高强度跳跃肌腱损伤即刻冷水浸没干预模型兔髌腱组织内的炎症反应和胶原重塑

doi:10.12307/2021.159

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (29): 4619-4625.doi: 10.12307/2021.159

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

高强度跳跃肌腱损伤即刻冷水浸没干预模型兔髌腱组织内的炎症反应和胶原重塑

王博1，白胜超2，李文博3，王琳4

1北京体育大学，北京市 100084；2南京理工大学体育部，江苏省南京市 210014；3河北北方学院，河北省张家口市 075000；4北京体育大学运动医学教研室，北京市 100084

收稿日期:2020-05-23 修回日期:2020-05-27 接受日期:2020-09-11 出版日期:2021-10-18 发布日期:2021-06-01
通讯作者: 王琳，博士，教授，北京体育大学运动医学教研室，北京市 100084
作者简介:王博，男，1986年生，北京市人，汉族，2016年北京体育大学毕业，博士，讲师，主要从事运动损伤方面的研究
基金资助:
北京体育大学校级课题(2017QN009)，项目负责人：王博

A rabbit model of high-intensity jumping-induced tendon injury followed by post-exercise cold water immersion: inflammations and collagen remodeling in the patellar tendon

Wang Bo1, Bai Shengchao2, Li Wenbo3, Wang Lin4

1Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2Department of Sports, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China; 3Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China; 4Department of Sports Medicine, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Wang Bo, PhD, Lecturer, Beijing Sport University, Beijing 100084, China

Received:2020-05-23 Revised:2020-05-27 Accepted:2020-09-11 Online:2021-10-18 Published:2021-06-01
Contact: Wang Lin, MD, Professor, Department of Sports Medicine, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
About author:Wang Bo, PhD, Lecturer, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
the School-level Project of Beijing Sport University, No. 2017QN009 (to WB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
髌腱退行性病变：为一种常见的运动损伤，常见于田径以及篮排球运动员等，主要的损伤表现为跑步跳跃疼痛、膝关节水肿等症状，其中炎症反应以及组织修复是导致损伤的主要原因。
冷水浸没：是常用的运动后疲劳放松方法，通过对局部或者全身进行冷水浸没达到缓解运动疲劳、消除炎症反应的目的。

背景：髌腱退行性病变是常见的运动损伤，长期跑步和跳跃运动是导致损伤的重要因素。冷水浸没是一种常见的处理运动后炎症反应的方法，可以减慢局部血流速度，减慢局部代谢反应，从而减轻炎症反应。
目的：观察冷水浸没干预对大强度跳跃运动后髌腱中炎症和重塑修复的影响。
方法：选择30只雌性成年兔，体质量3.0 kg，其中安静对照组6只；其余24只兔右腿定为运动组，左腿定为运动+冷水浸没组，并在冷水浸没后0，6，24，48 h每个时间点挑出6只兔进行实验。兔需要一次性完成150次跳跃，每次80-120 N，跳跃10次间隔2 min，跳跃50次间隔10 min，随后立即在4 ℃冷水中进行15 min的冷水浸没干预，并按照分组在冷水浸没后0，6，24，48 h对肌腱和股直肌进行取材。采用相对定量PCR测定白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、基质金属蛋白酶1 mRNA在肌腱组织中的表达，以免疫组化染色测定肌腱中Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子β蛋白的表达水平，采用苏木精-伊红染色观察肌腱中胶原纤维的变化。
结果与结论：①白细胞介素1β的mRNA表达水平在0-24 h出现显著升高，运动+冷水浸没和运动组之间没有区别；②肿瘤坏死因子α mRNA表达水平显著升高，0 h运动组的mRNA表达水平高于运动+冷水浸没组(P < 0.05)；③环氧化酶2 mRNA表达水平在0-24 h显著升高，运动组在0-6 h的表达水平高于运动+冷水浸没组(P < 0.05)；④基质金属蛋白酶1 mRNA表达水平显著升高，0 h运动组的mRNA表达水平高于运动+冷水浸没组(P < 0.05)；⑤ Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子β在6-24 h表达显著升高，运动组与运动+冷水浸没组之间差异无显著性意义；⑥苏木精-伊红染色结果显示，运动后0-24 h肌腱胶原纤维排列出现紊乱，胶原纤维排列在运动后48 h基本恢复到运动前状态；运动组和运动+冷水浸没组在组织形态上无明显差异；⑦提示冷水浸没可以抑制运动后早期的炎症反应，并不会影响肌腱的重塑作用。

https://orcid.org/0000-0003-1299-0382 (王博)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 大负荷跳跃, 肌腱, 炎症因子, 冷水浸没, 实验动物

Abstract: BACKGROUND: Patella tendon degenerative disease is a common sport injury, which mainly results from long-term jumping and running exercises. Cold water immersion is a common method to deal with post-exercise inflammation, which can slow down the local blood flow and reduce the local metabolic reaction, thereby reducing the inflammation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of cold water immersion on inflammation and remodeling of the patellar tendon after one-off high-intensity jumping.
METHODS: Thirty adult female rabbits, weighing 3.0 kg, were randomly assigned into a quiet control group (n=6) and an exercise group (n=24). In the exercise group, 24 left legs were considered as the exercise and cold water immersion (PE+CWI) group, and 24 right legs were considered as the exercise (PE) group. Six rabbits from the experimental group were selected at each observation times, including 0, 6, 24, and 48 hours after cold water immersion. All rabbits were subjected to one-off 150 times jumping: 80-120 N per jumping, with an interval of 2 minutes after 10 times jumping, and with an interval of 10 minutes after 50 times jumping. Immediately after jumping, the legs were immersed in the cold water (4 oC) for 15 minutes. Tendons and rectus femoris were taken at 0, 6, 24, and 48 hours after cold water immersion. Relative quantitative PCR was used to determine the mRNA expression of interleukin 1β, tumor necrosis factor α, cyclooxygenase 2, and matrix metalloproteinase 1 in tendon tissue. Immunohistochemical staining was used to determine the type I/III collagen and transforming growth factor β proteins in the tendon. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the changes of collagen fibers in the tendon.
RESULTS AND CONCLUSION: The mRNA level of interleukin 1β significantly increased at 0-24 hours, but there was no difference between the PE+CWI and PE groups. The mRNA level of tumor necrosis factor-α showed a significant increase, and was significantly higher in the PE group than the PE+CWI group at 0 hour (P < 0.05). The mRNA level of cyclooxygenase 2 showed a significant increase at 0-24 hours, and was significantly higher in the PE group than the PE+CWI group at 0-6 hours (P < 0.05). The mRNA level of matrix metalloproteinase 1 showed a significant increase, and was significantly higher in the PE group than the PE+CWI group at 0 hour (P < 0.05). The expressions of type I/III collagen and transforming growth factor β were significantly increased at 6-24 hours, and there was no significant difference between the PE group and PE+CWI group. Results from hematoxylin-eosin staining revealed the arrangement of collagen fibers in the tendon disordered at 0-24 hours after exercises, and basically returned to the pre-exercise state at 48 hours after exercises. There was no significant difference in tissue morphology between PE group and PE+CWI group. To conclude, cold water immersion can inhibit early inflammation after exercise, but cannot impact the remodeling of the tendon.

Key words: high-intensity jumping, tendon, inflammatory factor, cold water immersion, experimental animal

中图分类号:

王博, 白胜超, 李文博, 王琳. 高强度跳跃肌腱损伤即刻冷水浸没干预模型兔髌腱组织内的炎症反应和胶原重塑[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4619-4625.

Wang Bo, Bai Shengchao, Li Wenbo, Wang Lin. A rabbit model of high-intensity jumping-induced tendon injury followed by post-exercise cold water immersion: inflammations and collagen remodeling in the patellar tendon[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(29): 4619-4625.

图/表（结果） 7

参考文献

[1] LANGBERG H, ROSENDAL L, KJAER M. Training-induced changes in peritendinous type I collagen turnover determined by microdialysis in humans. J Physiol. 2001;534(Pt 1):297-302.
[2] GUMP BS, MCMULLAN DR, CAUTHON DJ, et al. Short-term acetaminophen consumption enhances the exercise-induced increase in Achilles peritendinous IL-6 in humans. J Appl Physiol (1985). 2013;115(6):929-936.
[3] SCHULZE-TANZIL G, AL-SADI O, WIEGAND E, et al. The role of pro-inflammatory and immunoregulatory cytokines in tendon healing and rupture: new insights. Scand J Med Sci Sports. 2011;21(3):337-351.
[4] SHAPIRO E, GRANDE D, DRAKOS M. Biologics in Achilles tendon healing and repair: a review. Curr Rev Musculoskelet Med. 2015;8(1):9-17.
[5] ACCORNERO F, KANISICAK O, TJONDROKOESOEMO A, et al. Myofiber-specific inhibition of TGFbeta signaling protects skeletal muscle from injury and dystrophic disease in mice. Hum Mol Genet. 2014;23(25):6903-6915.
[6] FARHAT YM, AL-MALIKI AA, CHEN T, et al. Gene expression analysis of the pleiotropic effects of TGF-beta1 in an in vitro model of flexor tendon healing. PLoS One. 2012;7(12):e51411.
[7] LING Y, PENG C, LIU C, et al. Gene polymorphism of IL-6 and MMP-3 decreases passive range of motion after rotator cuff repair. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(5):5709-5714.
[8] Nourissat G, Berenbaum F, Duprez D. Tendon injury: from biology to tendon repair. Nat Rev Rheumatol. 2015;11(4):223-233.
[9] Kjaer M, Bayer ML, Eliasson P, et al. What is the impact of inflammation on the critical interplay between mechanical signaling and biochemical changes in tendon matrix? J Appl Physiol (1985). 2013;115(6):879-883.
[10] GEARY MB, ORNER CA, BAWANY F, et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PLoS One. 2015;10(8):e0136351.
[11] GALLELLI L, GALASSO O, FALCONE D, et al. The effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on clinical outcomes, synovial fluid cytokine concentration and signal transduction pathways in knee osteoarthritis. A randomized open label trial. Osteoarthritis Cartilage. 2013;21(9):1400-1408.
[12] WILCOCK IM, CRONIN JB, HING WA. Physiological response to water immersion: a method for sport recovery? Sports Med. 2006;36(9):747-765.
[13] Versey NG, Halson SL, Dawson BT. Water immersion recovery for athletes: effect on exercise performance and practical recommendations. Sports Med. 2013;43(11):1101-1130.
[14] MANIAS P, STASINOPOULOS D. A controlled clinical pilot trial to study the effectiveness of ice as a supplement to the exercise programme for the management of lateral elbow tendinopathy. Br J Sports Med. 2006;40(1):81-85.
[15] KOYONOS L, OWSLEY K, VOLLMER E, et al. Preoperative cryotherapy use in anterior cruciate ligament reconstruction. J Knee Surg. 2014;27(6): 479-484.
[16] WHITE GE, RHIND SG, WELLS GD. The effect of various cold-water immersion protocols on exercise-induced inflammatory response and functional recovery from high-intensity sprint exercise. Eur J Appl Physiol. 2014;114(11):2353-2367.
[17] COSTELLO JT, DONNELLY AE, KARKI A, et al. Effects of whole body cryotherapy and cold water immersion on knee skin temperature. Int J Sports Med. 2014;35(1):35-40.
[18] MACHADO AF, FERREIRA PH, MICHELETTI JK, et al. Can Water Temperature and Immersion Time Influence the Effect of Cold Water Immersion on Muscle Soreness? A Systematic Review and Meta-Analysis. Sports Med. 2016;46(4):503-514.
[19] 江大雷. 髌骨髌腱结合部跳跃损伤动物模型建立及运动后冷疗对损伤的影响[D].北京:北京体育大学,2015.
[20] VROMANS BA, THORPE RT, VIROUX PJ, et al. Cold water immersion settings for reducing muscle tissue temperature: a linear dose-response relationship. J Sports Med Phys Fitness. 2019;59(11):1861-1869.
[21] MEDEIROS R, FIGUEIREDO CP, PANDOLFO P, et al. The role of TNF-alpha signaling pathway on COX-2 upregulation and cognitive decline induced by beta-amyloid peptide. Behav Brain Res. 2010;209(1):165-173.
[22] TSUZAKI M, GUYTON G, GARRETT W, et al. IL-1 beta induces COX2, MMP-1, -3 and -13, ADAMTS-4, IL-1 beta and IL-6 in human tendon cells. J Orthop Res. 2003;21(2):256-264.
[23] KJAER M, LANGBERG H, MILLER BF, et al. Metabolic activity and collagen turnover in human tendon in response to physical activity. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2005;5(1):41-52.
[24] THOMOPOULOS S, PARKS WC, RIFKIN DB, et al. Mechanisms of tendon injury and repair. J Orthop Res. 2015;33(6):832-839.
[25] AL-SADI O, SCHULZE-TANZIL G, KOHL B, et al. Tenocytes, pro-inflammatory cytokines and leukocytes: a relationship? Muscles Ligaments Tendons J. 2011;1(3):68-76.
[26] BURGER D AND DAYER JM. Cytokines, acute-phase proteins, and hormones: IL-1 and TNF-alpha production in contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Ann N Y Acad Sci. 2002;966:464-473.
[27] TOWNSEND JR, HOFFMAN JR, FRAGALA MS, et al. TNF-alpha and TNFR1 responses to recovery therapies following acute resistance exercise. Front Physiol. 2015;6:48.
[28] COCKERILL M, RIGOZZI MK, TERENTJEV EM. Mechanosensitivity of the 2nd Kind: TGF-beta Mechanism of Cell Sensing the Substrate Stiffness. PLoS One. 2015;10(10):e0139959.
[29] MORITA W, SNELLING SJB, WHEWAY K, et al. ERK1/2 drives IL-1β-induced expression of TGF-β1 and BMP-2 in torn tendons. Sci Rep. 2019;9(1):19005

引言

肌腱退行性病变是常见的膝关节慢性损伤，目前认为跳跃等长期的高强度牵拉运动是导致肌腱退行性病变的主要原因，其早期主要表现为肌腱组织过度重塑。一次高强度运动可导致肌腱组织的重塑修复，而反复的高强度运动则会导致正常髌腱过度重塑，造成退行性病变[1]。在正常情况下胶原蛋白的合成与降解处于平衡状态，但是在病理状态下尤其是髌腱末端病后期肌腱组织中炎症因子表达很低，导致基质金属蛋白酶1合成不足，使旧有胶原组织无法降解，胶原的合成量往往高于降解量出现过度修复，最终引起肌腱的退行性病变。在过往研究中，当肌腱长时间受到高强度牵拉后，肌腱组织中炎症因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平会显著升高。这些炎症因子可以激活前列腺素E2重要的限速酶——环氧化酶2的表达[2]，从而与前体物合成前列腺素E2产生炎症反应。除了炎症反应外，炎症因子对于肌腱重塑有着非常重要的作用[3]。正常髌腱主要由Ⅰ型胶原蛋白组成胶原纤维，Ⅲ型胶原蛋白含量小于5%。肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β同时可以诱导基质金属蛋白酶1表达，降解原有肌腱中损伤的Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值下降。当旧的Ⅰ型胶原蛋白被降解后，新生的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白进行补充，完成修复重塑过程[4]。在这一个过程中，转化生长因子β可以促进Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的生成[4-5]。FARHAT等[6]在人体肌腱细胞中加入转化生长因子β，24 h后Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平显著升高。转化生长因子β的表达受到包括力学作用等多种因素的影响，当转化生长因子β表达不足时，则会导致胶原合成下降，出现肌腱损伤延迟修复等情况[7-9]。
综上所述，炎症因子既可引发炎症反应也可诱导组织的修复更新过程。传统上使用非类固醇抗炎药可以减轻炎症反应，但是非类固醇抗炎药同样也会抑制肌腱的修复和重塑过程[10-11]。冷水浸没是另一种常见的处理运动后炎症反应的方法，可以减慢局部血流速度及局部代谢反应，从而减轻炎症反应[12]，一般使用冷水进行局部浸没的时间为10-30 min[13]。MANIAS等[14]对网球肘患者进行局部冷疗后，患者的疼痛与关节活动度均有较大的改善。KOYONOS等[15]在对前十字韧带损伤手术患者使用冷疗后发现，患者的疼痛症状有了明显改善。但是也有研究指出，冷疗法对于炎症反应没有显著的抑制作用[16]。在之前的研究中发现，超过10 min且温度低于10 ℃的冷水浸泡虽然可能造成肌肉僵硬，但是可以降低深层组织温度，对深层肌肉和关节内部环境有更明显的影响；而超过20 min以上的冷水浸没则可能导致局部冻伤发生[17-18]。目前冷水浸没对于运动后肌腱炎症反应和修复重塑的影响还有待于进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验，重复测量方差分析。
1.2 时间及地点于2015年7月至2016年1月在北京体育大学实验中心完成。
1.3 材料 30只18周龄雌性新西兰大白兔，普通级，平均体质量(2.9±0.3) kg，购买自北京兴隆养殖场，实验动物机构许可证号：110108600078158，单独饲养，每天12 h光照，自由饮水，自由饮食，温度(20±2) ℃，相对湿度为55%-65%。其中实验组24只，左腿为运动+冷水浸没组，右腿为运动组(单纯运动组)；剩余6只作为安静对照组(不进行运动)。其中2个实验组中根据取材时间，每组分为冷水浸没后0(冷水浸没后即刻)，6，24，48 h共 4个时间点，每个时间点6只兔。此次实验已获得北京体育大学动物伦理委员会批准(批准文号：2015022)。
1.4 方法
1.4.1 高强度跳跃肌腱损伤模型制备采用文献中动物损伤模型[19]，即高强度跳跃造成肌腱损伤。将兔双侧下肢足底毛发剔除并贴上凝胶电极片，随后将其与电刺激器连接，通过电流刺激其进行跳跃。在正式实验开始首先进行预实验，让兔子熟悉跳跃训练的过程，在预实验结束后，经过3 d休息开始正式实验。在正式实验阶段，兔需要一次性完成150次跳跃，每完成10次跳跃休息2 min，每完成50次跳跃休息10 min，同时通过测力台监测兔弹跳力，弹跳力量≥80 N计算一次成功跳跃。
1.4.2 冷水浸没干预在完成150次跳跃后，对兔子的左侧下肢进行冷水浸没干预。根据之前研究结果[18，20]，将水温设为4 ℃，时间为15 min，每浸没5 min将下肢取出1 min。干预过程中，动物的双侧下肢温度差异明显，身体未进行冷水浸没部分的体温并没有明显变化。为避免因为下肢互相接触导致肢体温度变化影响实验结果，整个实验中保持双侧下肢不相接触，并在干预结束后将立即将左下肢擦干。
1.4.3 取材取材前首先将剪刀、止血钳等手术器材在高压锅内用120 ℃加压0.5 h，随后在烤箱中180 ℃加热4 h，确保彻底灭菌并除去残留的RNA酶。
干预结束后分别按照规定的时间点，在0，6，24，48 h进行取材，取材部位为双侧膝关节髌腱，在取材前保持动物在笼中饲养。整个取材过程均在超净工作台完成。将皮肤切开并暴露相关的整个股四头肌-髌骨-肌腱部分，将股四头肌末端离断，并剪断膝关节内的十字韧带，在肌腱胫骨止点将肌腱和髌骨剥离。随后将肌腱部分分为2段，一段同髌骨放入40 g/L多聚甲醛溶液进行固定，为后期进行石蜡包埋做准备；另一半由无菌锡纸包装后放入液氮中随即放入-80 ℃深低温冰箱进行保存。
1.4.4 苏木精-伊红染色使用苏木精-伊红染色观察胶原形态变化。石蜡切片首先脱蜡水化，随后置于苏木精中浸泡5 min，用蒸馏水洗2 min后使用自然水冲洗10 min，随后再用伊红染液染色7 min。经过蒸馏水洗后，进行脱水树胶封固。染色完成后使用每个样本选取3张切片，每张切片在×100视野下观察肌腱胶原纤维的变化。
1.4.5 定量PCR测定采用TRNzol总RNA提取试剂盒(TianGen，中国)进行样本RNA提取。首先将组织研磨成粉末状后，加入依次加入Trizol、氯仿，并使用12 000 r/min高速离心15 min后，加入异丙醇，再进行12 000 r/min高速离心15 min，按1 mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇。随后继续12 000 r/min高速离心5 min，弃去乙醇液体，加入无酶水溶解沉淀。采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美国)紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度。
采用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)进行cDNA反转录。取总RNA，依次加入5×g DNA Eraser Buffer、gDNA Eraser和无酶水，消除残存的cDNA。随后取混合液10并依次加入PrimeScript RT Enzyme 1、RT Primer Mix 1、5×PrimeScript Buffer和无酶水。随后在37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s，得到反转录的cDNA。DNA扩增过程采用ABI 7500型PCR仪(Thermo Fisher，美国)，采用体系为SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus) ROX plus(Takara，日本)进行扩增，并加入引物(表1)。扩增程序为：95 ℃30 s，(95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s) ×45个循环。根据原始检测结果，按照2-∆∆Ct相对定量计算公式，公式为：

以安静对照状态样本为对照样本，计算出各样品目的基因的相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，计算得到目的基因mRNA转录水平的差异。

1.4.6 免疫组化分析使用三步法免疫组织化学染色进行肌腱蛋白表达测定，首先将组织进行脱水包埋。在肌腱组织固定48 h后，依次经过体积分数70%-100%浓度梯度乙醇、正丁醇，最后进行石蜡包埋(国药集团，北京)。将包埋的石蜡块切成5 mm厚石蜡切片(RM2235，徕卡公司，德国)，石蜡切片经过脱蜡；水化后，0.1%胰酶37 ℃抗原修复处理30 min，体积分数3%的双氧水清除内源性过氧化物15 min，体积分数10%的羊血清蛋白封闭15 min。添加一抗(1∶100)4 ℃过夜；次日37 ℃复温30 min，添加生物素化二抗工作液(IgG/Bio)室温下孵育20 min，经过0.01%PBS清洗后，添加辣根酶标记链霉卵蛋白工作液(S-A/HRP，SP-0023，博奥森，北京)室温孵育20 min。0.01%PBS 3×5 min，DAB显色5 min，流水冲洗15 min，最后脱水透明树胶封固。抗体稀释比例均为1∶100，包括Ⅰ型胶原蛋白(bs-0578R，博奥森，北京)、Ⅲ型胶原蛋白(bs-0549R，博奥森，北京)、转化生长因子β1抗体(bs-4909R，博奥森，北京)。
完成染色后将每个样本选出3张切片，每张切片在肌腱区域在×400视野下选取5个视野进行吸光度(A)值分析。选取镜下阳性褐色阳性反应区域，随后用A值/密度得到组织的光密度值。
1.5 主要观察指标采用相对定量PCR测定肌腱组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、基质金属蛋白酶1 mRNA的表达，以免疫组化染色测定肌腱中Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子β蛋白的表达水平，采用苏木精-伊红染色观察肌腱中胶原纤维的变化。
1.6 统计学分析所有数据结果均以x±s表示，采用SPSS 20.0进行数据统计分析。在同一组内不同时间点之间采用重复测量方差分析；在同一时间两组之间采用独立样本t检验，差异性标准为P < 0.05。

讨论

3.1 运动后肌腱内炎症反应运动和运动+冷水浸没组中的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧化酶2的mRNA表达水平在运动后出现了显著的升高。在过往的研究中，高强度拉伸以及运动过程的缺氧均可以导致白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的大量合成，这两种炎症因子诱导的环氧化酶2作为前列腺素E2重要的限速酶，是前列腺素E2具有决定性的影响因素[21]。前列腺素E2是人体中重要的炎症物质，可以导致红肿热痛等炎症反应，因而环氧化酶2表达的升高与炎症反应出现有着直接关系。TSUZAKI等[22]在研究中指出，肌腱在高强度运动后0-48 h内环氧化酶2水平显著升高，并且会引起肌腱疼痛等症状。此次研究苏木精-伊红结果显示，运动后0-48 h出现局部细胞密度增加，这可能是由于炎症反应导致免疫细胞浸入肌腱组织所造成的。此次研究中这一变化趋势与过往的研究结果相符，结合宏观组织变化，作者认为150次高强度跳跃可引起肌腱内显著的炎症反应。
3.2 运动后肌腱组织重塑运动和运动+冷水浸没组中的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子β的蛋白表达和基质金属蛋白酶1的mRNA表达在运动后均出现了显著升高。Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白是肌腱组织的胶原纤维的主要成分，也是肌腱组织中细胞基质的主要物质，在正常状态下胶原纤维主要成分为Ⅰ型胶原蛋白，而Ⅲ型胶原蛋白表达很低。当肌腱损伤或受到强烈外力牵拉时，旧有胶原蛋白会在基质金属蛋白酶的作用下进行降解，并在转化生长因子β的作用下产生大量合成Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白新生原胶原蛋白，对组织进行修复或重塑，以适应力学环境变化[23-24]。在此次实验中Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白和转化生长因子β的表达在运动后6-24 h出现了显著升高趋势，作为诱导Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的主要生长因子，转化生长因子β与Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的升高趋势相符，同时降解原有Ⅰ型胶原蛋白的基质金属蛋白酶1 mRNA表达在运动后0-24 h段也出现了显著升高。同时苏木精-伊红染色结果显示，运动后0 h肌腱组织出现胶原纤维排列平滑、紊乱，而在运动后48 h胶原纤维形态接近运动前水平，表明肌腱组织中的组织重塑。
3.3 冷水浸没对运动后肌腱炎症因子或肌腱重塑修复的影响运动+冷水浸没组中运动后即刻肿瘤坏死因子α和环氧化酶2的mRNA表达低于运动组。造成肿瘤坏死因子α在冷水浸没后即刻出现表达低于单纯运动组的原因可能是其合成和释放过程相对于白细胞介素1β，对局部温度更加敏感[25-26]。TOWNSEND等[27]在研究中指出，温度变化可以显著影响血液中肿瘤坏死因子α的表达，局部体温降低对于肿瘤坏死因子α表达的抑制作用更加明显。冷水浸没后即刻由于局部肿瘤坏死因子α显著降低，因此作者认为冷水浸没导致的低温是肿瘤坏死因子α表达下降的主要原因。
环氧化酶2直接受到肿瘤坏死因子α的诱导而产生，此次实验中肿瘤坏死因子α在运动后即刻(0 h)的mRNA表达出现了显著降低，与环氧化酶2变化时间一致，因而作者认为肿瘤坏死因子α表达下降是造成环氧化酶2表达降低的原因。此次实验中运动+冷水浸没组的基质金属蛋白酶1在运动后即刻表达显著低于运动组。在之前的研究中，肿瘤坏死因子α可以诱导基质金属蛋白酶1的表达，从而促进肌腱修复和重塑[3]。肌腱重塑过程中基质金属蛋白酶1表达降低一般暗示着原有肌腱降解速度降低，导致肌腱内合成作用大于分解作用，容易引起过度修复。但是在此次实验中，运动+冷水浸没组中的基质金属蛋白酶1的表达虽然在运动后即刻受到抑制，然而随后快速回升并在运动后6 h达到运动组水平，表明冷水浸没干预可以在运动后即刻抑制基质金属蛋白酶1表达并可能对重塑造成短时间影响，但没有长期作用。
在冷水浸没与单纯运动组对比中，转化生长因子β、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的变化趋势差异无显著性意义，表明冷水浸没干预并没有影响到转化生长因子β的表达。转化生长因子β是促进Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白合成的重要生长因子，在正常状态下以复合体状态所存在，不具备生理功能[28]。而在受到力学作用的刺激后，复合体与细胞机制上的结合位点相结合将具有生物活性中转化生长因子β释放出来，所以转化生长因子β被认为是重要的力学传导因子 [28]。另一方面当肌腱细胞接收到白细胞介素1β炎症因子后，会激活下游的ERK1/2通路，引起转化生长因子β表达升高[29]。此次实验中运动组和运动+冷水浸没组的白细胞介素1β表达差异无显著性意义，这可能是导致两组中转化生长因子β表达并没有出现明显差异的原因。目前研究中，对于判断由于干预手段导致的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达变化是否引起过度修复，均对比对照组结果进行评定[5-6]。在此次实验中，受到转化生长因子β诱导的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达在两组之间差异无显著性意义，且都在运动后24 h降低到运动前水平，而没有发生长时间的超量增生，因此单纯运动和冷水浸没干预产生的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达变化均属于肌腱组织运动后正常修复，未产生过度修复现象。虽然运动+冷水浸没组基质金属蛋白酶1的mRNA表达在运动后即刻出现了显著抑制性，但在运动后6 h很快回升至运动组水平，相对于非类固醇抗炎药物的作用，其对肌腱原有胶原组织正常降解的影响很小，且两组Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达未能出现显著变化，表明冷水浸没并未影响Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达，因此作者认为冷水浸没干预并不会对组织的重塑构成长期影响。
结论：运动后即刻冷水浸没能够有效的抑制肌腱内的炎症反应，而不影响肌腱内胶原纤维的重塑过程。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高强度跳跃肌腱损伤即刻冷水浸没干预模型兔髌腱组织内的炎症反应和胶原重塑

A rabbit model of high-intensity jumping-induced tendon injury followed by post-exercise cold water immersion: inflammations and collagen remodeling in the patellar tendon

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[1]	仲鹤鹤, 孙鹏鹏, 桑鹏, 吴术红, 刘毅. 模拟重建膝关节后外侧复合体核心韧带后膝关节稳定性评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 821-825.
[2]	房昕, 郭金铭, 刘品端. 不同浓度富血小板血浆修复兔膝骨关节炎软骨缺损的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5588-5593.
[3]	范重山, 孙明帅, 韩文朝. 促炎因子及基质金属蛋白酶在骨关节炎发病机制及相关治疗中的地位和作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5162-5170.
[4]	周继辉, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 创伤性胸锁关节脱位多种内置物治疗优劣的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 443-448.
[5]	张衡, 张贤平, 戴厚杰, 黄昌钊, 王锐英. 天麻素干预脊髓损伤模型兔运动功能及神经生长相关蛋白43的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4626-4631.
[6]	杨琨, 费晨, 王鹏飞, 张斌飞, 杨娜, 田丁, 庄岩, 张堃. 自体或同种异体肌腱重建喙锁韧带与锁骨钩钢板治疗肩锁关节脱位效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4580-4586.
[7]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[8]	夏国明, 许强, 刘序强, 于小龙, 戴闽. 诱导多能干细胞在骨外科组织工程中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3077-3082.
[9]	何少波, 刘继超, 杨立峰, 丁永峰, 李伍建. 胫后肌腱转位治疗足下垂的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2334-2340.
[10]	于承浩, 张益, 戚超, 陈进利, 高甲科, 于腾波. 细胞因子和富血小板血浆对肌腱干细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 133-140.
[11]	李佳, 汤颖, 朱琦, 张燕萍, 周培刚, 顾永春. 根尖牙乳头干细胞治疗葡聚糖硫酸钠诱导的实验性肠炎 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1069-1075.
[12]	伍琦, 廖瑛, 孙光华, 周桂娟, 廖源, 刘静, 钟培瑞, 成果, 邓程远, 王甜甜. 依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 709-715.
[13]	邱国荣, 何本祥, 王纯. 基于科学知识图谱可视化工具分析富血小板血浆修复肌腱病的生物机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 787-795.
[14]	石伟发, 郭志民, 邓辉云, 沈燕玲, 石玲玲, 吴世龙, 黄泽滨. 腓骨长肌腱和腘绳肌腱重建前交叉韧带的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 811-820.
[15]	冯勇, 赵燕旭, 张民泽. 人羊膜、药物与生长因子预防肌腱损伤修复术后的粘连[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 625-630.