1.1 设计 对比观察动物实验,重复测量方差分析。
1.2 时间及地点 于2015年7月至2016年1月在北京体育大学实验中心完成。
1.3 材料 30只18周龄雌性新西兰大白兔,普通级,平均体质量(2.9±0.3) kg,购买自北京兴隆养殖场,实验动物机构许可证号:110108600078158,单独饲养,每天12 h光照,自由饮水,自由饮食,温度(20±2) ℃,相对湿度为55%-65%。其中实验组24只,左腿为运动+冷水浸没组,右腿为运动组(单纯运动组);剩余6只作为安静对照组(不进行运动)。其中2个实验组中根据取材时间,每组分为冷水浸没后0(冷水浸没后即刻),6,24,48 h共 4个时间点,每个时间点6只兔。此次实验已获得北京体育大学动物伦理委员会批准(批准文号:2015022)。
1.4 方法
1.4.1 高强度跳跃肌腱损伤模型制备 采用文献中动物损伤模型[19],即高强度跳跃造成肌腱损伤。将兔双侧下肢足底毛发剔除并贴上凝胶电极片,随后将其与电刺激器连接,通过电流刺激其进行跳跃。在正式实验开始首先进行预实验,让兔子熟悉跳跃训练的过程,在预实验结束后,经过3 d休息开始正式实验。在正式实验阶段,兔需要一次性完成150次跳跃,每完成10次跳跃休息2 min,每完成50次跳跃休息10 min,同时通过测力台监测兔弹跳力,弹跳力量≥80 N计算一次成功跳跃。
1.4.2 冷水浸没干预 在完成150次跳跃后,对兔子的左侧下肢进行冷水浸没干预。根据之前研究结果[18,20],将水温设为4 ℃,时间为15 min,每浸没5 min将下肢取出1 min。干预过程中,动物的双侧下肢温度差异明显,身体未进行冷水浸没部分的体温并没有明显变化。为避免因为下肢互相接触导致肢体温度变化影响实验结果,整个实验中保持双侧下肢不相接触,并在干预结束后将立即将左下肢擦干。
1.4.3 取材 取材前首先将剪刀、止血钳等手术器材在高压锅内用120 ℃加压0.5 h,随后在烤箱中180 ℃加热4 h,确保彻底灭菌并除去残留的RNA酶。
干预结束后分别按照规定的时间点,在0,6,24,48 h进行取材,取材部位为双侧膝关节髌腱,在取材前保持动物在笼中饲养。整个取材过程均在超净工作台完成。将皮肤切开并暴露相关的整个股四头肌-髌骨-肌腱部分,将股四头肌末端离断,并剪断膝关节内的十字韧带,在肌腱胫骨止点将肌腱和髌骨剥离。随后将肌腱部分分为2段,一段同髌骨放入40 g/L多聚甲醛溶液进行固定,为后期进行石蜡包埋做准备;另一半由无菌锡纸包装后放入液氮中随即放入-80 ℃深低温冰箱进行保存。
1.4.4 苏木精-伊红染色 使用苏木精-伊红染色观察胶原形态变化。石蜡切片首先脱蜡水化,随后置于苏木精中浸泡5 min,用蒸馏水洗2 min后使用自然水冲洗10 min,随后再用伊红染液染色7 min。经过蒸馏水洗后,进行脱水树胶封固。染色完成后使用每个样本选取3张切片,每张切片在×100视野下观察肌腱胶原纤维的变化。
1.4.5 定量PCR测定 采用TRNzol总RNA提取试剂盒(TianGen,中国)进行样本RNA提取。首先将组织研磨成粉末状后,加入依次加入Trizol、氯仿,并使用12 000 r/min高速离心15 min后,加入异丙醇,再进行12 000 r/min高速离心15 min,按1 mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇。随后继续12 000 r/min高速离心5 min,弃去乙醇液体,加入无酶水溶解沉淀。采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher,美国)紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度。
采用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,日本)进行cDNA反转录。取总RNA,依次加入5×g DNA Eraser Buffer、gDNA Eraser和无酶水,消除残存的cDNA。随后取混合液10并依次加入PrimeScript RT Enzyme 1、RT Primer Mix 1、5×PrimeScript Buffer和无酶水。随后在37 ℃孵育15 min,85 ℃ 5 s,得到反转录的cDNA。DNA扩增过程采用ABI 7500型PCR仪(Thermo Fisher,美国),采用体系为SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus) ROX plus(Takara,日本)进行扩增,并加入引物(
表1)。扩增程序为:95 ℃30 s,(95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s) ×45个循环。根据原始检测结果,按照2-∆∆Ct相对定量计算公式,公式为:
以安静对照状态样本为对照样本,计算出各样品目的基因的相对定量结果,即其他各个样品相对于对照样品,计算得到目的基因mRNA转录水平的差异。
1.4.6 免疫组化分析 使用三步法免疫组织化学染色进行肌腱蛋白表达测定,首先将组织进行脱水包埋。在肌腱组织固定48 h后,依次经过体积分数70%-100%浓度梯度乙醇、正丁醇,最后进行石蜡包埋(国药集团,北京)。将包埋的石蜡块切成5 mm厚石蜡切片(RM2235,徕卡公司,德国),石蜡切片经过脱蜡;水化后,0.1%胰酶37 ℃抗原修复处理30 min,体积分数3%的双氧水清除内源性过氧化物15 min,体积分数10%的羊血清蛋白封闭15 min。添加一抗(1∶100)4 ℃过夜;次日37 ℃复温30 min,添加生物素化二抗工作液(IgG/Bio)室温下孵育20 min,经过0.01%PBS清洗后,添加辣根酶标记链霉卵蛋白工作液(S-A/HRP,SP-0023,博奥森,北京)室温孵育20 min。0.01%PBS 3×5 min,DAB显色5 min,流水冲洗15 min,最后脱水透明树胶封固。抗体稀释比例均为1∶100,包括Ⅰ型胶原蛋白(bs-0578R,博奥森,北京)、Ⅲ型胶原蛋白(bs-0549R,博奥森,北京)、转化生长因子β1抗体(bs-4909R,博奥森,北京)。
完成染色后将每个样本选出3张切片,每张切片在肌腱区域在×400视野下选取5个视野进行吸光度(A)值分析。选取镜下阳性褐色阳性反应区域,随后用A值/密度得到组织的光密度值。
1.5 主要观察指标 采用相对定量PCR测定肌腱组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、基质金属蛋白酶1 mRNA的表达,以免疫组化染色测定肌腱中Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、转化生长因子β蛋白的表达水平,采用苏木精-伊红染色观察肌腱中胶原纤维的变化。
1.6 统计学分析 所有数据结果均以x±s表示,采用SPSS 20.0进行数据统计分析。在同一组内不同时间点之间采用重复测量方差分析;在同一时间两组之间采用独立样本t检验,差异性标准为P < 0.05。