聚丙交酯-乙交酯支架结合脂肪源性干细胞构建组织工程尿道

doi:10.12307/2021.243

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5484-5489.doi: 10.12307/2021.243

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

聚丙交酯-乙交酯支架结合脂肪源性干细胞构建组织工程尿道

李作为，傅强，宋鲁杰，李永辉，田斌强

上海市第六人民医院泌尿外科，上海市 200233

收稿日期:2020-06-28 修回日期:2020-07-03 接受日期:2020-08-15 出版日期:2021-12-08 发布日期:2021-07-27
通讯作者: 田斌强，医学博士，副主任医师，上海市第六人民医院泌尿外科，上海市 200233
作者简介:李作为，男，1981年生，汉族，博士，主治医师，主要从事尿道修复重建研究
基金资助:
上海市卫生和计划生育委员会科研基金(201440310)，项目负责人：李永辉

Poly(lactide-co-glycolide) scaffold combined with adipose derived stem cells in tissue-engineered urethral reconstruction

Li Zuowei, Fu Qiang, Song Lujie, Li Yonghui, Tian Binqiang

Department of Urinary, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai 200233, China

Received:2020-06-28 Revised:2020-07-03 Accepted:2020-08-15 Online:2021-12-08 Published:2021-07-27
Contact: Tian Binqiang, MD, Associate chief physician, Department of Urinary, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai 200233, China
About author:Li Zuowei, MD, Attending physician, Department of Urinary, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai 200233, China
Supported by:
Science Research Fund of Shanghai Health and Family Planning Commission, No. 201440310 (to LYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物电喷雾：电喷雾是利用多种材料和电场来制造不同成分、纹理和形状的微纳米结构，当细胞被电喷雾时，这种技术被称为生物电喷雾。生物电喷雾由一个基于喷射的输送系统连接到一个电场上，由于带电针头和电场的接地电极间的电位差使针头内的带电细胞悬浮液形成不稳定射流，可快速产生载细胞微液滴。该方法可实现单细胞递送，在三维结构中提供更均匀的细胞分布。
静电纺丝：被广泛用于均匀纳米纤维的制备，该方法简单、灵活且功能多样。聚合物、半导体、陶瓷和复合材料等多种材料已被用于制备各种纳米纤维。由于静电纺丝技术的可重复性及生产的简易性，在过去20年中静电纺丝已被广泛应用于生物组织工程。
背景：生物电喷雾与静电纺丝技术的结合能促进活细胞和支架材料的直接整合，可将细胞均匀地分布在支架纤维间，是制备含细胞支架的一种很有前景的替代方法。
目的：分析多方法结合制备富含脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells，ASCs)的聚丙交酯-乙交酯[(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]三维支架作为尿道组织重建材料的可行性。
方法：采用静电纺丝和细胞生物电喷雾相结合的方法将ASCs整合到PLGA中得到支架PLGA-ASCs，采用静电纺丝技术制备单纯PLGA支架，检测两种支架的微观结构、体外降解性能、机械性能与残留溶剂含量，MTT法检测PLGA-ASCs支架中的细胞活性。将PLGA-ASCs支架培养于37 ℃细胞培养箱内，培养1，7，15 d后，采用MTT法检测细胞活性，扫描电镜观察和共聚焦显微镜观察支架上的细胞生长与扩散。
结果与结论：①扫描电镜显示，两种支架的纤维表面光滑，其中ASCs随机分布在PLGA-ASCs支架上，PLGA-ASCs支架的纤维平均直径、支架厚度大于PLGA支架；PLGA-ASCs支架内的细胞存活率为(87.0±4.4)%，支架中的细胞整合效率为28%；②体外降解实验显示，PLGA支架的重均分子质量在前15 d下降较快，PLGA-ASCs的重均分子质量在15-45 d下降更快，至45 d时两组支架的重均分子质量无差异；③PLGA-ASCs支架的杨氏模量、最大载荷及最大延伸率低于PLGA支架；④在培养的1-7 d内，PLGA-ASCs支架内的细胞数量逐渐增加，在7-15 d内细胞数量无明显增加；⑤扫描电镜观察和共聚焦显微镜显示，随着培养时间的延长，PLGA-ASCs支架内的细胞数量逐渐增加并与支架整合；⑥结果表明，PLGA-ASCs具有良好的理化性能与生物活性，可作为尿道组织重建材料。
https://orcid.org/0000-0002-0816-067X (李作为)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 生物支架, 聚丙交酯-乙交酯, 静电纺丝, 电喷雾, 脂肪, 干细胞, 整合

Abstract: BACKGROUND: The combination of bioelectrospray and electrospinning can promote the direct integration of living cells and scaffold materials, and can distribute the cells evenly among scaffold fibers, which is a promising alternative to the preparation of scaffold containing cells.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility using multiple methods to prepare poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) three-dimensional scaffolds rich in adipose derived stem cells (ASCs) as urethral tissue reconstruction materials.
METHODS: The ASCs were integrated into PLGA by electrospinning and cell bio-electrospray method. The cell scaffold PLGA-ASCs was obtained. The pure PLGA scaffold was prepared by electrospinning. The microstructure, in vitro degradation, mechanical properties and residual solvent content of the two scaffolds were detected. The cell viability of PLGA-ASCs was detected by MTT assay. PLGA-ASCs were cultured in 37°C cell incubator for 1, 7 and 15 days. MTT assay was used to detect cell viability. Scanning electron microscopy and confocal microscopy were used to observe the growth and diffusion of ASCs on the scaffolds.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the fiber surface of PLGA-ASCs and PLGA scaffolds was smooth, and ASCs were randomly distributed on PLGA-ASCs scaffolds. The average fiber diameter and thickness of PLGA-ASCs scaffolds were larger than those of PLGA scaffolds. The cell survival rate in PLGA-ASCs scaffolds was (87.0±4.4)%, and the cell integration efficiency in PLGA-ASCs scaffolds was 28%. (2) In vitro degradation experiment showed that weight average molecular weight of PLGA scaffolds decreased rapidly in the first 15 days. The weight average molecular weight of PLGA-ASCs scaffolds decreased rapidly on 15-45 days. There was no difference in weight average molecular weight between the two groups at 45 days. (3) Young’s modulus, maximum load, and maximum elongation of PLGA-ASCs scaffolds were lower than those of PLGA scaffolds. (4) During 1-7 days of culture, the number of cells in PLGA-ASCs scaffolds gradually increased, and the number of cells in PLGA-ASCs scaffolds increased gradually from 7 to 15 days. (5) The results of scanning electron microscope observation and confocal microscope showed that the number of cells in PLGA-ASCs scaffolds increased gradually and integrated with the scaffolds with the extension of culture time. (6) The results showed that PLGA-ASCs had good physical and chemical properties and biological activity, and could be used as urethral tissue reconstruction materials.

Key words: material, biological scaffold, poly(lactide-co-glycolide), electrospinning, bioelectrospray, adipose, stem cells, integration

中图分类号:

李作为, 傅强, 宋鲁杰, 李永辉, 田斌强. 聚丙交酯-乙交酯支架结合脂肪源性干细胞构建组织工程尿道[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5484-5489.

Li Zuowei, Fu Qiang, Song Lujie, Li Yonghui, Tian Binqiang. Poly(lactide-co-glycolide) scaffold combined with adipose derived stem cells in tissue-engineered urethral reconstruction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5484-5489.

图/表（结果） 8

2.1 ASCs的鉴定和分化为证实干细胞表型在ASCs的传继代培养中保持不变，用阳性间充质干细胞标记物CD29、CD45和阴性间充质干细胞标记物CD31、CD45评估间充质特性。在90%以上的细胞中观察到阳性标记物CD29和CD45，在不到10%的细胞中观察到阴性标记物CD31、CD45，见图1。

CK7和UPⅢ是尿路上皮特异性蛋白，常用作尿路上皮细胞的生物标志物。诱导ASCs向尿路上皮表型分化7 d后，CK7和UPⅢ表达水平显著升高，见图2。综上所述，实验结果表明成功地分离了ASCs，其可向尿路上皮样细胞分化。

2.2 PLGA-ASCs支架的理化性质
2.2.1 纤维形态、纤维直径和支架厚度扫描电镜观察结果显示，PLGA支架和PLGA-ASCs的纤维表面光滑，细胞随机分布在整个PLGA-ASCs支架上，见图3。PLGA支架纤维平均直径为(1.8±2.3) μm，PLGA-ASCs纤维平均直径为(3.7±4.3) μm，二者比较差异有显著性意义(P < 0.001)。PLGA-ASCs的厚度为(137.4±45.7) μm，显著高于PLGA支架厚度(55.7±14.3) μm，二者比较差异有显著性意义(P=0.014)。

2.2.2 体外降解 PLGA组的Mw在前15 d下降较快，
PLGA-ASCs组在第15-45天间显示出更大的Mw降低，见图4。虽然降解期间观察到上述差异，但PLGA-ASCs和PLGA支架的最终Mw相似，组间比较差异无显著性意义。在45 d内，PLGA-ASCs和PLGA支架的Mw分别下降39%和32%。

2.2.3 机械性能支架的杨氏模量、最大荷载和最大伸长如图5所示，PLGA支架的力学性能测试值大于PLGA-ASCs(P < 0.05)。结果表明与PLGA支架相比，PLGA-ASCs支架的力学性能变化更大，这意味着与细胞整合后支架的机械性能降低，但PLGA- ASCs支架的机械强度大于50 MPa，仍足以支持干细胞生长。
2.2.4 残留溶剂含量在热重分析中，温度<200 ℃时的质量损失通常表示有机溶剂或水的挥发。PLGA-ASCs支架在暴露于该温度期间的质量损失为2.88%。根据该测量可以假设PLGA-ASCs支架中存在(0.35±0.76) mg(投入的总质量
12 mg×2.88%为损失的质量，损失的部分多为溶剂和水分)溶剂和/或湿度。

2.3 PLGA-ASCs支架的生物学特性
2.3.1 初始细胞数与细胞增殖生物电喷雾(与纤维电纺丝无关)后细胞活力为(92.0±4.2)%。同时，经生物电喷雾和静电纺丝后的细胞存活率为(87.0±4.4)%。通过比较样品和标准品的吸光度值，使用MTT实验评估PLGA-ASCs支架结构中ASCs的初始密度(图6)，纤维间融合的活细胞数平均为(5.123±1.012)×103/mm3。
PLGA-ASCs支架的总体积约为270 mm3，因此PLGA-ASCs总体积中的细胞数约为1.36×106。如前所述，对于生物电喷雾过程，使用2.60 mL/h流速和细胞浓度7.5×109 L-1的ASCs悬浮液，因此每个PLGA-ASCs支架的制备需0.65 mL的细胞悬液，对应于约4.88×106个细胞。
通过比较生物电喷雾的细胞数和PLGA-ASCs支架中的细胞数，评估支架的细胞整合效率。用该方法计算的细胞整合效率约为28%。PLGA-ASCs支架中ASCs的增殖如图6所示，在培养的第1-7天，活细胞数量显著增加(P < 0.001)，同时在第7-15天细胞数量无明显变化。

2.3.2 ASCs的分布与形态扫描电镜显示，PLGA-ASCs支架中的刚接种的ASCs呈圆形，在纤维上几乎没有附着点(图7A)，这一结果表明此时细胞与支架没有很强的黏附力；培养1 d后，ASCs与支架有多个接触点，相邻纤维之间形成桥，可观察到纤维网络上方和下方的细胞(图7B)；培养7， 15 d后，支架结构中出现更多的细胞(图7C，D)。

共聚焦显微镜图像显示，培养1 d后细胞呈现圆形形态(图8A)；经过7，15 d的培养，细胞表现出良好的扩散形态，第15天在PLGA-ASCs支架表层观察到更多的细胞(图8B，C)。

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引言

生物支架的应用效果取决于其与细胞的相互作用，静态接种是细胞与支架结合最常用方法[1]，然而该技术也存在一些缺陷，如播种效率低、三维结构中细胞分布不均、各层细胞渗透性差[2-3]。生物电喷雾是一种将活细胞悬浮液通过带电的针头喷雾产生含有细胞液滴的技术[4-5]。生物电喷雾与静电纺丝技术的结合能促进活细胞和支架材料的直接整合，可将细胞均匀地分布在支架纤维间，是制备富含细胞支架的一种很有前景的替代方法。
聚丙交酯-乙交酯[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]是一种具有良好生物降解性和生物相容性的材料，已被广泛用于组织工程[6]。PLGA支架是一种良好的缓释载体，可通过调节丙交酯和乙交酯的比例、聚合物的长度和聚合速率来调控药物释放[7]。此外，通过乳化剂和转速的调整，PLGA可被加工成多种形状和尺寸[8]，使其成为外科手术中填充硬组织或软组织的优选材料。基于这些特性，PLGA已被美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMA)批准应用于临床[9]。
干细胞具有自我更新和多向分化能力，脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells，ASCs)具有来源广泛、对供区损伤小的优点。近期研究表明，人ASCs与尿路上皮细胞共培养可表达尿路上皮特异性基因uroplakin Ⅰb和uroplakin Ⅱ，表明ASCs在协同因素刺激下可向上皮细胞分化[10-11]。尽管干细胞在组织工程中潜力巨大，ASCs在支架制备过程中与纤维直接结合的影响尚未见报道。实验结合生物电喷雾和静电纺丝技术构建细胞支架，评价ASCs与支架的整合效率及支架的理化、生物学性能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2018年11月至2020年1月在上海市第六人民医院中心实验室完成。
1.3 材料 PLGA(75∶25)、0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液、1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES；游离酸)、1A型胶原酶(Sigma-Aldrich公司，美国)；青霉素、链霉素、牛胎血清(Thermo Fisher Scientific，美国)；CK7(稀释1∶500， ab9021，Abcam，英国)；山羊血清(10%，HyClone，GE Healthcare Life Sciences，美国)；Santa Cruz Biotechnology，美国)；UPⅢ(稀释 1∶500，ab78196，Abcam，英国)；DAPI(1∶1 000，SC-3598，Santa Cruz Biotechnology，美国)；溅射镀金机(Bal-Tec-SCD 050)；扫描电子显微镜(JEOL-JSM-6060)；测微计(数字测微计 MDC-25MY；Mitutoyo)；凝胶渗透色谱(Viscotek VE 2001)；流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)；Q600 SDT热重/差示扫描量热仪(TA Instruments，美国)；™CCD摄像机(Photometricics Inc.，Tucson，AZ，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 ASCs的培养及细胞悬液的制备使用ZUK等[12]的方法分离和培养人ASCs。经上海市第六人民医院伦理委员会批准，在征得捐赠者/患者知情同意的情况下收集患者脂肪组织。首先将新鲜脂肪组织粉碎，然后用1 g/L的1A型胶原酶在37 ℃下振荡约60 min，直到细胞从组织中分离。脂肪悬浮液用等量的DMEM培养基稀释，并添加体积分数10%胎牛血清中和胶原酶。400×g离心10 min后，离心管底部的细胞在DMEM培养基中培养，该培养基含有2.5 g/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，并添加体积分数10%牛胎血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、0.45 mg/L庆大霉素，在37 ℃体积分数5%CO2孵箱中保存。培养基每二三天更换一次，当细胞在第5代生长90%时，用0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液分离细胞并在培养基中重新悬浮，进行流式细胞仪分析检测表面标志物表达，包括CD29、CD44、CD31和CD45，用于ASCs的鉴定。
1.4.2 诱导ASCs尿路上皮分化为诱导ADSCs向尿路上皮表型分化，向DMEM培养基中添加体积分数2%胎牛血清、2.5 µmol/L全反式维甲酸、20 µg/L表皮生长因子、10 µg/L肝细胞生长因子、10 µg/L角质形成细胞生长因子和0.5 mg/L氢化可的松来制备诱导培养基。在条件培养基中培养14 d，每隔2 d换一次培养基，以未诱导的ASCs作为阴性对照。
将ASCs在40 g/L多聚甲醛中室温孵育10 min，
-20 ℃乙醇中孵育20 min。随后在细胞培养基中加入体积分数10%山羊血清孵育30 min，阻断非特异性结合位点。固定细胞在4 ℃下用以CK7和UPⅢ为靶点的一级抗体和 37 ℃下孵育1 h，使用 Alexa-Fluor 488结合二级抗体进行免疫染色1 h。用DAPI染色2 min，置于载玻片上。图像是用高分辨率的CoolSNAP获得的™CCD摄像机由Leica FW4000软件版本1.2分析。
1.4.3 聚合物溶液制备将聚合物PLGA溶解在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，最终质量浓度为200 g/L，此后100 r/min过夜搅拌。
1.4.4 PLGA-ASCs支架的制备为将细胞整合到纤维支架中，将静电纺丝和生物电喷雾技术结合。首先将聚合物溶液在流速为0.54 mL/h、电压为15 kV、针(内径0.6 mm)到集电极板的距离为7.5 cm处电纺；以2.60 mL/h的流速、4 cm的距离和15 kV的电压对细胞悬液进行电喷雾；PLGA-ASCs形成于水平旋转板收集器(60 r/min)上。经过15 min的聚合物静电纺丝和细胞电喷雾，形成的PLGA-ASCs被DMEM浸没，并在37 ℃下体积分数5%CO2中培养。为进行理化分析，制备对照PLGA支架，采用与生产PLGA-ASCs相同的静电纺丝参数(0.54 mL/h，15 kV，7.5 cm)生产，不涉及生物电喷雾技术。
1.4.5 PLGA-ASCs支架的理化性质为进行理化分析，
PLGA-ASCs制备后立即用PBS清洗去除未结合的细胞，随后将样品在30 ℃下干燥24 h；PLGA支架使用PBS冲洗后，与PLGA-ASCs在相同条件下干燥24 h。
纤维形态、纤维直径和支架尺寸：在10 kV加速电压下，采用扫描电子显微镜对PLGA-ASCs和PLGA支架进行形貌分析。利用ImageJ 1.38×软件从扫描电镜照片中测量30根纤维的平均直径(n=30)。使用测微计测量支架厚度。
体外降解：将两种支架置于37 ℃ PBS(pH=7.4)中
100 r/min搅拌。样品在不同时间间隔(0，1，7，15，30，45 d)采集，用蒸馏水反复洗涤，30 ℃干燥。样品重均分子质量(Mw)的变化通过折射率检测器进行凝胶渗透色谱评估。将支架溶解在四氢呋喃中，45 ℃下以1 mL/min的流速洗脱，使用聚苯乙烯标准品获得校准曲线。
机械性能：将支架切成矩形(5 mm×12 mm)，在恒定温度(37 ℃)下进行实验，斜坡力为0.5 N/min，在0.005 N静载荷下直到最大载荷18 N，动态力学分析(n=5)测定
PLGA-ASCs和PLGA支架的杨氏模量、最大载荷和最大延伸率。
残留溶剂：称取约12 mg PLGA-ASCs样品在25 ℃处理5 min，随后以20 ℃/min的速率加热(从25-750 ℃)，最后以70 ℃/min的速率加热至800 ℃，采用热重分析法在氮气中测定样品(n=3)中残留溶剂含量。
1.4.6 PLGA-ASCs支架的生物学特性将PLGA-ASCs支架加入DMEM培养基稀释，并添加体积分数10%胎牛血清，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育，每2 d换一次培养液，所有样品一式3份。
PLGA-ASCs支架中的细胞活性：为评估PLGA-ASCs支架的细胞活性，将制备后的PLGA-ASCs支架用PBS清洗，100 r/min离心10 min，将得到的细胞重新悬浮在PBS中。用0.4%锥虫蓝(n=3)在Neubauer室中计数，测定电喷雾细胞的存活率。对照使用相同参数(流速2.60 mL/h，距离为4 cm，外加电压15 kV，持续15 min)，将细胞电喷雾到含有培养基的培养皿中，随后离心培养基，用锥虫蓝(n=3)在Neubauer中计数细胞。
PLGA-ASCs支架的初始细胞数与细胞增殖：将
PLGA-ASCs在37 ℃体积分数5%CO2培养箱内培养4 h，之后切割为1.0-2.0 cm的PLGA-ASCs支架碎片并放置在24孔板中，用0.25 mg/L MTT溶液在37 ℃孵育2 h，后除去MTT溶液，将形成的晶体溶解在400 μL二甲基亚砜中，在560 nm处读取吸光度。采用MTT比色法和已知浓度ASCs的标准MTT吸光度曲线获得支架结构中的整合细胞数量。
利用PLGA-ASCs支架中的初始活细胞密度(通过MTT实验估计)、生物电喷雾过程中细胞悬浮液减少的体积和产生的PLGA-ASCs支架体积(约270 mm3)计算细胞与PLGA支架的整合效率。整合效率=PLGA-ASCs支架初始细胞数/细胞悬浮液中细胞总含量×100%。对PLGA-ASCs支架的细胞代谢/增殖进行15 d的评估，在第1，7，15天取PLGA-ASCs支架切片(1.0-2.0 cm)，进行MTT实验(n=3)。
PLGA-ASCs支架细胞的分布与形态：培养1，7，15 d后，采用扫描电镜观察PLGA-ASCs支架中细胞的整合和分布。PBS清洗样品，40 g/L多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100渗透，50 mg/L罗丹明-Phulloidin染色40 min，0.5 mg/L 4，6-二氨基-2-苯基吲哚染色1 min。
1.5 主要观察指标 PLGA-ASCs支架的机械性能、细胞分布和数量。
1.6 统计学分析实验数据均以x±s表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，使用Shapiro-Wilk检验对分布进行对称性研究。两组比较采用单因素方差分析，进行Tukey检验。采用Mann-Whitney test比较纤维直径、支架厚度、PLGA-ASCS和PLGA支架的降解情况。用t检验比较各组的力学性能。P < 0.05时差异有显著性意义。

讨论

多种自体移植组织被用于尿道重建，包括游离皮肤移植、膀胱黏膜、结肠黏膜、颊黏膜和舌黏膜，然而上述组织重建效果不佳，常伴有并发症，如吻合口狭窄和瘘管等[13-15]。组织工程技术为需尿道重建的患者提供了一种建立功能性尿道的替代方法。静电纺丝是制备组织工程支架最常用的方法之一，电纺纤维能模拟天然细胞外基质中胶原纤维的结构和尺寸。生物电喷雾是一种将细胞悬浮液置于电场中，通过针头喷雾产生含有细胞液滴的技术[16]。静电纺丝和生物电喷雾技术的结合使均匀分布细胞的支架构建成为可能。
当尿道壁有健康且血管化良好的部分存在时，脱细胞基质适用于短狭窄缺损的修复，组织再生的限度小于1.0 cm[17]。此前研究表明，使用基质进行尿道重建时细胞接种是减少并发症的必要条件[18-19]。成人细胞和干细胞被用于尿道重建，而成人细胞的培养成功率很低且扩增能力有限；干细胞包括间充质干细胞和脂肪干细胞[20-21]，已被用于组织工程尿道重建，其中脂肪干细胞除可转化为肌源性细胞、成骨细胞、成软骨细胞外，还可分化为上皮细胞。此外，ASCs的获得对供区损伤较自体上皮小，是尿道重建种子细胞的重要来源。
PLGA-ASCs支架较PLGA支架具有更大的厚度和直径，这可能是由于纤维与细胞悬浮液的持续接触导致纤维膨胀。研究表明，超细纤维支架作为细胞生长的良好基质有利于细胞的黏附和扩散[22-24]。PLGA-ASCs支架的三维结构为细胞生长提供空间，促进营养运输和物质代谢交换，MTT检测结果证实了这一点。PLGA-ASCs支架培养第1周时细胞数量翻倍，第7-15天存活细胞量保持不变，这种情况可归因于细胞的高度融合，也可归因于在支架结构中ASCs的大量增殖，导致接触抑制；扫描电镜、共焦显微镜图像也显示培养期间细胞数量的增加。通过扫描电镜图像可以观察到，细胞存在于纤维网络的表面和内部。PLGA-ASCs支架的物理结构为嵌入式ASCs的制备提供了合适平台。培养15 d后的扫描电镜图像显示，ASCs能够向上迁移并覆盖支架表面，证实ASCs与纤维之间的高度整合。PLGA-ASCs支架制备完成后即评估细胞活性，观察到细胞活性的降低，然而整合在纤维中细胞的存活率较仅接受电喷雾细胞的存活率低4%，因此电喷雾过程对细胞活力的降低过程中起主要作用。尽管如此，整合到支架中的细胞仍然保持较高的活性。
PLGA-ASCs支架的杨氏模量、最大载荷和最大延伸率均低于PLGA支架，这是由于细胞中断了纤维网络的完整性，导致PLGA-ASCs机械强度降低，和STANKUS等[25]的研究结果相符。力学性能变化还可能与从DMA分析中切取PLGA-ASCs样品的区域有关。PLGA-ASCs支架的中心区具有较高的细胞整合，使其结构更为复杂，力学参数降低；然而PLGA-ASCs支架的机械强度仍大于50 MPa，足以支持干细胞生长[26-27]。
支架的降解性能与支架在体内的稳定性关系密切。支架应为细胞发育提供空间，直至组织完全再生[28]，因此若支架表现出高溶解性和降解性，易被体液溶解，支架作用有限；相反，若支架降解速率低，在体内滞留时间过长，则会阻止组织重塑。纤维在支架中的降解为细胞增殖和深入其结构提供空间，同时细胞产生的细胞外基质将占据支架的剩余空间，因此支架降解的速率应与细胞增殖的速率相匹配。降解性实验表明，PLGA-ASCs和PLGA支架具有不同的降解动力学，这种差异可能是由于支架组的厚度不同，也可能是由于PLGA水解产生的酸性产物引起的自催化作用[29]。在较薄的支架中降解在结构中均匀发生，导致水溶性低聚物沿整个长度分布；位于支架中心的水解产物很容易扩散到表面，然后通过缓冲液交换去除。PLGA-ASCs支架的厚度较大，阻碍了PLGA水解产物从支架内部扩散，这些酸性产物积聚在PLGA支架内加剧降解。因此，在最初的15 d内，PLGA-ASCs支架Mw的降低可能意味着其表面的降解，同时在15-45 d间Mw的减少可能代表支架内部降解，PLGA水解产生的酸性产物引起自催化反应，导致Mw的更快降低[27，30]。尽管降解动力学不同，但PLGA-ASCs和PLGA支架最终Mw中无显著差异，因此生物电喷雾与静电纺丝的结合未引起纤维降解速率的显著差异。
生物电喷雾和静电纺丝的结合可制备出分布均匀的细胞支架，尽管细胞整合后改变了支架的一些理化性质，但仍可满足干细胞的生长融合。为进一步改善细胞在支架不同区域的均匀分布，需要设计更加精确生物电喷雾/静电纺丝系统。
实验结合生物电喷雾和静电纺丝技术将生长期细胞整合到纤维中，制备的细胞支架具有良好的力学性能和稳定性，有益于ASCs黏附和扩散，在尿道重建中具有良好的应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚丙交酯-乙交酯支架结合脂肪源性干细胞构建组织工程尿道

Poly(lactide-co-glycolide) scaffold combined with adipose derived stem cells in tissue-engineered urethral reconstruction

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