载血小板衍生生长因子3D生物打印半月板支架的制备流程

doi:10.12307/2021.059

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (28): 4465-4472.doi: 10.12307/2021.059

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

载血小板衍生生长因子3D生物打印半月板支架的制备流程

1南开大学医学院，天津市 300071；2解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2020-06-20 修回日期:2020-06-30 接受日期:2020-08-04 出版日期:2021-10-08 发布日期:2021-05-19
通讯作者: 郭全义，教授，解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市
作者简介:李浩，男，1997年生，安徽省宣城市人，汉族，南开大学医学院在读硕士，主要从事半月板、软骨组织工程相关方向的研究。
基金资助:
国家自然基金面上项目(81972070)，项目名称：3D生物打印组织工程无细胞半月板仿生支架原位再生修复半月板损伤研究，项目负责人：郭全义

Preparation of platelet-derived growth factor loaded three-dimensional bio-printed Meniscus scaffold

李浩1，2，杨振1，2，高仓健1，2，付力伟1，2，苑志国2，眭翔2，刘舒云2，郭全义2

1Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China; 2Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2020-06-20 Revised:2020-06-30 Accepted:2020-08-04 Online:2021-10-08 Published:2021-05-19
Contact: Guo Quanyi, Professor, Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Li Hao, Master candidate, Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China; Institute of Orthopedics, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81972070 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血小板衍生生长因子BB：是由多种细胞产生的重要生长因子，作为一种强效的促细胞分裂和趋化的生长因子，能够实现细胞的迅速增殖和有效招募；它可以结合并激活血小板直接生长因子受体β，产生促细胞增殖和细胞外基质产生的生理作用，在半月板损伤再生领域有一定应用潜力。
3D生物打印：具有高度自动化和精细控制的优势，可依据自体组织结构仿生设计并通过精确打印生物活性分子与细胞负载生物材料等构建相应人工组织，并可应用于组织工程和再生医学相关领域。
背景：基于原位组织工程再生理念应用于半月板再生领域中的需要，可利用3D生物打印技术构建一种有效结合招募性生物活性因子和优良材料的支架。
目的：优化负载有血小板衍生生长因子BB的聚己内酯/甲基丙烯酸酯化明胶/半月板细胞外基质3D生物打印支架制备流程，检测其生长因子缓释性能及对滑膜间充质干细胞迁移和增殖的作用。
方法：利用甲基丙烯酸酯化明胶/半月板细胞外基质制备光敏性生物墨水，采用3D生物打印技术制备单纯聚己内酯支架及聚己内酯/甲基丙烯酸酯化明胶/半月板细胞外基质仿生支架，最终负载血小板衍生生长因子BB于生物墨水内构建聚己内酯/甲基丙烯酸酯化明胶/半月板细胞外基质/血小板衍生生长因子BB功能化支架，检测支架的力学性能与缓释性能。分离培养新西兰大白兔滑膜间充质干细胞，通过Transwell和CCK-8实验探究3种支架对滑膜间充质干细胞的迁移和增殖行为的影响，以单纯培养基培养的细胞为阴性对照。将第3代滑膜间充质干细胞分别接种于3种支架上，利用共聚焦显微镜和扫描电镜观察3种支架上细胞的活性、黏附和生长状态。
结果与结论：①仿生支架的拉伸模量及压缩模量与单纯聚己内酯支架比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②功能化支架具有良好的缓释性能，可持续释放血小板衍生生长因子BB长达28 d；③相对于阴性对照组，仿生支架及功能化支架可促进滑膜间充质干细胞的迁移，其中以功能化支架促迁移效果更显著；④相对于阴性对照组，仿生支架及功能化支架培养4，7 d的细胞增殖较快(P < 0.001)，其中功能化支架的促增殖作用更明显；⑤死活染色显示，各组细胞活性良好，且功能化支架上的细胞数量最高；⑥扫描电镜显示，细胞均附着于3组支架表面生长，其中仿生支架及功能化支架上的细胞黏附数量较多，并分泌大量细胞外基质；⑦结果表明，负载血小板衍生生长因子BB的3D生物打印半月板支架具有良好的力学性能和生物相容性，可促进滑膜间充质干细胞的迁移和增殖。

https://orcid.org/0000-0002-9773-8313(李浩)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 半月板, 细胞外基质, 血小板衍生生长因子, 3D生物打印, 滑膜间充质干细胞, 迁移, 增殖

Abstract: BACKGROUND: Based on the need of in situ tissue engineering regeneration in the field of meniscus regeneration, three-dimensional (3D) bioprinting technology can be used to construct a scaffold which can effectively combine recruitment bioactive factors and excellent materials.
OBJECTIVE: To optimize the preparation process of polycaprolactone/methacrylate anhydride gelatin/meniscus extracellular matrix (PCL/GelMA/MECM) 3D bioprinting scaffold loaded with platelets derived growth factor-BB (PDGF-BB), and to test the sustained release properties of the growth factor and its effect on the migration and proliferation of the synovial mesenchymal stem cells.
METHODS: Photosensitive bio-ink was prepared by GelMA/MECM. PCL scaffold and PCL/GelMA/MECM bio-scaffold were prepared by 3D bioprinting technology. Finally, PDGF-BB was loaded to fabricate functional bioprinting PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffold, and then its mechanical properties and sustained release properties were tested. New Zealand white rabbit synovial mesenchymal stem cells were isolated and cultured. Transwell and CCK-8 assays were used to explore the effects of PCL scaffold, PCL/GelMA/MECM scaffold and PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffold on the migration and proliferation of synovial mesenchymal stem cells, and single medium cultured cells were used as negative control. The third passage of synovial mesenchymal stem cells was inoculated on PCL scaffold, PCL/GelMA/MECM scaffold and PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffold respectively. The viability, adhesion and growth of the cells on the three scaffolds were observed by confocal microscope and scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was no significant difference in tensile modulus and compression modulus between PCL/GelMA/MECM scaffolds and PCL scaffolds (P > 0.05). (2) PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds had good sustained release performance, and PDGF-BB could be released continuously for up to 28 days. (3) Compared with the negative control group, PCL/GelMA/MECM scaffolds and PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds could promote the migration of synovial mesenchymal stem cells, among which PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds were more effective. (4) Compared with the negative control group, the cells cultured with PCL/GelMA/MECM scaffolds and PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds proliferated faster after 4 and 7 days (P < 0.001), and the proliferative effect of PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds was more obvious. (5) Dead/Live staining showed that the cells in each group had good activity, and the number of cells on the PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffold was the highest. (6) Scanning electron microscope showed that the cells were attached to the surface of the three groups of scaffolds, and the cells on PCL/GelMA/MECM scaffolds and PCL/GelMA/MECM/PDGF scaffolds adhered to a large number of cells and secreted a large amount of extracellular matrix. (7) These results showed that the 3D bioprinted meniscus scaffold loaded with PDGF-BB had good mechanical properties and biocompatibility and could promote the migration and proliferation of synovial mesenchymal stem cells.

Key words: bone, materials, meniscus, extracellular matrix, platelet-derived growth factor, 3D bioprinting, synovial mesenchymal stem cells, migration, proliferation

中图分类号:

. 载血小板衍生生长因子3D生物打印半月板支架的制备流程[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4465-4472.

李浩, 杨振, 高仓健, 付力伟, 苑志国, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. Preparation of platelet-derived growth factor loaded three-dimensional bio-printed Meniscus scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(28): 4465-4472.

图/表（结果） 8

2.1 3D生物打印支架的大体观所有支架均成功打印，大体观可见两种支架呈半圆环状结构，PCL支架呈白色的十字交叉网格结构，纤维排列均匀整齐，支架内部孔隙互通性较好；3D生物打印支架可见PCL纤维之间有生物墨水材料填充，分布较为均匀，见图1。

2.2 3D打印支架的扫描电镜观察扫描电镜下观察发现，PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架均呈三维交叉网格状结构，PCL支架纤维直径规则，间隙均匀连通性好；PCL/GelMA/MECM支架可见凝胶均匀填充于PCL纤维之间，冷冻干燥处理后表面较为疏松多孔，见图2。

2.3 3D打印支架的力学性能单纯PCL支架的压缩模量为(11.10±0.95) MPa，3D生物打印PCL/GelMA/MECM支架为(12.136±1.29) MPa，两者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；单纯PCL支架的拉伸模量为(32.08±2.18) MPa，3D生物打印PCL/GelMA/MECM支架为(32.51±2.01) MPa，两者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明复合生物墨水打印并未明显影响到支架的力学性能，见图3。

2.4 3D打印支架的缓释特性负载于GelMA-MECM生物墨水中的PDGF-BB在缓释检测的28 d内，前3 d的短期释放情况表现为突释现象，释放较快，因子累计释放率达30.51%，随后的释放速度逐渐减缓，3-28 d的释放规律类似于零级释放动力学，可以持续缓释因子达28 d，累计释放率达80.42%，并且28 d后仍有缓慢释放的趋势，见图4。

2.5 不同支架对滑膜间充质干细胞迁移的作用各组细胞迁移及统计分析结果见图5所示， PCL支架组和阴性对照组细胞迁移数最少，且两者比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与阴性对照组相比，PCL/GelMA/MECM支架组、PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架组细胞迁移数明显增多(P < 0.001，P < 0.000 1)；PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架组细胞迁移数多于PCL/GelMA/MECM支架组(P < 0.000 1)。

2.6 不同支架对滑膜间充质干细胞增殖的影响支架浸提液培养细胞1，4，7 d后细胞数量明显增多，见图6。

2.7 不同支架上的细胞活性观察滑膜间充质干细胞在不同支架上培养4 d后的死活染色结果如图7所示，3组支架上的细胞活力均较好，染色成红色的死细胞较少，细胞大多密集生长在接种细胞的支架表面，相对于PCL支架，3D生物打印PCL/GelMA/MECM支架上的细胞数量更多，负载PDGF支架上的细胞生长最为密集。

2.8 不同支架上细胞的黏附及生长观察滑膜间充质干细胞在3D生物打印组织工程半月板支架上的第1，4，7的扫描电镜结果如图8所示，微观角度观察可见细胞均附着于支架表面生长，且形态多变且产生大量细胞外基质，PCL/GelMA/MECM及PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架均可见细胞紧密贴附并生长入微孔内，产生的丝状细胞外基质相较于对照组更为明显。

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引言

临床工作中发现半月板损伤是最常见的关节内损伤之一[1]，作为一种具有异质性结构的高度致密结缔组织，半月板内侧区域由于缺乏血供和高度分化的组织类型损伤后难以实现自我愈合[2-3]，损伤后的半月板可造成关节整体负重结构改变，进而导致相邻关节软骨损伤，最终诱发骨性关节炎[4]。对于半月板内侧无血供区的损伤，目前的外科治疗途径例如半月板的完全或部分切除治疗效果有限且明显增加了骨性关节炎的发生风险[5]，其他治疗方法包括半月板异体移植等都存在着诸多局限性，难以实现组织的功能再生[6]。近年来研究者们提出原位组织工程再生理念，将生物材料直接植入组织缺损处，利用相关药物或招募性因子来实现对周围组织内的内源性细胞尤其是干细胞的募集，实现组织修复与再生[7-8]。因此，实现支架材料的精细设计以提供机械支撑，招募特定细胞进入支架材料内并使其黏附生长，成为原位组织工程技术再生修复半月板损伤的研究重点。
近些年来兴起的3D生物打印技术适于应用在组织工程相关领域，该技术具有高度自动化和精细控制的优势，可依据自体组织结构进行仿生设计并最终通过精确打印生物活性分子与细胞负载生物材料等构建相应人工组织[9]。3D生物打印的一个突出优势是其对于生物材料的精密结构设计和制备能力[10]。在合成材料方面，以往研究已证实，基于聚己内酯[poly(ε-caprolactone)，PCL]材料的3D打印支架具有优良的力学性能、可降解性和生物相容性[11-12]，可作为组织工程半月板支架的理想骨架材料，然而PCL材料也具有疏水性和细胞附着性差等缺点[13-14]。考虑到目前组织工程领域广泛应用的甲基丙烯酸酯化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)具有的可打印性、生物相容性好、无细胞毒性和降解性等特点，可将其作为3D生物打印的生物墨水基础材料[15]。尽管GelMA材料具有诸多优势，但仍无法充分模拟半月板的天然细胞外基质微环境。大量研究表明，去除了细胞成分的细胞外基质内含多种有效成分，可以为募集来的种子细胞提供理想微环境[16]。GelMA和半月板细胞外基质(meniscus extracellular matrix，MECM)结合而成的3D打印用生物墨水有望充分促进细胞的黏附生长和细胞外基质的沉积。另一方面，血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)作为一种对于软骨细胞和间充质干细胞具有强烈趋化作用的生长因子，可以通过结合并激活血小板直接生长因子受体产生促细胞增殖和细胞外基质产生的生理作用，在半月板损伤再生领域有一定应用潜力[17]。以往已有研究报道，利用PDGF-BB与肝素的静电作用使其负载于脱细胞半月板支架之上，该支架可以缓慢释放PDGF-BB，并可以通过募集周围的组织细胞产生良好的修复效果[18]。
实验通过建立3D生物打印PCL/GelMA/MECM的半月板支架制备流程，负载PDGF-BB于GelMA/MECM生物墨水之中成功一体化打印生物活性支架，通过体外实验检测其微观结构、力学性能及生长因子的缓释性能，同时着重探究其对于滑膜间充质干细胞迁移性和增殖性调控的作用，期望在原位组织工程技术再生修复半月板损伤领域提供更多理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至 2020年6月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料 PCL与GelMA材料的理化性能，见表1；脱细胞MECM由课题组制备。

1.3.1 实验动物 4周龄新西兰大白兔4只，雌雄不拘，体质量约1 kg，购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0015。实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验主要试剂及仪器 PDGF-BB(近岸蛋白质科技有限公司，中国)；Transwell小室、胎牛血清、DMEM/F12培养基(Corning公司，美国)；结晶紫(Sigma-Aldrich公司，美国)；酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA，RayBiotech公司，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；SUNP BIOMAKER生物打印机(上普博源生物科技有限公司，中国)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800型，日本)；CMT5304-30KN型微机控制电子万能试验机(深圳三思科技有限公司，中国)；EZ-LX型单柱式电子万能试验机(岛津公司，日本)；EPOCH TAKE 3酶标仪(Bio Tek公司，美国)；TCS SP8共聚焦显微镜(Leica公司，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 生物墨水的制备依据苑志国等[19-20]方法制备猪的脱细胞MECM。将新鲜的成年猪半月板(购自北京市岳各庄菜市场)取出，去除多余滑膜组织并切割成为约1 mm×1 mm×1 mm的薄片，将组织碎块装入无菌容器中，使用医用双氧水(体积分数为3%)和无菌PBS分别漂洗3次，每次5 min；最后一次漂洗后选取部分组织进行细菌培养，确认无菌后将组织碎块加入去离子水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料，悬浮浆料的质量浓度为10 g/L。将浆料置于RC-6+型低温高速离心机中，4 ℃下1 500 r/min离心5 min，分离大颗粒的悬浮微粒；之后取上清液，4 ℃下2 000 r/min离心15 min；再次取上清液，4 ℃下6 000 r/min离心20 min；最后取上清液，4 ℃下10 000 r/min离心30 min，收集沉淀。然后混匀沉淀与无菌PBS，4 ℃下10 000 r/min离心30 min，重复3次。最终制成质量浓度为30 g/L的混悬液。
取一定质量GelMA溶于PBS中配成质量浓度为200 g/L的GelMA溶液。取一定体积MECM混悬液和等体积的GelMA溶液混合，加入一定体积的0.25%LAP溶液，最终制备成GelMA/MECM生物墨水。将GelMA-MECM生物墨水与100 mg/L的PDGF-BB溶液以9∶1体积混合制备包含生长因子的功能化生物墨水，其中PDGF-BB的工作质量浓度为10 mg/L，此特定质量浓度参考前期研究报道[21]。
1.4.2 3D生物打印半月板支架的制备结合家兔半月板的体外组织学和生物力学多角度综合分析不同层次参数，经计算机辅助设计构建半月板三维设计CAD数字模型，支架储存为STL格式，输入3D生物打印机设备中，设定支架层-层之间的排列角度和孔径大小，分别打印单纯PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架。打印程序如下：3D生物打印机胶喷头1内径400 μm，料筒1温度设置为85 ℃，以5 mm/s速度打印PCL；喷头2内径 500 μm，料筒2温度为20 ℃，以5 mm/s打印生物墨水，蓝关交联时间为20 s，生物墨水材料打印后溶胀至800-900 μm。半月板组织工程支架打印参数设定为：内径5.5 mm，外径11 mm，高度1 mm。
1.4.3 3D打印支架的理化性质表征支架形态及微观结构观察：取单纯PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架，大体观察其形态，经过冷冻干燥以及真空喷金处理后，扫描电镜下观察其微观形态并采集相片。
支架力学性能检测：利用CMT5304-30KN型微机控制电子万能试验机和EZ-LX型单柱式电子万能试验机对单纯PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架的压缩和拉伸性能分别进行测试，每组均重复4个样品。①压缩模量测试：将两种支架制备为5 mm×5 mm×2 mm的样本，PBS浸润后进行测试。预压缩5%，压缩速率为4.5 mm/min，压缩20个循环后进行正式测试，最大压缩10%，测试得出应力-应变曲线，计算其压缩模量。②拉伸模量测试：将两种支架制备为24 mm×
5 mm×2 mm的样本，PBS浸润后进行测试。预拉伸 5%，拉伸20个循环后进行正式测试，以12 mm/min的拉伸速率进行拉伸，直至样品拉断，获得应力-应变曲线，计算拉伸模量。
缓释性能特性：角膜环钻钻取直径约7 mm的PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架，设置3个平行量，置于5 mL冻存管中，加入0.5 mL含有0.1%牛血清白蛋白的PBS溶液，置于37 ℃恒温摇床上60 r/min振荡，分别于第1，2，3，5，7， 14， 21，28天收集上清液，ELISA试剂盒检测上清液中缓释PDGF-BB量，计算支架包含的因子累计释放比例并与对应时间拟合为时-量效曲线。
1.4.4 3D打印支架的生物学作用
滑膜间充质干细胞的分离培养：取新西兰大白兔4只，按照文献[22-24]方法进行滑膜间充质干细胞分离、传代和培养。在无菌条件下取兔膝关节滑膜置于含有双抗的PBS中，充分剪碎滑膜组织后加入10倍体积的0.2%Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃恒温箱中磁力搅拌消化1 h；然后加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，经滤器(100目)过滤后置于50 mL离心管中密封15 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，移入25 cm2培养瓶，每两三天更换培养液。显微镜下观察，待细胞生长至80%-90%融合时进行传代，用0.25%的胰酶消化传代，培养至P3代细胞备用。使用流式细胞仪进行表面特异性抗原鉴定[23]。
Transwell小室检测细胞迁移：利用Transwell小室检测单纯PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架对于滑膜间充质干细胞迁移能力的作用。在24孔板中插入Transwell小室，将不同支架加入下室中，吸取DMEM/F12培养基加入载有支架的孔内，放入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。之后于上室中加入细胞(2×104个/室)，继续放入到37 ℃恒温箱中孵育24 h。用棉签擦除仍存在于上室中未迁移进下室的细胞，PBS洗涤后用40 g/L多聚甲醛固定迁移至下室的细胞，固定30 min后用0.1%结晶紫进行细胞染色20 min。统计迁移的滑膜间充质干细胞数目，以每孔6个视野(×200)中的细胞平均数为迁移数据，利用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics，Bethesda，MD)来定量迁移细胞。每组样品分别重复3次，数量迁移结果取平均值。
CCK-8法检测细胞增殖：通过CCK-8法检测单纯PCL支架、PCL/GelMA/MECM支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架浸提液培养的滑膜间充质干细胞增殖情况。将3种支架置于无菌DMEM/F12培养基中，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱内放置24 h，吸取浸提液备用。将第4代滑膜间充质干细胞按2 000个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞黏附2 h后弃去含有体积分数1%胎牛血清的原培养基，分4组培养，分别加入DMEM/F12培养基(阴性对照)、PCL支架浸提液、PCL/GelMA/MECM支架浸提液、PCL/GelMA/MECM/PDGF支架浸提液，浸提液体积均为100 μL。培养1，4，7 d后，弃去原培养基后PBS清洗一遍，每孔加入110 μL的含有10 µL CCK-8溶液的DMEM/F12培养基，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。孵化完成后在450 nm波长处检测吸光值。每组样品重复5次，结果取平均值。
1.4.5 3D打印支架的生物相容性取第3代滑膜间充质干细胞，消化计数分别种植于PCL支架(对照组)、PCL/GelMA/MECM支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架上(2.5×105/支架)，置于37 ℃培养箱中孵育2 h以待细胞贴壁，随后添加DMEM/F12培养液孵育。细胞活性观察：培养4 d后进行死活染色。将5 μL钙黄绿素-AM及20 μL乙锭二聚体-1加到10 mL无菌PBS中，取适量加入各孔中室温下30 min，继续用无菌PBS轻柔清洗3次后吸净PBS，激光共聚焦显微镜下拍照观察。
细胞黏附及生长观察：培养1，4，7 d后，扫描电镜观察细胞黏附形态和生长状况。PBS清洗2次后加入4%戊二醛溶液固定支架2 h，弃去固定液后继续PBS清洗2次，分别用体积分数50%，70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脱水，每次脱水10 min，将样本轻粘于导电胶上，真空干燥后喷金，扫描电镜观察并拍照。
1.5 主要观察指标 3D生物打印PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB半月板支架的理化性能及对滑膜间充质干细胞增殖与迁移的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件分析实验数据。数据以x±s表示，均进行方差统计分析，多组间采用单因素ANOVA分析，组间采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

原位组织工程技术应用于半月板再生修复领域，不仅需要构建具备生物力学性能和细胞亲和性的支架，还亟需解决如何募集到足够的自体细胞(尤其是干细胞)并使其充分黏附和增殖于支架材料之上的问题。基于原位组织工程再生理念，实验设计了一种负载PDGF-BB的3D生物打印支架，对其基本特性进行了检测和表征，并进一步研究了该支架在体外实验中是否具有促进干细胞的迁移、黏附和增殖的作用。
GelMA作为一种生物材料被广泛应用于临床当中，除了可打印特性外其还在生物相容性、生物降解性和毒性方面都有着明确的适用范围和充分的研究基础[15，25]。去细胞MECM与天然半月板的组织成分类似，并具有一定的促细胞浸润和组织重构作用[26-27]。因此可以利用二者的互补优势，以GelMA为基础设计制备生物墨水，结合MECM进一步提升生物相容性。课题组前期研究将GelMA与MECM混合交联形成水凝胶，虽然提升了力学性能和细胞相容性等，但仍缺乏足够的机械支撑和生物活性[28]。此次实验利用3D生物打印技术成功实现了PCL/GelMA/MECM复合支架的一体化打印，实验结果表明PCL/GelMA/MECM支架PCL纤维和生物墨水材料均匀分布，相互贴合较为紧密，未见明显空隙或分隔，提示一体化打印过程较为成功，且冷冻干燥后表面疏松多孔，有利于细胞黏附，支架的整体性优良并与之前研究的结果相近[29]。实验设计支架的压缩模量和拉伸模量均与天然半月板的组织力学指标相符合[27]，同时PCL支架和3D打印PCL/GelMA/MECM支架之间的压缩模量和拉伸模量比较差异无显著性意义。
PDGF-BB作为一种强效的促细胞分裂和趋化的生长因子，能够实现细胞的迅速增殖和有效招募[30-31]。PDGF-BB在组织原位生成后能够显著促进间充质来源的细胞，如祖细胞、周细胞、成纤维细胞和软骨细胞等的分裂效应[32-33]。PDGF-BB还有其他诸多的作用，例如促血管生成、趋化作用和增加胶原合成等[34-35]。作为半月板愈合过程中发挥趋化活性的关键调节因子，半月板损伤后PDGF的表达水平会相应降低[18，36]；同时，引入关节腔内环境中的生物活性成分会被血液和淋巴循环迅速清除而只能发挥短期的治疗效果[37-38]，因此，构建载药组织工程支架并实现药物的缓速和可控释放一直是组织工程关注的核心问题。此次体外缓释实验结果表明，负载有PDGF-BB的支架在前3 d迅速释放生长因子，并在之后的时期内减缓了因子的释放性，使其缓释时间长达28 d，累计释放率达到80.42%。这种缓释的时-量效特点可使得支架在半月板损伤早期迅速原位募集间充质干细胞及其他新生细胞，后期缓慢线性释放的因子能够维持这种生物学效应并为组织再生持续提供高质高量的内源性细胞。基于GelMA材料的凝胶在诸多研究中表现出对趋化因子或生长因子的良好缓释特性[39-41]，这提示了GelMA在作为生物墨水的基础材料之外还具有负载生物活性分子有序释放的应用潜力。
实验重点研究了负载PDGF-BB生长因子3D生物打印支架对滑膜间充质干细胞迁移性和增殖性的作用，实验结果表明，支架负载的PDGF-BB生长因子能够有效促使干细胞迁移，这与ZHANG等[42]的研究结果是一致的。有趣的是，3D生物打印PCL/GelMA/MECM支架同样展现出来一定的促干细胞迁移作用，这可能是由于细胞外基质基生物材料存留的活性物质可以提供一些诱导干细胞迁移的信号[43]。在CCK-8检测中，实验组同对照组相比，随着时间的延长，在第4天和第7天，负载PDGF-BB的3D生物打印支架组展现出明显的增强干细胞增殖的作用，说明PDGF-BB能够从3D生物打印支架中迅速释放出来后并保持生物活性，这也同缓释的数据相契合，体外缓释实验相应的在第1天释放出来的因子比例可达到11.66%。另外，3D生物打印PCL/GelMA/MECM支架也具有一定的提升干细胞增殖性的作用，说明半月板支架中的MECM成分具有良好的生物活性，可以发挥对细胞增殖的正性作用，同YIN等[44]的研究结果是一致的。此外，3D打印PCL支架组与阴性对照组细胞增殖无差异，表明PCL材料对于滑膜间充质干细胞的增殖作用影响不大，同时也印证了实验中的支架材料均具有安全无毒的特点。
实验还进一步验证了3D生物打印支架的生物相容性。死活染色结果表明，3组支架上的细胞活性在第4天均表现良好，3组支架均未见明显死细胞染色荧光，而负载PDGF-BB3D生物打印支架组的细胞活性最为明显，加载天然细胞外基质材料的3D生物打印支架组也有一定的促细胞生长效应，这同CCK-8实验结果一致，表明3组支架总体均具有较好的生物相容性，侧面印证了PDGF-BB的促细胞增殖作用。第1，4，7天的扫描电镜结果呈现了3组支架上的细胞生长状态，单纯PCL组的细胞主要生长附着在PCL纤维之上，黏附性较差且多呈皱缩状，这主要是由于PCL材料相对疏水；PCL/GelMA/MECM、PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架上的细胞则广泛附着生长于凝胶和PCL纤维之上，细胞紧密黏附呈舒展状态并相互连接成片，形态多变并可见呈丝状的大量细胞外基质分泌，因此可以得出3D生物打印支架材料总体具有良好的生物相容性结论。
综上所述，实验围绕原位组织工程这一理念，通过设计建立负载PDGF-BB生长因子的3D生物打印支架制备流程，充分结合该生长因子的促细胞迁移和增殖能力和生物打印支架的良好微环境特性，制备了一种具有原位募集滑膜间充质干细胞潜力的生物活性半月板支架。该生物打印支架满足半月板缺损修复的力学要求，优势在于其理想的缓释性能及能够充分发挥所负载因子的强效促干细胞迁移和增殖作用，同时具有的良好生物相容性。实验仍需进行体内募集实验的补充与验证，并进一步完善动物实验以完整评价支架的修复性能，为进一步提高半月板损伤再生修复的治疗和预后提供新的思路和理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载血小板衍生生长因子3D生物打印半月板支架的制备流程

Preparation of platelet-derived growth factor loaded three-dimensional bio-printed Meniscus scaffold

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