骨碎补总黄酮干预Notch信号通路影响骨重建过程中成血管-成骨耦联

doi:10.12307/2021.213

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (32): 5116-5122.doi: 10.12307/2021.213

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骨碎补总黄酮干预Notch信号通路影响骨重建过程中成血管-成骨耦联

黄敏玲1，卢赵琦2，申震3，林海雄1，冯骏杰1，黄枫4，姜自伟4，蔡群斌4

1广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第四临床医学院，广东省广州市 510405；3昆明市中医院，云南省昆明市 650000；4广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2020-08-25 修回日期:2020-08-28 接受日期:2020-10-24 出版日期:2021-11-18 发布日期:2021-07-26
通讯作者: 蔡群斌，硕士，主治医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:黄敏玲，女，1994年生，广东省云浮市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗骨与关节损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81974575)，项目负责人：姜自伟；广州中医药大学第一附属医院创新强院青年科研基金项目(2019QN27)，项目负责人：蔡群斌

Effects of total flavone of Rhizoma Drynariae on the coupling of angiogenesis and osteogenesis in bone remodeling through notch signaling pathway

Huang Minling1, Lu Zhaoqi2, Shen Zhen3, Lin Haixiong1, Feng Junjie1, Huang Feng4, Jiang Ziwei4, Cai Qunbin4

1First Clinical School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Fourth Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Kunming Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650000, Yunnan Province, China; 4The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2020-08-25 Revised:2020-08-28 Accepted:2020-10-24 Online:2021-11-18 Published:2021-07-26
Contact: Cai Qunbin, Master, Attending physician, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Huang Minling, Master candidate, First Clinical School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81974575 (to JZW); The Youth Scientific Research Fund of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. 2019QN27 (to CQB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨缺损：是指骨质缺损到达一定程度使其不能在自然状态下达到骨愈合。由于创伤、骨肿瘤、肢体畸形及骨感染等导致的大段骨缺损不仅会造成严重的社会、经济负担，也是骨科临床面临的重大挑战，成为近年来骨科领域的研究热点。
Notch信号通路：Notch信号通路由受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和配体(GLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)、细胞内效应分子(Hes1、Hes5)以及相关的酶组成。在新生血管形成过程中，Notch信号通路是目前已知的最重要信号通路之一。

背景：骨缺损是骨科临床的难题，骨碎补总黄酮对骨缺损治疗有确切疗效，但是其具体机制尚不明确。
目的：基于Notch信号通路探讨骨碎补总黄酮在骨重建过程中对血管生成和骨形成的影响。
方法：48只SD大鼠随机分为模型组、中药组、中药+DAPT组、DAPT组，每组12只。构建大鼠股骨缺损模型，分别给予中药骨碎补总黄酮和Notch通路阻滞剂DAPT干预，干预12周后通过X射线片、Micro-CT和苏木精-伊红染色观察骨缺损的成骨情况，免疫组化检测骨组织中血管内皮生长因子、CD31、Hes1、骨形态发生蛋白2、Notch1蛋白的表达。
结果与结论：①X射线片、Micro-CT和苏木精-伊红染色显示中药组的成骨效果明显优于其他3组；②免疫组化检测显示中药组骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子、CD31、Hes1、Notch1平均吸光度值较模型组明显增多(P < 0.05)；中药+DAPT组血管内皮生长因子、Hes1、骨形态发生蛋白2的平均吸光度值大于DAPT组(P < 0.05)，但CD31和Notch1表达组间差异无显著性意义；③结果表明，骨碎补总黄酮通过激活Notch通路促进骨重建过程中成血管-成骨耦联，从而促进骨修复。

https://orcid.org/0000-0003-2885-6196 (黄敏玲)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨缺损, 骨碎补总黄酮, 血管生成, 成骨效能, Notch, 信号通路, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Bone defect is a clinical difficulty in orthopedics. Total flavone Rhizoma Drynariae has a definite therapeutic effect on bone defects, but the specific mechanism is not clear.
OBJECTIVE: To explore the effects of the total flavone of Rhizoma Drynariae on angiogenesis and bone formation during bone remodeling.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were divided into four groups, 12 in each group, including model group, traditional Chinese medicine (TCM) group, TCM + DAPT group, and DAPT group. femoral bone defect model was established in each rat and interventions with the total flavone of Rhizoma Drynariae and the Notch signaling pathway blocker DAPT were given in corresponding groups. Osteogenesis was evaluated by X-ray, Micro-CT, and hematoxylin-eosin staining at 12 weeks of interventions. The levels of vascular endothelial growth factor, CD31, Hes1, bone morphogenetic protein 2, and Notch1 in bone tissue were detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray, Micro-CT and hematoxylin-eosin staining showed that TCM group showed significantly better osteogenesis than the other three groups. Immunohistochemistry detection indicated that compared with the model group, the average absorbance values of vascular endothelial growth factor, CD31, Hes1, bone morphogenetic protein 2, and Notch1 were significantly higher in the TCM group (P < 0.05). Compared with the DAPT group, the average absorbance values of vascular endothelial growth factor, Hes1, and bone morphogenetic protein 2 were significantly increased in the TCM+DAPT group, while there was no significant difference in the expression of CD31 and Notch1 between the two groups. These findings indicate that the total flavone of Rhizoma Drynariae can promote the coupling of angiogenesis-osteogenesis in bone remodeling by activating the Notch pathway, thereby promoting bone repair.

Key words: bone defect, total flavone of Rhizoma Drynariae, angiogenesis, osteogenesis, Notch, signaling pathway, rat

中图分类号:

黄敏玲, 卢赵琦, 申震, 林海雄, 冯骏杰, 黄枫, 姜自伟, 蔡群斌. 骨碎补总黄酮干预Notch信号通路影响骨重建过程中成血管-成骨耦联[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5116-5122.

Huang Minling, Lu Zhaoqi, Shen Zhen, Lin Haixiong, Feng Junjie, Huang Feng, Jiang Ziwei, Cai Qunbin. Effects of total flavone of Rhizoma Drynariae on the coupling of angiogenesis and osteogenesis in bone remodeling through notch signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(32): 5116-5122.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析共48只SD大鼠进行实验，其中DAPT组有1只大鼠取材时发现内固定钢板松动，模型组有1只大鼠出现患肢骨缺损区有脓性包块形成，余无特殊，针对这2只大鼠已进行后续实验补充。
2.2 X射线片观察结果见图2，术后第12周X射线片显示中药组有大量的骨痂形成，骨折线模糊或消失，骨形成占缺损75%以上，骨髓腔形成，部分皮质骨形成，但是骨痂密度较低；模型组骨痂形成较中药组少，骨折线模糊，部分骨髓腔形成；中药+DAPT组仅有少量骨痂生成，且连续性较差；DAPT组骨折线清晰可见，缺损区无骨痂生成。按照Lane-Sandhu X射线评分标准，中药组分值最高，差异有显著性意义(P < 0.05)。如表1所示，对比其他3组，DAPT组分值最低，成骨情况最差，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 大体形态观察结果由图3可见，中药组骨缺损区有大量新骨形成，截骨端骨连接比较完全。对比发现，模型组也生成大量骨痂，但是骨缺损区仍有少量缺损可见，骨性连接并不完全。与中药组及模型组相比，DAPT组可见明显的骨缺损，骨痂生成不明显，缺损区周围大部分被结缔组织包裹，形成假性关节，断端可活动；中药+DAPT组可见少量骨痂形成，缺损较DAPT组少，但存在结缔组织填充缺损区域。

2.4 Micro-CT检测结果通过Micro-CT进行三维立体扫描，重建各组大鼠缺损区域，见图4，发现各组之间的骨性微结构存在一定程度的差异，见图5。通过检测股骨缺损区微结构发现，与模型组相比，中药组骨样本的相对骨体积、骨小梁数量均显著增高(P < 0.05)，可见骨碎补能明显改善股骨微结构，差异有显著性意义。同样，DAPT组相对骨体积、骨小梁数量对比模型组、中药组及中药+DAPT组均明显降低，骨小梁分离度明显升高，差异有显著性意义。另外还观察到中药+DAPT组能逆转阻滞剂对Notch通路的影响，对比DAPT组，骨缺损区相对骨体积、骨小梁数量增加(P < 0.05)，骨小梁分离度降低(P < 0.05)。

2.5 骨形态学观察结果如图6所示，中药组新生骨组织填满了整个骨缺损区，可见少量散在的软骨细胞，成骨质量效能最佳，骨连接最好；模型组镜下也可见大量新生骨，但是成骨不均匀，排列较为紊乱，仍可见部分成熟的软骨细胞，未完全进入软骨内化骨；中药+DAPT组仅可见少量的新生骨组织，主要以大量的软骨细胞为主，并伴有矿化的纤维样组织填充，成骨质量较差；DAPT组缺损区主要是矿化的纤维样组织长入，有少量的软骨细胞，成骨质量差。

2.6 免疫组织化学染色结果由图7可见，各组大鼠骨组织中血管内皮生长因子、CD31、Hes1、骨形态发生蛋白2、Notch1蛋白染色均匀，细胞核明显。中药组染色区域大且染色程度深，阳性和阴性染色区域区分明显，骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子、CD31、Hes1、Notch1平均吸光度值较模型组明显增多，见表2，3。中药+DAPT组的血管内皮生长因子、Hes1、骨形态发生蛋白2的平均吸光度值大于DAPT组(P < 0.05)，但CD31和Notch1表达组间差异无显著性意义，见表3。

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引言

由于创伤、骨肿瘤、肢体畸形及骨感染等导致的大段骨缺损是骨科临床面临的重大挑战，也是近年来骨科领域的研究热点。临床上治疗大段骨缺损的植骨术、骨搬运技术及诱导膜技术具有骨吸收缺陷[1]，或治疗周期长、需多次手术等缺点[2]。中医学是一个伟大的宝库，随着传统中医学的现代化，通过与现代医学理论方法相结合，一方面可以为临床上难以解决的难题提供新思路和方法，另一方面可以明确中药发挥疗效的机制，为临床运用提供科学的依据。
骨碎补是中医骨科的常用药，骨碎补总黄酮是干燥根茎中提取的有效成分，课题组前期研究表明骨碎补总黄酮具有促进骨缺损动物模型骨痂形成的作用[3-4]，同时可提升大鼠牵张成骨过程中骨痂的骨密度和骨矿含量，进而改善成骨质量。因此骨碎补总黄酮能有效促进成骨，但其具体作用机制仍未被完全阐明。
近些年研究证实，血管生成与骨生成在空间和时间上存在密切的关系[5-6]，其中H型血管在骨再生过程中发挥重要作用，它能调节成骨细胞的功能，是骨再生的重要调控因素，这种成骨与血管新生之间的相互联系被称为“成血管-成骨耦联”作用。在骨生成与修复过程中成血管与成骨因子之间的耦联作用扮演着重要角色。近期的研究表明，Notch信号通路不仅可以调控微血管化过程，还可调控骨祖细胞及间充质干细胞，是骨再生和修复的重要调控通路[7]。因此，该研究旨在观察骨碎补总黄酮对骨缺损区域血管新生因子及成骨相关因子表达的影响，探讨骨碎补总黄酮是否通过Notch信号通路促进“成血管-成骨耦联”，从而深入探讨骨碎补总黄酮在成血管-成骨耦联中的作用机制，为实际临床应用提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3至7月在广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级成年雄性SD大鼠48只，8-10周龄，体质量260-280 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(粤) 2018-0034。实验室温度22-24 ℃，相对湿度60%-70%。大鼠分笼饲养，6只/笼，喂饲常规饲料，自由饮水。饲养及实验操作在广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物室中进行[SYXK(粤) 2018-0092]。
1.3.2 器材与试剂自制不锈钢大鼠股骨6孔钢板、1.5 mm皮质骨自攻螺钉(江苏苏州悦来医疗器械有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；乙二胺四乙酸脱钙液、40 g/L多聚甲醛、二甲基亚砜、血管内皮生长因子、CD31、Hes1、骨形态发生蛋白2、Notch1抗体(美国Abcam公司)等。
1.3.3 药物强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司生产，国药准字Z20030007，生产批号：180304)，有效成分为骨碎补总黄酮，规格：每粒装0.25 g，有效成分180 mg。Notch通路阻滞剂为γ-分泌酶抑制剂3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯(N-[N-(3,5-diflurophenylacetate)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-butylester，DAPT)，购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)；青霉素(华北制药股份有限公司，160万U/瓶，国药准字H13020655)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组与给药按照随机数字表法，SD大鼠分为4组，每组12只，分别为模型组、中药组、中药+DAPT组、DAPT组。动物等效服药量按体表面积计算得骨碎补总黄酮
78.75 mg/(kg·d)，DAPT 50 mg/kg[8](皮下注射，溶于含1%二甲基亚砜的PBS中)。中药组给予1%二甲基亚砜皮下注射以及强骨胶囊(骨碎补总黄酮)灌胃；DAPT组给予皮下注射DAPT及等量生理盐水灌胃；中药+DAPT组给予皮下注射DAPT后，再给予强骨胶囊灌胃；模型组给予等量的生理盐水灌胃及等量的1%二甲基亚砜皮下注射。造模后第1天开始灌胃，直至取材当天，1次/d，共计12周；造模后第1天开始皮下注射，连续使用5 d。
1.4.2 模型制备术前禁食24 h，不禁水，5%水合氯醛行腹腔注射麻醉(8 mL/kg)。麻醉满意后，左下肢备皮，大鼠取左侧卧位，使用体积分数为75%乙醇消毒术区后，沿股骨外侧纵轴切开皮肤及筋膜，钝性分离股外侧肌及股二头肌。自股骨大转子至股骨髁显露股骨外侧面，于股骨前外侧放置6孔不锈钢钢板，调整好位置，使其位于股骨外侧面中心，远近端各拧入2枚1.5 mm螺钉固定钢板，见图1A，在股骨干及钢板中心用截骨导板及线锯进行股骨截骨，截骨长度为
4 mm，见图1B。术毕使用生理盐水冲洗伤口后，缝合肌膜和皮肤[9-10]。
术后连续5 d每日给予青霉素8万U肌肉注射以预防感染。术后常规饲料喂养，不禁水，完全负重活动，单笼饲养至皮肤切口基本愈合后合笼。

1.4.3 DR拍片术后12周麻醉大鼠后，行X射线检查观察成骨情况，并采用Lane-Sandhu X射线评分法从骨形成、骨连接、骨塑形3个方面评估骨重建情况[11]。
1.4.4 大体形态观察解剖、游离股骨标本，观察标本大体形态结构和缺损修复后骨的连续性。
1.4.5 标本采集与处理术后12周麻醉大鼠后取股骨，清理去除软组织，放入体积分数10%甲醛溶液中固定24 h。
1.4.6 Micro-CT 从大鼠股骨远端顶端开始进行CT 螺旋扫描，每18 µm作为一个断层，从生长板底端开始向上分析100张，将重建好的图片用软件CTAn进行数据分析，计算机测定新生骨区域骨矿物质含量(bone mineral density，BMD)、骨小梁数量(trabecula number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecula separation，Tb.sp)、相对骨体积(bone volume，BV/TV)，最后采用软件CT Vol输出骨缺损区域的三维图片。
1.4.7 骨组织形态学分析标本用甲醛固定后，使用乙二胺四乙酸脱钙4周，能容易地插入5号注射器针头，视为脱钙完成，石蜡包埋进行切片，经苏木精-伊红染色后，显微镜下观察骨组织形态学改变，从纤维组织、软骨组织、新生骨组织等方面评估骨重建水平。
1.4.8 大鼠骨缺损区新生骨组织中血管内皮生长因子、CD31、Hes1、骨形态发生蛋白2、Notch1蛋白的表达水平采用免疫组化法进行检测，取大鼠股骨组织的石蜡切片，置于盛满乙二胺四乙酸(pH 9.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，切片放入体积分数为3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min；PBS洗涤3次，37 ℃下用羊血清封闭30 min；加入血管内皮生长因子、CD31、Hes1、骨形态发生蛋白2、Notch1抗体(稀释度均为1∶
1 000)，平放于湿盒内4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，加入二抗(稀释度为1∶3 000)，室温孵育50 min；加入DAB显色剂反应5 min，水洗涤，苏木精复染细胞核、脱水、透明、封固，在显微镜下观察阳性染色情况，阴性对照以TBS代替一抗，光镜下常规观察免疫组化染色切片相关蛋白部位、着色的深浅程度。选取各组染色均匀、质量较好的切片每组各3张，采用计算机真彩色图像分析仪，经显微镜放大200倍，随机摄入4个视野，用倒置显微镜观察并拍照。运用Image-Pro Plus对图片进行分析，计算平均吸光度值[10]，数据进行统计学处理。
1.5 主要观察指标各组缺损区成骨情况及通路相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间两两比较采用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

大段骨缺损的修复是骨科医生临床工作中的难题，也是未来骨科研究的热点方向。临床上大段骨缺损的治疗可以采用自体骨或异体骨移植、骨搬运技术、诱导膜技术及组织工程技术等，然而，由于骨缺损区域局部情况较为复杂，存在断端骨髓损失严重、局部血运破坏、血运差、以及免疫排斥严重等情况，导致依然没有彻底进行骨缺损修复的办法[12]。既往认为，骨组织的再生是成骨系统与破骨系统耦联的结果，然而KUSUMBE等[6]报道了一种特殊的毛细血管亚型CD31hiEmcnhi，这是大鼠骨骼系统中的一种血管亚型，具有高水平的血小板和内皮细胞黏附分子1
(PECAM-1/CD31)和核内黏附蛋白(Emcn)[13]。WANG等[14]研究发现，H型血管高度分布于干骺端和骨内膜附近的骨小梁表面，而且在受伤初期，H型血管广泛分布于伤区，因此有理由认为血管生成与骨形成具有耦合作用。
Notch信号通路是一个在进化上高度保守的系统，Notch信号通路由受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和配体(GLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)、细胞内效应分子(Hes1、Hes5)以及相关的酶组成[15]。Notch信号是由2个邻近细胞的Notch受体和配体相互作用而激活。通过γ-分泌酶的作用，使NICD进入核膜，启动下游基因的转录，Notch信号通路得以发挥其功能。GALE等[16]研究发现，Notch通路中的配体DLL4与血管内皮生长因子一样，都能促进血管的发育，因此Notch信号通路与血管内皮生长因子信号通路一样，能在血管发育和稳态中发挥着重要的作用。DONG等[17]通过对基因敲除小鼠的间充质干细胞进行体外实验，发现Notch1和Notch2的失活将会对成骨细胞产生抑制作用。CUI等[18]研究发现，Notch通路在协调骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化中发挥重要作用。体内外实验均表明，对Notch通路的抑制，可有效抑制成骨分化及骨形成。
Notch信号通路在成骨或成血管方面的作用有较多报道，但是基于Notch通路在成血管-成骨耦联关系中的研究较少，对此该实验尝试研究在骨缺损区域骨再生过程中成血管-成骨耦联是否与Notch通路相关。通过使用DAPT抑制剂，抑制γ-分泌酶的活性，导致无法激活CSL转录因子，从而无法启动下游基因的转录，达到对Notch通路的阻滞作用。由于下游基因的转录无法启动，作为下游最常见基因Hes1以及作为γ-分泌酶作用底物Notch1的表达均明显降低。免疫组化结果显示，DAPT组骨组织中Notch1、Hes1水平较模型组明显降低，表明通路阻滞成功。根据股骨大体形态观察、X射线、Micro-CT与苏木精-伊红染色结果，DAPT组骨缺损区以纤维增生为主，成骨质量较差，且未见新生骨组织生成。同时，促血管生成因子血管内皮生长因子、血管生成指标CD31及成骨相关因子骨形态发生蛋白2水平均低于模型组。研究表明，血管内皮生长因子在骨组织中通过促进血管内皮细胞的增殖、迁移和趋化作用，能促进新生血管的生成[19-22]。该研究中X射线片、Micro-CT及免疫组化结果均一致性证实了Notch通路受到抑制，下调Notch1、Hes1的表达后，成骨和成血管也受到了一定程度的抑制。
此实验还进一步研究了中药骨碎补总黄酮能否激活Notch信号通路，上调Notch1、Hes1的表达，进而促进血管和新骨形成。在实验分组中，增设了中药+DAPT组及单纯中药组，使用的中药是骨碎补总黄酮。骨碎补是中医骨伤科中治疗跌扑损伤、筋断骨折的要药，中医认为具有活血疗伤、补肾强骨的作用[23]。既往研究发现骨碎补可以通过调节骨质疏松大鼠的血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2信号通路，促进血管生成[24]。课题组前期的实验研究也表明，骨碎补的有效成分骨碎补总黄酮对新骨形成及修复具有显著促进作用[25]，但是对于骨碎补总黄酮在成血管-成骨耦联中的具体作用机制和信号通路研究较少。该研究发现，骨碎补总黄酮能激活Notch通路，上调Notch1、Hes1的表达，同时血管内皮生长因子、CD31及骨形态发生蛋白2水平在4组中最高，且影像学评分及染色结果均提示成骨质量最佳，中药+DAPT组Notch通路受抑制的情况得到改善，Hes1、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2的表达较单纯DAPT组有所升高，但仍然劣于模型组。除此之外，影像学表现及苏木精-伊红染色结果也提示有新骨形成，较DAPT组佳。实验还发现中药+DAPT组Notch1的表达对比DAPT组无显著差异，Hes1的表达有差异，作者考虑骨碎补总黄酮可能对Notch通路下游的影响作用更为明显。总体来说，骨碎补总黄酮能通过Notch信号通路促进成骨-成血管耦联，而且骨碎补总黄酮对这种阻滞具有一定的逆转效应。
综上所述，骨缺损修复中成血管-成骨耦联与Notch通路相关，通过激活Notch通路上调Notch1、Hes1的表达，进而促进血管内皮生长因子、CD31、骨形态发生蛋白2的表达，促进成血管-成骨耦联，这为骨碎补总黄酮治疗骨缺损提供一定的基础理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨碎补总黄酮干预Notch信号通路影响骨重建过程中成血管-成骨耦联

Effects of total flavone of Rhizoma Drynariae on the coupling of angiogenesis and osteogenesis in bone remodeling through notch signaling pathway

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