膝关节骨性关节炎中退变半月板的生物信息学分析

doi:10.12307/2021.166

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (29): 4664-4671.doi: 10.12307/2021.166

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膝关节骨性关节炎中退变半月板的生物信息学分析

黄晖1，郑佳璇2，方业汉1，王广积1

海南省人民医院，1运动医学科，2病理科，海南省海口市 570311

收稿日期:2020-07-13 修回日期:2020-07-15 接受日期:2020-09-11 出版日期:2021-10-18 发布日期:2021-07-22
通讯作者: 王广积，硕士，主任医师，海南省人民医院运动医学科，海南省海口市 570311
作者简介:黄晖，男，1985年生，湖南省人，汉族，2020年南方医科大学毕业，博士，副主任医师。郑佳璇，女，1989年生，广东省人，汉族， 2015年汕头大学毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
海南省重点研发计划(ZDYF2019180)，项目负责人：王广积

Bioinformatics analysis of degenerative meniscus in knee osteoarthritis

Huang Hui1, Zheng Jiaxuan2, Fang Yehan1, Wang Guangji1

1Department of Sport Medicine, 2Department of Pathology, Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China

Received:2020-07-13 Revised:2020-07-15 Accepted:2020-09-11 Online:2021-10-18 Published:2021-07-22
Contact: Wang Guangji, Master, Chief physician, Department of Sport Medicine, Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China
About author:Huang Hui, MD, Associate chief physician, Department of Sport Medicine, Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China Zheng Jiaxuan, Master, Attending physician, Department of Pathology, Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China
Supported by:
Key Research & Development plan of Hainan Province of China, No. ZDYF2019180 (to WGJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生物信息学：作为一门新的学科领域，它是把基因组DNA序列信息分析作为源头，在获得蛋白质编码区的信息后进行蛋白质空间结构模拟和预测，然后依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。基因组信息学、蛋白质空间结构模拟以及药物设计构成了生物信息学的3个重要组成部分。
生物信息学研究内容：生物信息学应包括这3个主要部分：①新算法和统计学方法研究；②各类数据的分析和解释；③研制有效利用和管理数据新工具。

背景：半月板退变是膝关节骨性关节炎的表现之一，但其具体的分子机制仍不清楚。
目的：探讨骨性关节炎退变半月板可能的分子生物学机制。
方法：采用五指山猪的前交叉韧带切除法制备半月板退变猪模型，应用基因芯片技术检测在退变半月板组织中的差异表达基因，运用GO分析、通路分析和核心基因网络分析来发现相关的调控网络。
结果与结论：①研究共检测到差异表达基因893个，其中cyp2c33，gcnt7，ncdn，exd3，MUC13，ppp1r3d，nphp3，upb1，CD81和prph差异表达最显著；②GO分析中显示的一氧化氮生物合成过程的调节、通路分析中发现的TRP通道、核心基因网络分析中检测出的MDFI基因等在引起半月板退变过程可能发挥关键作用；③上述数据说明，实验建立了可靠的半月板退变的动物模型，比较完整地揭示了骨性关节炎半月板退变基因谱的差异表达基因和所涉及的生物学过程和信号通路，为未来该疾病的诊断和治疗提供分子靶标。

https://orcid.org/0000-0002-2572-8546 (黄晖) ；https://orcid.org/0000-0003-0063-4014 (郑佳璇)；https://orcid.org/0000-0002-2396-3614 (王广积)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 软骨, 骨性关节炎, 膝关节, 半月板, 软骨细胞, 退变, 基因, 生物信息学, 通路

Abstract: BACKGROUND: Meniscus degeneration is one of the manifestations of knee osteoarthritis, but its specific molecular mechanism is still not very clear.
OBJECTIVE: To explore the possible molecular biological mechanism of meniscus degeneration in knee osteoarthritis.
METHODS: A meniscus degeneration model was prepared in Wuzhishan pigs through resection of the anterior cruciate ligament. Gene chip technology was used to detect differentially expressed genes in degenerated meniscus tissue. Gene oncology analysis, pathway analysis, and core gene network analysis were performed to discover relevant regulatory networks.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 893 differentially expressed genes were detected in the study, of which cyp2c33, gcnt7, ncdn, exd3, MUC13, ppp1r3d, nphp3, upb1, CD81 and prph were differentially expressed most significantly. The regulation of nitric oxide biosynthetic process in gene oncology analysis, TRP channel in pathway analysis, and MDFI gene in core gene network analysis may play key roles to induce meniscus degeneration. In short, we have established a reliable animal model of meniscus degeneration, and more completely revealed the differentially expressed genes, biological processes and signal pathways related to meniscus degeneration after knee osteoarthritis. These will provide molecular targets for the diagnosis and treatment of the disease in the future.

Key words: cartilage, osteoarthritis, knee joint, meniscus, chondrocyte, degeneration, gene, bioinformatics, pathway

中图分类号:

黄晖, 郑佳璇, 方业汉, 王广积. 膝关节骨性关节炎中退变半月板的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4664-4671.

Huang Hui, Zheng Jiaxuan, Fang Yehan, Wang Guangji. Bioinformatics analysis of degenerative meniscus in knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(29): 4664-4671.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析纳入海南五指山小型猪14只，无死亡和感染，均进入结果分析。
2.2 样品质量用NanoDrop ND-1000进行RNA定量和质量控制，所有样品的A260 nm/280 nm比值接近2.0，A260 nm/230 nm比值大于1.8。RNA变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，结果表明，28S和18S谱带明显，无其他明显杂带，无污染，无降解，见图1。综合质量控制结果合格。

2.3 骨关节炎组和假手术组差异表达基因变化使用
Geneprinting GX v12.1软件导入数据，绘制火山图见图2。结果共有893个差异表达基因，包括537个上调基因和356个下调基因。P值最低的10个基因是cyp2c33，gcnt7，ncdn，exd3，MUC13，ppp1r3d，nphp3，upb1，CD81和prph，见表2。

2.4 骨关节炎组和假手术组差异表达基因GO分析结果总共获得了55个被差异表达基因富集的生物学过程。其中P值最低的10个生物学过程分别是cellular response to hormone stimulus(细胞对激素刺激的反应)、response to hormone(对激素的反应)、sex determination(性别确定)、muscle fiber development(肌肉纤维发育)、mesenchyme morphogenesis (间质形态发生)、cellular response to endogenous stimulus(细胞对内源性刺激的反应)、C21-steroid hormone metabolic process(C21-类固醇激素代谢过程)、neuropeptide signaling pathway(神经肽信号通路)、negative regulation of reactive oxygen species metabolic process(活性氧代谢过程的负调控)和regulation of nitric oxide biosynthetic process(一氧化氮生物合成过程的调节)，具体信息见表3。

2.5 骨关节炎组和假手术组差异表达基因的通路分析共有36个差异表达基因显著富集的通路。P值最低的10个通路是Type Ⅱ diabetes mellitus(2型糖尿病)，hyroid hormone synthesis(甲状腺激素合成)，Taste transduction(味觉转导)，Prolactin signaling pathway(催乳素信号通路)，Longevity
regulating pathway(长寿调节途径)，Ovarian steroidogenesis(卵巢类固醇生成)，Neuroactive ligand-receptor interaction(神经活性配体-受体相互作用)，Inflammatory mediator regulation of TRP channels(TRP通道的炎性递质调节)，Pantothenate(泛酸)和CoA biosynthesis(CoA生物合成)，见表4。

2.6 核心基因网络分析结果该分析得到了40个核心基因，其中MDFI基因具有最多的连接数，表明它处于最核心的位置见图3，并列出相应基因数据来源见表5。

2.7 微阵列和RT-PCR结果比较实验通过RT-PCR确认了所选基因(GCNT7，NCDN，EXD3，MUC13，PPP1R3D，NPHP3，UPB1，CD81，PRPH和MDFI)的表达变化。选择前9个基因是因为它们的P值最低，选择MDFI是因为它是分析出的最核心的基因。10个mRNA (GCNT7，NCDN，EXD3，MUC13，PPP1R3D，NPHP3，UPB1，CD81，PRPH和MDFI)的RT-PCR表达水平与微阵列数据相当，见表6，图4，表现为上下调一致(均为上调)，且RT-PCR中各基因在骨关节炎组和假手术组之间的比较的P值均< 0.05。这些结果证明了微阵列和RT-PCR结果之间较强的一致性。

2.8 猪关节半月板组织学变化猪关节内大体观察见关节软骨颜色暗淡，软骨的表面不光滑，质地变软伴糜烂，关节周围见明显的骨质增生，滑膜充血水肿，关节液多且颜色轻度发黄，符合骨关节炎表现。半月板质地形态改变，伴有细小缺损糜烂，表面粗糙，颜色暗淡，弹性变差。苏木精-伊红染色见半月板胶原纤维紊乱且染色不均，排列稀疏；软骨细胞排列紊乱且减少，可见细胞肿胀，软骨陷窝减少或消失；局部纤维增多及玻璃样变。上述变化均符合半月板退变的组织病理学表现，见图5。

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(责任编辑：WJ，ZN，TXY)

引言

骨关节炎是以关节软骨磨损和骨赘形成为特征，然而越来越多的证据表明，骨关节炎不仅是一种关节软骨疾病，而且涉及到整个关节[1-2]。最近，骨关节炎滑膜和软骨下骨受到了极大的关注。在骨关节炎滑膜、骨关节炎成纤维样滑膜细胞和骨关节炎软骨下骨中检测到异常基因表达[3-4]，这些发现提示骨关节炎滑膜细胞和软骨下骨细胞可能参与了骨关节炎的发病过程。
很少有研究探讨骨关节炎半月板细胞在骨关节炎发病过程中的潜在作用。膝关节半月板是一种特殊组织，在载荷传递、减震和关节稳定性方面起着重要作用[5-6]，可以吸收关节处产生的大部分冲击，因为半月板的总质量大于关节软骨。目前认为半月板可以保护关节软骨，但在骨关节炎的发病过程中起着较小的作用，除非半月板受到损伤。然而，越来越多的证据表明膝关节半月板可能不是骨关节炎发病过程中的被动旁观者。据报道，半月板退变是骨关节炎膝关节的一个病理特征[7-8]，半月板损伤或退行性撕裂和软骨丢失之间有很强的相关性[9]。此外，还发现半月板退行性变对关节间隙有影响[10]。综上所述，这些发现和观察表明骨关节炎半月板也会发生病理改变和细胞外基质变性。骨关节炎半月板病理改变与滑膜、软骨下骨相似，可能在骨关节炎的发病过程中起积极作用。
由于半月板和关节软骨的组织组成非常相似，因此许多研究人员推测，半月板退变可能与软骨退变相似，由合成代谢和分解代谢之间的失衡导致退变，但具体机制尚不清楚。创伤、慢性炎症和细胞凋亡等可能是单方面或多方面参与其中，可能发挥作用的基因种类繁多，给半月板退化机制研究带来了一定困扰[11-12]。基因芯片技术具有信息量大、操作可靠、重复性好等优点，已成功用于基因表达检测、DNA测序、新基因搜索和疾病诊断等研究领域[13]。
文章利用基因芯片技术筛选退变的半月板和正常的半月板之间的差异表达基因，分析半月板退变的机制，为半月板退变的诊断和防治提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计，动物实验，两样本t检验。
1.2 时间及地点于2018年1月至2019年12月在海南省农业科学院畜牧兽医研究所和海南省人民医院中心实验室完成。
1.3 材料健康成年雄性海南五指山小型猪14只，体质量15-18 kg，猪龄六七个月，购自海南省农业科学院畜牧兽医研究所，动物许可证号：SCXK(琼)2014-0006。给予正常光照和饮食，温度20-28 ℃。实验方案经海南省人民医院实验动物保护和伦理委员会批准，批准号：Med-Eth-Re [2018] 01。
1.4 实验方法
1.4.1 分组、建模和取材将14只猪随机分为假手术组和骨关节炎组，每组7只。速眠新Ⅱ(0.3 mL/kg；吉林省敦化市圣达动物药品有限公司)与戊巴比妥钠(20 mg/kg；德国merck公司生产，上海榕柏生物科技公司分装)分别于双侧耳后单独注射，再行手术局部注射利多卡因5 mL麻醉实验猪。仰卧位固定、消毒。自左膝外侧作切口至关节腔，推开髌骨、髌韧带，屈曲膝关节，找到前交叉韧带并切断[14]。以抽屉实验确认膝关节失稳后，冲洗关节腔并逐层缝合，即为骨关节炎组。假手术组的左侧膝关节给予皮肤切开后立即缝合。所有猪术后3 d每日肌注160万单位青霉素钾1次以预防感染。动物均常规饮食饲养，不固定肢体，任其自由活动。
术后喂养24周后所有猪行安死术。所有动物麻醉后，在股三角区横切约10 cm长的切口，切断股动、静脉，猪处死后切开关节囊后尽量完整取出内侧半月板。每份半月板分为2部分，一部分液氮冷冻保存(基因芯片检测和RT-PCR用)，另一部分甲醛溶液固定(病理检查用)。

1.4.2 基因芯片实验采用美国Nanodrop公司的NanoDrop ND-1000评估RNA量和质量。RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行评估。使用芯片是美国安捷伦科技公司的AgilentPorcine 4x44K基因表达微阵列v2(猪)。将每个样品的总RNA线性扩增并用Cy3-UTP标记。标记的cRNA通过RNeasy Mini Kit (Qiagen)纯化。通过NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度和比活性(pmol Cy3 /μg cRNA)。加入11 μL的10×封闭剂和2.2 μL的25×Fragmentation Buffer裂解1 μg每个标记的cRNA，然后在60 ℃加热30 min，最后加入55 μL的2×GE杂交缓冲液稀释标记的 cRNA。将100 μL的杂交溶液分配到垫片载玻片中，并组装到基因表达微阵列载玻片上。将载玻片在安捷伦杂交炉中于65 ℃孵育17 h。将杂交的阵列洗涤，固定并使用美国安捷伦公司的Agilent DNA Microarray Scanner(部件号G2505C)进行扫描。

1.4.3 数据分析使用美国安捷伦公司的Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)获得芯片图，并读值得到原始数据。使用GeneSpring GX v12.1软件(Agilent Technologies公司)对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在14个样品中至少有7个被标记为Detected)进行差异表达基因分析，使用标准的富集计算方法进行GO分析和通路(Pathway)分析。
差异表达基因进一步行基因网络分析，并使人们更容易理解差异表达基因中的核心基因。将差异表达基因输入到GCBI平台(https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)，GCBI平台基于PubMed数据库、Mesh和KEGG数据库中基因与基因之间的相互作用关系来构建差异表达基因的核心网络。
1.4.4 实时RT-PCR检测用TRIZOL试剂(美国Invitrogen公司)从半月板组织中提取总RNA，然后取500 ng RNA合成cDNA。短暂离心后，在离心管中加入RT反应溶液(37 ℃恒温1 min)。轻轻移液几次可以均匀混合。在50 ℃孵育60 min；在70 ℃孵育15 min以灭活酶。将cDNA储存在-20 ℃下。使用2×PCR预混液在ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行PCR。引物信息见表1。设GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)为内部对照基因，以标准化添加到PCR反应中的RNA的量。所有反应均重复3次。

1.4.5 组织学观察取低温冻存的半月板，剔除周围软组织，生理盐水冲洗，常规固定、脱水、浸蜡、包埋，4 μm厚连续切片。常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察半月板组织。
1.5 主要观察指标各组差异表达基因变化。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。连续变量用x±s表示。对于每个微阵列数据的3次重复，使用几何平均值。两样本t检验用于两组数据间的比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

MUC13基因可能在退变半月板组织中起到重要作用。如果半月板退变是骨关节炎的一般特征，那么实验想评估骨关节炎半月板细胞是否不同于正常的半月板细胞，并且可能在骨关节炎的发展中发挥作用。为此，实验研究了骨关节炎半月板细胞与正常对照半月板细胞之间的差异基因表达。结果表明，共有893个差异表达基因被上调或下调两倍以上，其中537个为上调基因，356个为下调基因。实验发现10个基因表达最显著，分别为CYP2C33，GCNT7，NCDN，EXD3，MUC13，PPP1R3D，NPHP3，upp1，CD81和PRPH。其中，MUC13在病理条件下表达异常参与炎症和肿瘤的发生和发展[15-16]。实验发现MUC13在退行性半月板组织中高表达，高于正常半月板2.05倍，提示MUC13可能在半月板退变中甚至骨关节炎中起重要作用，这在以往研究中未见报道。MUC13可通过核转录因子κB依赖性途径促进核转录因子κB活性，并增加白细胞介素8的产生，白细胞介素88是一种重要的炎症因子[17]。因此，MUC13可能是通过MUC13的抗炎作用在退变半月板组织中发挥作用。
根据GO分析结果，55个生物学过程显著富集，这些生物学过程涉及激素、细胞凋亡、氧化及细胞增殖等方面。有研究报道骨关节炎中半月板组织涉及的生物学过程有免疫反应、炎症反应、生物矿物质形成和细胞增殖等[18]，其中涉及基因包括主要组织相容性复合体Ⅱ、整合素、核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1和成纤维细胞生长因子7，这与实验的研究有相似的地方。有研究报道，性激素的抑制作用似乎与半月板组织的囊性变性有关，生长激素和甲状旁腺激素对半月板和软骨细胞有影响[19-21]。与实验中发现性激素和激素的生物学过程显著富集存在一致性。这些研究共同提示了半月板退变可能涉及激素和性激素等方面的生物学过程。
一氧化氮的调节生物合成过程是实验GO分析中富集度最高的生物学过程之一。有研究证明一氧化氮诱导了软骨细胞的凋亡，一氧化氮是人类关节软骨细胞凋亡的主要原因[22-27]。实验结果显示半月板退变涉及的生物学过程有一氧化氮参与，软骨细胞和半月板细胞有相似的地方，提示一氧化氮诱导的细胞凋亡也发生在半月板细胞中，可最终导致半月板组织的退变。此次研究的发现和先前发现之间的一致性为实验的假设提供了强有力的支持，骨关节炎半月板细胞不同于正常的半月板细胞，可能在骨关节炎的发展中发挥积极作用，为了验证此发现，仍需要进一步的研究。
此次研究还发现TRP通道是通路分析中10个最低的P值之一，并提示了其在半月板退变中的关键作用。TRP通道作为多种细胞信号受体，它在炎症反应中起着非常重要的作用[28]。TRP通道可以通过组织损伤过程中产生的炎症递质(例如前列腺素E2、缓激肽、ATP、神经生长因子和促炎细胞因子)被间接调节。TRP通道的同系体广泛分布于众多哺乳动物组织细胞内，这是一个拥有近30种通道蛋白的总家族，而这些蛋白同系体则组合形成了为数众多的非选择性阳离子通道。通过这些通道的电流主要是由Ca2+及Na+构成。TRP通道作为多种细胞信号感受器，在炎症反应中发挥着十分重要的作用[29]。实验发现骨关节炎半月板中的TRP通道上调，这表明半月板的退变可能涉及TRP通道，并与炎症反应有关。TRP通道有望成为研究半月板退步机制新的方向。
文章结果找到了膝关节骨性关节炎半月板退变的核心基因MDFI。MDFI的功能是抑制肌源性因子Myod家族的反式激活活性并抑制肌发生[30]，通过与Myod家族成员相关联并通过掩盖其核定位信号将其保留在细胞质中来发挥作用；还可以干扰Myod家族成员的DNA结合活性；在滋养细胞和软骨形成分化中起重要作用；通过直接与TCF7L1/TCF3相互作用并阻止其与DNA结合来调节TCF7L1/TCF3的转录活性；与毒素复合物结合，导致游离β连环蛋白水平增加，影响WNT和JNK信号通路的毒素调节。MNT信号通路又是骨关节炎中的滑膜炎的核心信号通路之一[31]。这提示滑膜炎和半月板退变可能存在类似的或共同的作用机制，也说明了骨关节炎并非只是关节软骨的病变，滑膜和半月板组织均参与了骨关节炎的发病过程。
文章有不足之处：实验使用的是五指山猪骨关节炎半月板退变模型，其膝关节在生物力学上与人类有一定的差异，所以不能将动物模型研究情况完全等同于对骨关节炎患者的研究；此外，该模型更类似于人类创伤后(半月板损伤和交叉韧带损伤等)骨关节炎，并不是原发性骨关节炎最理想的动物模型[32-35]。然而相对于在研究人类标本中所涉及的伦理问题、样品量缺乏、标本的明显异质性和特殊部位的标本难以获取等诸多缺点，因此该动物模型是很理想的研究工具。
总之，有必要更好地理解半月板退变的发病机制，确定潜在的药物靶点，调节半月板退变的基因表达。文章是首次在五指山猪动物骨关节炎模型中进行半月板组织的全基因谱分析研究，此次研究的发现拓展了目前对骨关节炎半月板退变发病机制的认识。文章发现了一些新的可能的半月板退变关键的基因、生物学过程和通路，这些数据也为今后大量新发现的遗传物质在骨关节炎发病机制中的功能及其作为骨关节炎药物靶点的适宜性的研究提供了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

膝关节骨性关节炎中退变半月板的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of degenerative meniscus in knee osteoarthritis

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