://orcid.org/0000-0002-1654-2264 (温明韬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丹参, 丹参酮ⅡA, 生物信息学, 分子对接, 作用机制

Abstract: BACKGROUND: Tanshinone IIA is one of the most abundant fat-soluble components isolated from Radix Salvia miltiorrhiza, which protects the heart and nerves, and exerts anti-cancer and antibacterial effects. There is no systematic study on the mechanism of tanshinone IIA in the treatment of vascular injury.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of tanshinone IIA in treating vascular system injury by bioinformatics and molecular docking.
METHODS: In this study, the oral bioavailability and drug-likeness of tanshinone IIA were searched by TCMSP database, and GSE85871 gene chip was downloaded from GEO database, and the differentially expressed genes were analyzed by R to obtain the potential target of tanshinone IIA. Gene ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of potential targets were carried out through DAVID6.8 database. CTD database was used to mine diseases related to tanshinone IIA, and Cytoscape was used to construct multi-target, multi-channel and multi-disease visualization network of tanshinone IIA. AutoDock Vina was used to verify the docking of proteins and small molecules.
RESULTS AND CONCLUSION: Tanshinone IIA had an oral bioavailability value of 49.89% and a drug-likeness value of 0.4, indicating a good drug effect. A total of 132 potential targets were screened out. Among the above targets and protein-protein interaction networks, they were mainly manifested in gene co-expression and physical interaction. The biological processes and pathways of potential targets were mainly enriched in ovarian steroid production, cell cycle and steroid hormone biosynthesis, etc. Tanshinone IIA was related to the treatments for breast tumors, hypertension, atherosclerosis, glioma, vascular system damage, left ventricular hypertrophy, leukemia, and hearing loss. The molecular docking results show that tanshinone IIA had good binding activity with vascular system damage-related proteins, such as heme oxygenase 1 and secreted phosphoprotein 1. With the help of bioinformatics methods and molecular docking technology, the possible molecular mechanism and biological process of tanshinone IIA in the treatment of vascular system damage can be systematically analyzed, which lays the idea and foundation for further research.

Key words: Radix Salvia miltiorrhiza, tanshinone IIA, bioinformatics, molecular docking, mechanism of action

中图分类号:

温明韬, 许波, 李嘉程, 刘金豹, 李刚. 丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤：可能的分子机制及生物学过程[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5656-5661.

Wen Mingtao, Xu Bo, Li Jiacheng, Liu Jinbao, Li Gang. Tanshinone IIA treats vascular system injury: possible molecular mechanism and biological processes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(35): 5656-5661.

图/表（结果） 7

2.1 丹参酮ⅡA的药代动力学参数通过TCMSP数据库深入研究了与丹参酮ⅡA药代动力学相关的重要特性的信息，包括口服生物利用度、类药性、Caco-2、血脑屏障和Lipinski类药五原则[24](Mw、AlogP、TPSA、Hdon、Hacc)，见表1。值得注意的是，丹参酮ⅡA的口服生物利用度值为49.89%、类药性值为0.4，具有良好的药物作用。

2.2 丹参酮ⅡA的潜在靶点利用R语言根据筛选标准分析GEO数据库中编号为GSE85871的原始数据，发现经丹参酮IIA处理后的MCF7细胞引起132个明显差异表达基因，其中85个上调基因和47个下调基因，聚类图及火山图见图2，3。

2.3 构建PPI网络的结果药物调控的内在机制往往不是单一靶点、单一通路决定的，而是受多个靶点、多条通路共同调控。将上述差异表达基因结果进行整理，采用GeneMANIA构建PPI网络显示，在132个靶蛋白及其相互作用蛋白中，76.27%具有相似的共同表达特征，14.91%具物理互作关系，3.83%具有共定位关系。其他结果，包括遗传相互关系、通路、预测和共享蛋白质结构域，见图4。

2.4 DAVID富集分析结果为了进一步分类丹参酮IIA潜在靶点的生物学功能，通过DAVID 6.8进行GO和Pathway通路富集分析。分析结果显示，潜在靶点的生物学过程(biological processes，BP)主要在核分裂、DNA模板转录负调控、细胞核蛋白质输出的正调控、对过氧化氢的细胞反应及P53类介导的DNA损伤反应及信号转导导致细胞周期阻滞等过程中明显富集，见图5A；细胞成分(cellular component，CC)的变化主要集中在细胞核、核浆、细胞溶质、薄膜及CHOP-ATF3配合物等，见图5B；分子功能(molecular function，MF)的变化主要表现在蛋白质结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合、锌离子结合、聚(A)RNA结合、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶活性等，见图5C。KEGG通路分析表明潜在靶点主要在卵巢类固醇生成、细胞周期及类固醇激素生物合成中富集，见图5D。

2.5 丹参酮ⅡA相关治疗疾病采用CTD数据库检索到与丹参酮ⅡA直接治疗证据的疾病主要包括乳腺肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、胶质瘤、血管系统损伤、左室肥厚、白血病及听力损失等，见表2。

2.6 分子对接结果血管系统损伤关键靶点主要包括血红素加氧酶1(HMOX1)、分泌型磷蛋白1(SPP1)、肿瘤坏死因子(TNF)。分子对接方法通过匹配原则算法计算结合能模拟蛋白质与小分子受体互作。若配体与受体结合能量越低，则结合构象越稳定，相互作用的可能性越大。研究表明，结合能量< -20.9 kJ/mol，受体与配体的结合效果较强。此次研究分子对接结果验证表明，丹参酮ⅡA与肿瘤坏死因子(TNF， -38.51 kJ/mol)、血红素加氧酶1(HMOX1，-37.67 kJ/mol)、分泌型磷蛋白1(SPP1，-28.04 kJ/mol)结合能量均 < -20.93 kJ/mol，提示化合物与受体有较好的结合活性。丹参酮ⅡA与血管系统损伤相关受体分子对接模式见图6。

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引言

丹参首见于《神农本草经》，性味苦，微寒，归心、肝经，其药用部位主要为干燥根及块茎，已被广泛应用于治疗血管类疾病[1-2]。丹参酮ⅡA是中药丹参的重要药效活性物质基础之一，属于脂溶性菲醌类化合物，发挥保护心脏和神经、抗癌、抑菌等作用[3-6]，但目前还没有系统分析丹参酮ⅡA在血管损伤治疗方面的作用机制研究，而股骨头周围血管损伤的相关机制正是骨科研究者们重点关注的内容之一[7-10]。
股骨头周围血运受损是股骨头缺血性坏死的重要发生机制，股骨头动静脉血运受损或中断导致骨组织坏死重建过程，继而发生髋关节周围结构改变，引起髋关节疼痛及功能障碍[11-12]。在非创伤性股骨头坏死的病理变化中，股骨头周围血运的变化可以分为3期：股骨头血运变化早期，股骨头血供不足，周围骨组织出现坏死征象，小静脉回流受阻造成骨内高压状态；中期进一步发展，静脉血栓状况加剧，动脉系统供血受到影响进入缺血状态，股骨头周围骨组织开始出现软骨下骨折、囊性变及股骨头部分塌陷；血运变化的晚期，动脉内皮组织不断增生，开始出现结构缺失，进展为动脉闭塞，股骨头塌陷进一步加重。在创伤性股骨头坏死的病理表现中，初期就出现了严重的缺血状态，并逐步发展为血运变化的晚期状态[13-14]。对于股骨头缺血性坏死的治疗不仅仅在于骨组织的再生与修复，有效的股骨头周围血管再生与骨组织的再血管化同样重要。因此，探讨丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤的作用机制对于进一步研究股骨头缺血性坏死的治疗手段具有重要意义。
此次研究创新性采用TCMSP数据库整体评价丹参酮ⅡA的药理学参数，通过筛选丹参酮ⅡA潜在的作用靶点，构建分析蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，完成基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析，检索与丹参酮ⅡA相关的治疗疾病及靶点，并构建“成分-靶点-通路-疾病”网络，为进一步深入研究或开发利用丹参及丹参酮ⅡA提供数据支持。丹参酮ⅡA的化学结构及预测机制的路线图见图1。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计网络药理学和分子对接技术分析。
1.2 时间及地点实验于2020年11月在山东中医药大学完成。
1.3 检索丹参酮ⅡA的药代动力学参数和评价中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)是一个评价中草药药理学的计算系统生物学医学平台[15]，该数据库不仅包含化学物质、靶标和药物靶点网络、相关药物靶点网络，还涉及中药化学成分的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)[16]、类药性(drug-likeness，DL)[17]、Caco-2通透性(Caco-2 permeability，Caco-2)、半衰期(half-life，HL)[18]、血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)等天然化合物的药代动力学特性[19]。口服生物利用度基于TCMSP数据库中的内部模型OBioAvail 1.1计算所得代表口服药物最重要的药代动力学特性之一，对全身循环给药的效率起着重要的作用。类药性依赖于数据库中分子描述符和tavioto系数所构建，是一个定性的概念，主要用于药物设计以评估化合物的类药性。此次研究以“丹参酮ⅡA”为搜索词，检索丹参酮ⅡA的口服利用吸收度和类药性，从分子水平评价丹参酮ⅡA的药代动力学参数。
1.4 潜在靶点的筛选从基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)下载与丹参酮ⅡA相关的编号GSE85871基因芯片原始数据及GPL571平台注释文件[20]，GSE85871数据集中包含102个不同的中药分子分别处理MCF7细胞的基因表达谱信息，其中包含丹参酮ⅡA的样本2个，空白对照样本6个。使用R语言Affy包和limma包进行归一化和差异表达基因筛选，使用差异倍数(fold change，FC)和P值进行质量控制，标准为P值< 0.01，|log2FC|≥1；利用gplots包绘制聚类图，plot包绘制火山图。
1.5 PPI网络的构建 GeneMANIA是主要用于生成关于基因功能的假设、分析基因列表并为功能测试确定基因优先级[21]，将上述差异表达基因结果进行整理，采用GeneMANIA构建PPI网络，分析靶点及其在网络中发挥的作用与关系。
1.6 DAVID富集分析注释、可视化和集成发现生物信息学工具(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID)是一个基于Web的软件工具包[22]，能有效地帮助理解基因表达数据中的相互作用关系，并提供有关感兴趣基因的系统信息。利用DAVID 6.8对潜在靶点进行GO和 KEGG信号通路富集分析，利用ggplot2包绘制富集分析气泡图。
1.7 相关治疗疾病的检索比较毒理学数据库(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)是一个强大的、公开的数据库[23]，旨在提高对环境暴露如何影响人类健康的了解。比较毒理学数据库集成了医学主题标题的化学子集，可以查看有关化学物质的各种信息，包括化学结构、策划相互作用的基因和蛋白质、策划和推断疾病关系，以及丰富的途径和功能注释。以“丹参酮ⅡA”为搜索词，检索与其相关的治疗疾病。
1.8 分子对接验证从Pubchem 数据库中下载丹参酮ⅡA化合物的sdf 文件，导入Chemoffice软件，保存为小分子配体pdbqt 格式。从 PDB 数据库(https://www.rcsb.org)下载与血管系统损伤相关靶点的3D 结构，通过PyMOL 软件对蛋白质进行移除水分子和多余的非活性配体，导入 AutoDock Tools软件加氢、加电荷处理，输出为蛋白受体 pdbqt 格式。借助AutoDock Vina软件绘制格点能地图，根据格点参数文件，用autogrid 4查看能量地图，选择“Genetic algorithm”计算方法，借助autodock 4运行分子对接，对对接结果中构象的Blind energy进行打分，确定全局最优结合构象，利用PyMOL 将对接结果可视化。
1.9 主要观察指标 ①丹参酮ⅡA的药代动力学参数；②丹参酮ⅡA的潜在靶点、构建的PPI网络、DAVID富集分析、相关的疾病及分子对接结果。

讨论

药物动力学和毒性不良是药物开发后期失败造成高额代价的重要原因之一，采用预测和模拟药物动力学、代谢和毒性终点等方式可以在一定程度上简化和加速药物发现过程，受到越来越多的研究人员青睐[25]。
口服生物利用度代表口服剂量不变的药物到达全身循环的百分比，显示药代动力学过程的收敛性。口服生物利用度通常是决定生物活性分子作为治疗药物的药物性质的一个关键指标。类药性是根据对现有小分子药物和候选药物的理化性质和结构特征的分析而建立的，是药物设计中使用的定性概念，用于对药物类“预期化合物”进行评估，有助于优化药代动力学和药物性质，例如溶解度和化学稳定性。TCMSP数据库建议参考标准为口服生物利用度≥30%，类药性≥ 0.18。由表1可知，丹参酮ⅡA的性质均符合上述要求，这意味着丹参酮ⅡA是一个很好的药物发现的候选[26-28]。
丹参酮ⅡA是丹参的主要脂溶性成分，近年来的药理学研究表明，丹参酮ⅡA在血管系统损伤疾病的治疗中取得了良好效果，其作用机制包括抗炎、抗氧化及抗血栓等方面[29-30]，在抑制血管内皮细胞增生与炎性分子表达方面也发挥了重要作用[31]。而股骨头周围动静脉损伤作为股骨头缺血性坏死发病的主要机制，了解血管系统损伤的复杂过程，从根本上解决股骨头周围血运的重建过程十分重要。因此探讨丹参酮ⅡA在血管系统损伤治疗方面的机制与潜在靶点对于临床股骨头缺血性坏死的治疗具有重大意义。
此次研究选取的GEO数据库中编号GSE85871的数据集，涵盖了丹参酮ⅡA处理MCF7细胞后建立的基因表达谱，通过R语言数据分析共获得数据库的明显差异表达基因132个，包含85个上调基因和47个下调基因。这些差异基因在一定程度上可以认为是丹参酮ⅡA的潜在作用靶点，而且这些丹参酮ⅡA潜在靶点中的某些靶点的药理作用在文献中已经被确定。XU等[32]研究结果表明，丹参酮ⅡA能有效增加缺氧诱导因子的表达，进而上调血管内皮生长因子的表达，发挥改善心功能，保护心肌及抗心肌肥厚的功能。周丽等[33]研究证实，丹参酮ⅡA可以通过降低缺血再灌注大鼠模型脑组织核因子κB 和 IκB 基因及蛋白的表达水平，减少对神经元的损伤，发挥保护脑缺血再灌注损伤的作用。王炎等[34]发现丹参酮ⅡA能下调血管内皮生长因子和β-catenin基因及蛋白的表达，抑制裸鼠人肠癌皮下移植瘤的生长和微血管的生成，进而发挥抗肿瘤的作用。
为了更好地理解丹参酮ⅡA潜在靶点的功能，利用DAVID 6.8进行了GO和KEGG信号通路分析，潜在靶点主要富集在核分裂、DNA模板转录负调控、细胞核蛋白质输出的正调控等生物学进程和卵巢类固醇生成、细胞周期及类固醇激素生物合成等KEGG信号通路中。此次研究通过检索CTD发现8种与丹参酮ⅡA有直接治疗证据的疾病，疾病主要包括乳腺肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、胶质瘤、血管系统损伤、左室肥厚、白血病及听力损失。由表2可知，这些疾病文献中支持的靶点与此次研究筛选的差异基因存在大量重合现象，再一次佐证了研究思路的可行性。
分子对接结果显示，丹参酮ⅡA在与血管系统损伤相关靶点的对接中具有良好的结合活性。血管系统损伤相关靶点中，肿瘤坏死因子是经典的刺激细胞增殖并诱导细胞分化过程的细胞因子，可以与白细胞介素1B与白细胞介素6协同诱导血管内皮生长因子的产生过程，在血管生成过程中发挥了重要作用[35]，通过激活血管内皮生长因子的受体基因血管内皮生长因子受体2可以正向调控微血管的新生与分化过程[36-37]，研究表明，血管内皮生长因子联合突变型缺氧诱导因子1α在激素性股骨头缺血性坏死修复中增强了血管生成作用[38]，血管内皮生长因子与酸性成纤维细胞协同作用促进血管新生[39]。血红素加氧酶1可以调控血红素的分解代谢作用，并且被认为是一种理想的细胞保护剂，通过抗炎、抗氧化作用等机制发挥作用，是细胞中和各种应激刺激时所采取的广泛策略[40]。分泌型磷蛋白1是一种高度磷酸化的糖蛋白，广泛存在于内皮细胞、骨髓等组织中，在骨组织中，它的释放来源于在骨结构形成时的成骨细胞与破骨细胞，这表明了它与骨破坏有关[41]。由结果可知，通过分子对接技术证明了丹参酮ⅡA与在血管系统损伤类疾病相关靶点拥有较好的结合效果，进一步证实了其在血管系统损伤方面的治疗潜力。
综上所述，此次研究采用TCMSP数据库对丹参酮ⅡA的药代动力学参数进行了评价，通过高通量芯片数据确定其潜在靶点，并进行进一步的生物学功能富集分析和分子对接技术表明，丹参酮ⅡA可能存在多种功能，包括抗炎抗氧化、调控血管新生、核分裂、卵巢类固醇生成、细胞周期及类固醇激素生物合成等，与丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤密切相关。丹参酮ⅡA将是一种在血管系统损伤疾病极具潜质的药物候选药物，但仍需更进一步的研究来确定精确的药理作用及其作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丹参酮ⅡA治疗血管系统损伤：可能的分子机制及生物学过程

Tanshinone IIA treats vascular system injury: possible molecular mechanism and biological processes

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