电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性

doi:10.12307/2021.060

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (28): 4473-4479.doi: 10.12307/2021.060

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性

廖思达1，2，孟昊业2，李俊康2，徐亦驰2，李获2，田萧羽1，冯勇2，汪爱媛2，彭江2

1中国人民解放军医学院，北京市 100853；2中国解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2020-07-15 修回日期:2020-07-17 接受日期:2020-08-22 出版日期:2021-10-08 发布日期:2021-05-19
通讯作者: 彭江，研究员，中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:廖思达，男，1995年生，辽宁省沈阳市人，汉族，中国人民解放军医学院在读硕士，主要从事软骨等组织工程相关方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81972047)，项目负责人：彭江；国家重点研发计划(2016YFC1102104)，项目参与者：彭江

Preparation of alginate-gelatin-adipose-derived stem cells microspheres by electrospray and feasibility on repairing articular cartilage injury

Liao Sida1,2, Meng Haoye2, Li Junkang2, Xu Yichi2, Li Huo2, Tian Xiaoyu1, Feng Yong2, Wang Aiyuan2, Peng Jiang2

1Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 2Institute Orthopedics, The First Medical Center of the PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2020-07-15 Revised:2020-07-17 Accepted:2020-08-22 Online:2021-10-08 Published:2021-05-19
Contact: Peng Jiang, Researcher, Institute Orthopedics, The First Medical Center of the PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Liao Sida, Master candidate, Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; Institute Orthopedics, The First Medical Center of the PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National natural science foundation of china, no. 81972047 (to pj); the national key research and development program, no. 2016YFC1102104 (to PJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪源性干细胞：来源于脂肪组织的一类间充质干细胞，具有多向分化能力，部分文献简称为脂肪干细胞，在骨、软骨、神经再生等诸多领域中被广泛应用。脂肪源性干细胞增殖能力强，传代培养简单，因其具有极大的临床转化潜力，所以成为了近年来组织工程领域的研究热点。
海藻酸盐微球：是一种天然的生物材料，已被证实具有一定的组织修复能力。海藻酸盐微球的制备方法有电喷雾法、乳化法等，主要原理是海藻酸钠溶液与钙离子交联形成水凝胶。海藻酸盐微球作为微载体也可附载细胞到达缺损部位，促进组织再生。
背景：微球可作为细胞递送系统，通过注射或者与其他支架相结合的方式使细胞定位于软骨损伤处使其再生。
目的：采用电喷雾法将脂肪源性干细胞负载至海藻酸盐-明胶微球中，评估微球中的细胞活性、增殖和成软骨分化能力。
方法：使用电喷雾技术制备含不同质量浓度明胶(0，5，15，25 g/L)的海藻酸盐微球，光学显微镜下观察微球的外观，选择形成完整微球的明胶质量浓度用于以下实验。使用电喷雾技术制备含脂肪源性干细胞的海藻酸盐微球与海藻酸盐微球-明胶微球，光学显微镜下观察成球效果。将含细胞的两种微球培养于旋转细胞培养系统内，在设定的时间点检测微球内细胞的增殖能力、活性与成软骨能力。
结果与结论：①加入0，5 g/L的明胶可制备出完整的微球，微球直径分别为(365.85±16.88)，(358.85±23.97) μm，两种微球直径比较差异无显著性意义(P﹥0.05)，后续实验选择明胶质量浓度为5 g/L；②加入脂肪源性干细胞不影响藻酸盐微球与海藻酸盐微球-明胶微球的成球性与微球直径；③含细胞海藻酸盐微球-明胶微球培养7，14 d的细胞增殖数量、活细胞比例均高于含细胞海藻酸盐微球(P < 0.05)；④成软骨诱导培养后，含细胞海藻酸盐微球-明胶微球诱导7，14，21 d的糖胺多糖含量高于含细胞海藻酸盐微球(P < 0.05)；⑤结果表明，海藻酸盐-明胶微球更易促进脂肪源性干细胞的增殖并保持细胞活性，是软骨组织工程领域中一种具有巨大潜力的生物材料。
https://orcid.org/0000-0002-1489-3730(廖思达)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 海藻酸盐, 明胶, 软骨组织工程, 生物材料, 电喷雾, 微载体

Abstract: BACKGROUND: Microsphere can be used as a cell delivery system to localize cells in cartilage injury site and regenerate them by injection or combined with other scaffolds.
OBJECTIVE: To produce adipose-derived stem cells (ADSCs)-embedded alginate-gelatin microspheres for cartilage tissue engineering by electrospray, and to evaluate cell viability, proliferation and chondrogenic differentiation ability of microspheres.
METHODS: The electrospray technology was used to produce alginate-gelatin microspheres with different gelatin concentrations (0, 5, 15, 25 g/L). The morphology of microspheres could be observed under the optical microscope. The mass concentration of gelatin to form complete microspheres was selected for the following experiments. Alginate-gelatin-ADSCs microspheres and alginate-ADSCs microspheres were produced by electrospray. The spherical effect was observed under the optical microscope. Two kinds of microspheres containing cells were cultured in rotating cell culture system. The proliferation ability, viability and chondrogenic ability of the cells in the microspheres were detected at the set time point.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Intact microspheres could be produced by adding 0, 5 g/L gelatin. The diameter of the microspheres was (365.85±16.88) or (358.85±23.97) μm. There was no significant difference in the diameter of the two kinds of microspheres (P > 0.05). The mass concentration of gelatin as 5 g/L was selected for subsequent experiments. (2) The addition of ADSCs did not affect the spheroidization and the diameter of alginate microspheres and alginate microspheres-gelatin microspheres. (3) The number of cell proliferation and the proportion of living cells at 7 and 14 days were higher in the alginate-gelatin-ADSCs microspheres than those without alginate-ADSCs microspheres (P < 0.05). (4) The content of glycosaminoglycan was higher in alginate-gelatin-ADSCs microspheres than that in alginate-ADSCs microspheres at 7, 14, and 21 days after chondrogenic differentiation (P < 0.05). (5) It is concluded that alginate-gelatin-ADSCs microspheres are prone to promote proliferation and keep cell viability, and are a kind of biomaterials with great potential in the field of cartilage tissue engineering.

Key words: bone, materials, alginate, gelatin, cartilage tissue engineering, biomaterials, electrospray, microcarrier

中图分类号:

廖思达, 孟昊业, 李俊康, 徐亦驰, 李获, 田萧羽, 冯勇, 汪爱媛, 彭江. 电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4473-4479.

Liao Sida, Meng Haoye, Li Junkang, Xu Yichi, Li Huo, Tian Xiaoyu, Feng Yong, Wang Aiyuan, Peng Jiang. Preparation of alginate-gelatin-adipose-derived stem cells microspheres by electrospray and feasibility on repairing articular cartilage injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(28): 4473-4479.

图/表（结果） 10

2.1 ADSCs流式细胞术检测结果流式细胞仪分析结果显示，分离的ADSCs间充质干细胞标志CD29呈阳性(98.93%)，而造血谱系标志物CD45和内皮细胞标志物CD31的表达水平极低(0.48%，0.48%)，见图1。

2.2 ADSCs的表征及分化能力光学显微镜下可见，P3代ADSCs具有扁平的成纤维细胞样形态，这与其他文献报道相一致[25]。在培养瓶中生长的ADSCs显示了其具有分裂增殖的能力，见图2A；在成脂肪诱导培养基中培养ADSCs 21 d后，油红O染色观察到细胞内脂质滴，见图2B，发现其具有成脂肪分化能力；将ADSCs在软骨诱导培养基中培养21 d后，阿尔新蓝染色可见蛋白聚糖基质的软骨组织，见图2C；在成骨诱导培养基中培养ADSCs 21 d后，茜素红S染色观察到的细胞中含有钙沉积，见图2D，证实了其成骨分化能力。

2.3 电喷雾微球的形态学特征通过电喷雾制备了海藻酸盐微球与含不同质量浓度明胶的海藻酸盐-明胶微球，其中海藻酸盐-25 g/L明胶基团在室温下固化导致电喷雾化管堵塞，无法制备微球；海藻酸盐微球和海藻酸盐-5 g/L明胶微球的外观相似且形状完整，见图3A，B，微球直径分别为(365.85±16.88)，(358.85±23.97) μm，二者比较差异无显著性意义(P﹥0.05)；海藻酸盐-15 g/L明胶微球圆度下降、微球破裂，无法成球，见图3C。

2.4 含ADSCs微球的形态学特征光学显微镜下观察到，两种含ADSCs微球的成球效果基本相似，见图4 A，B，加入ADSCs依然可以通过电喷雾方法制备形成完整的微球。统计结果显示，无论是海藻酸盐微球、海藻酸盐-5 g/L明胶微球还是包埋ADSCs的微球，按照上述电喷雾所设置的参数，所合成的各组微球直径为(358.59±30.44) μm，组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4C，这说明加入5 g/L的明胶成分以及ADSCs在海藻酸盐之中都可以形成直径相似的完整微球。

2.5 含细胞微球内细胞增殖情况如图5所示，随着培养时间的延长，两种微球所包裹的ADSCs细胞数量都明显具有增加的趋势，然而海藻酸盐-ADSCs微球培养第7，14天的细胞数量明显少于海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球[(4.56±0.35)×106，(9.26±0.40)×106，P < 0.05；(7.73±0.47)×106，(15.70±0.95)×106，P < 0.05]。

2.6 含细胞微球内的细胞活性 Live/Dead染色结果显示，含细胞两微球培养第0天的ADSCs均具有较高且较为相似的细胞活性，海藻酸盐-ADSCs微球第7天开始观察到部分死亡细胞(红色)，且至第14天时观察到更多的死亡细胞，见图6。

与海藻酸盐-ADSCs微球相比，海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球培养14 d内的细胞死亡不明显，见图7，这表明明胶对保持微球中ADSCs的高活性是常有益的。

image J统计定量分析结果显示证实了染色结果，海藻酸盐-ADSCs微球与海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球培养第7，14天的活细胞比率比较差异均有显著性意义[(82.9±1.59)%，(93.7±1.00)%，P < 0.05；(75.4±0.58)%，(93.73±1.75)%，P < 0.05]，见图8。

2.7 含细胞微球内的细胞形态变化共聚焦显微镜观察结果显示，部分细胞具有极小范围伸展的形态变化，其中含明胶成分的微球中细胞伸展的稍多，但相比较于传统平板培养，被包裹在微球中的细胞所形成的伪足极小，见图9。

2.8 含细胞微球的成软骨能力成软骨诱导培养基诱导21 d后分阿尔新蓝染色显示，海藻酸盐-ADSCs微球内含有可被阿尔新蓝染色为蓝色的酸性糖胺聚糖成分，见图10A；海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球诱导后的染色着色更深，见图10B，且两组使用相同种类、浓度的阿尔新蓝染色液，进行相同的染色时间，保证了染色方法两组间均一，证实了海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球有更多的细胞外基质沉积，使着色更深。硫酸化糖胺聚糖定量分析结果显示，随着诱导时间的增加，两种含细胞微球内的硫酸化糖胺聚糖水平增加，与染色定性实验相似，海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球诱导培养第7，14，21天分泌的硫酸化糖胺聚糖水平高于海藻酸盐-ADSCs微球[第7天：(3.50±0.64)，(1.96±0.64) mg/L， P < 0.05；第14天：(8.24±0.42)，(4.93±0.24) mg/L，P < 0.05；第21天：(19.54±1.28)，(10.15±0.43) mg/L，P < 0.05]，见图10C。

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引言

软骨损伤的治疗对骨科医生来说是一个挑战[1]。在最近的几十年中，组织工程的发展为软骨损伤提供了一些新的治疗方法[2-5]。细胞治疗是组织工程的重要组成部分，间充质干细胞为组织再生提供了巨大潜力[6-7]。脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)作为一种间充质干细胞在促进软骨再生方面有着积极作用[8]，有文献将其简称为脂肪干细胞[9]。ADSCs的获取要比骨髓干细胞和软骨细胞容易，损伤较低且来源丰富[10]，因此ADSCs具有更大的临床价值。然而，传统的平板细胞生长容易引起接触抑制，并且将细胞移植到受损区域后缺乏载体支持很容易导致细胞的丢失。将细胞嵌入微球可以避免此问题[11]，微球的应用在软骨组织工程领域取得了长足进步[12-13]，微球具有独特的优势，例如为细胞生长提供适当的微环境；此外，由于微球直径为微米级别[14]，因此可以通过注射微创地达到关节软骨缺损区域。
含细胞微球应用广泛[15]，微球可作为细胞递送系统，通过注射或者与其他支架相结合的方式使细胞定位于软骨损伤处使其再生[16]。目前微球的制备方法大多采用化学乳化法，化学乳化法需添加化学有机溶剂进行多步骤操作，这将存在化学有机溶剂残留的风险[11]。高压静电场喷雾法制备微球技术是通过高压电使针内液体带电，由于静电力使液滴分散为微滴喷雾至交联液体中成球，而且更重要的是无需添加化学有机活性剂，相比于乳化法更安全、高效、简便。
藻酸盐微球已有报道可用于组织再生[17]。海藻酸盐是一种多糖，其结构类似于天然软骨的细胞外基质[18]，但主要缺点是它对细胞增殖和黏附的支持能力较差[19]。这些缺点可以通过添加明胶来解决[20]，然而目前对于加入明胶成分的海藻酸盐微球研究较少，而且缺乏ADSCs在含有明胶成分的微球中是否能够有效增殖的研究。于是，实验提取了SD大鼠的ADSCs，采用电喷雾法将ADSCs负载至海藻酸盐-明胶微球中，对微球形态、细胞活性及其增殖和成软骨分化能力进行评估。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年8月在解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂和仪器明胶(Type B)、海藻酸钠(Sigma，美国)；DMEM、FBS、Ⅰ型胶原酶(GIBCO，美国)；软骨分化完全培养基(Cyagen，美国)；电喷雾装置(Nisco，瑞士)；流式检测抗体CD31、CD34、CD45、CD29 (BD，美国)；Live/Dead细胞死活染色试剂盒(Life Technologies，美国)；旋转细胞培养系统(RCCS，Synthecon，美国)；组织糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒(Genmed美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)。
1.3.2 实验动物 SD大鼠5只，雌雄不拘，体质量180-220 g，购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2016-0002。
1.4 实验方法
1.4.1 ADSCs的提取通过先前报道的方法从大鼠脂肪组织提取ADSCs[21]。简而言之，取SD大鼠腹股沟的脂肪组织并切碎，PBS冲洗，37 ℃下用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化；使用70-μm尼龙网过滤细胞悬液，然后将体积分数10%胎牛血清添加到培养基中，以便对含有胶原酶的细胞悬液进行中和，然后以800×g离心5 min；通过无菌移液管吹打离心后的细胞团进行重悬，紧接着使用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM对细胞进行培养。每2 d换液一次，至细胞融合至 80% 左右进行常规细胞传代。传至第 3 代ADSCs备用。
1.4.2 ADSCs的流式细胞术鉴定将P3代ADSCs结合抗体CD31、CD34、CD45和CD29分析特定的表面标记物。具体来说，将106细胞重悬于50 µL PBS的流式管中，每个流式管分别加入1 μg抗体，并在室温下于黑暗中孵育15 min。然后将其加入2 mL PBS中，400×g离心5min。丢弃上清液后，加入500 µL PBS进行分析，通过流式细胞仪分析所有样品。
1.4.3 ADSCs的诱导分化能力在体外使用三系诱导的方法分析ADSCs的诱导分化能力。对于脂肪方向分化培养基，将 20 mL的FBS、2 mL的青霉素-链霉素、2 mL的谷氨酰胺、400 µL的胰岛素、200 µL的地塞米松、200 µL的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤添加到175 mL的高糖DMEM中。对于成骨分化培养基，向175 mL DMEM中加入2 mL的β-甘油磷酸、20 µL的地塞米松和400 µL的抗坏血酸。对于软骨形成的分化，使用了微团培养技术，将4×105细胞放入15 mL离心管中进行离心沉淀，然后添加软骨分化完全培养基，36 h后在离心管底部出现细胞簇，轻拂离心管底部，使软骨球悬浮在培养基中，然后每3 d更新成软骨分化培养液。在37 ℃和体积分数5%CO2的环境下，用上述3种培养基诱导ADSCs分化21 d，成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分别进行茜素红、油红O、阿尔辛蓝染色。
1.4.4 制备含明胶的海藻酸盐微球根据文献报告[22]，选择了质量浓度为15 g/L的海藻酸钠溶液和20 g/L的氯化钙溶液，以便制备出完整且规则形状的微球。为了探索合适的明胶质量浓度，在40 ℃条件下将明胶以5，15，25 g/L的质量浓度分别溶于15 g/L的海藻酸钠溶液中。电喷雾装置由高压电源(0-10 kV)和定量推进注射器泵组成。使用电喷雾装置将海藻酸钠溶液和上述3种质量浓度的海藻酸钠明胶混合溶液分别喷雾到氯化钙溶液中，将电压设置为6.5 kV，喷雾针尖距氯化钙液面3 cm，溶液前进速度为15 mL/h，制备海藻酸盐微球和海藻酸盐-明胶微球。使用光学显微镜观察微球的外观，评估明胶质量浓度对水凝胶成球的影响，然后筛选出可以制成完整微球的溶质质量浓度。
1.4.5 合成ADSCs的微球选取可成功制备微球的合适明胶质量浓度。对于含ADSCs的微球，首先将107个ADSCs分别溶解于10 mL的15 g/L藻酸钠溶液和10 mL的15 g/L藻酸钠-5 g/L明胶溶液中。然后通过上述参数，使用电喷雾装置将溶液喷雾到氯化钙溶液中，形成海藻酸盐-ADSCs微球和海藻酸盐-明胶-ADSCs微球。形成10 min后，将含有ADSCs的微球在氯化钙溶液中收集。
然后，将收集的藻酸盐微球和海藻酸盐-明胶微球和含ADSCs的微球通过光学显微镜观察成像。随机选择每组具有完整球体的30个微球体(n=30)，使用图像分析软件(Image J)测量其直径。
1.4.6 微球的培养将含ADSCs的微球在旋转细胞培养系统中培养14 d，使用的培养基是含100 U/mL青霉素/链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM，每2 d更换一次培养基。旋转细胞培养系统RCCS的旋转速度设置为15 r/min，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中连续旋转。
细胞增殖与活性：培养第0，7，14天后，将3 mL的微球用9 g/L氯化钠溶液洗涤两三次，然后在55 mmol/L柠檬酸钠溶液中液化15 min，使用锥虫蓝染色并立即计数。用血细胞计数器在显微镜放大10倍下计数细胞并计算总细胞数，每组计数取3个不同的视野，分别由3位不同的观察者进行重复以减少误差。
培养第0，7，14天后，通过live-dead细胞存活力测定法确定两种微球中ADSCs的存活率。首先将微球用PBS洗涤，然后浸入6孔板中的1 mL活/死染色溶液中。为了确保染料扩散到整个溶液中，将样品在Live/Dead染色溶液中于黑暗处孵育15 min，荧光显微镜下观察。每个样本各取3个视野，将所得到的观察结果通过Image J软件进行计数定量分析，计算活细胞(绿色)与总细胞的比例以便算出存活率。
细胞的形态变化观察：培养第0，7天后，将两种微球于黑暗条件下使用上述的Live/Dead染色液中孵育15 min，激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光细胞的形态。
成软骨能力：使用成软骨分化培养基诱导上述两组微球，每2 d更换一次培养基。诱导21 d后进行阿尔新蓝染色30 min，光学显微镜下观察。
成软骨诱导培养第0，7，14，21天后，用55 mmol/L檬酸钠溶液消化过夜。次日用 1，9-二甲基亚甲蓝染料法通过吸光度值对应拟合标准曲线，计算样本的糖胺聚糖含量，再算出每毫升样品中的硫酸化糖胺聚糖含量。
1.5 主要观察指标两种微球内细胞的增殖能力、活性与成软骨能力。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，检验水准p=0.05。

讨论

软骨损伤愈合较难已成为了广泛的共识[26]。组织工程技术为软骨损伤的修复提供了一些极具价值的方法[27]。组织工程技术中含有合适的种子细胞至关重要[28-30]。ADSCs在软骨组织工程领域是一种极具潜力的细胞[31-32]。此次实验通过流式细胞术鉴定以确定成功提取ADSCs，并且通过3系诱导分化证明了ADSCs的多向分化能力。ADSCs与其他间充质干细胞同样具有成软骨分化能力，更重要的优势在于ADSCs来源于脂肪组织，人体中脂肪组织丰富，相比于术中骨髓间充质干细胞的提取分离，ADSCs更易于获得，并且具有成软骨分化能力，在软骨损伤修复领域是一种具有巨大潜力的种子细胞。
将种子细胞植入特定的软骨缺损部位也是软骨组织工程中的重要环节[27]。微球修复软骨损伤的方法已被广泛应用并取得了很好的效果[33]。与化学乳化法微球制备技术相比，电喷雾合成的微球有着高细胞装载效率[34]。化学乳化法操作复杂、步骤繁琐，细胞贴附于微球并且增殖过程仍需要大量的时间，这样将直接导致患者二次手术时间延长及社会和经济负担加重，电喷雾法避免了这一问题，可直接将种子细胞包埋于微球中；另外，电喷雾技术还可以非常有效地避免添加不可降解的活性剂，更有利于临床转化，是将细胞负载至微球的首选方法[34-37]，于是实验采用电喷雾法制备生物材料。
在组织工程领域合适的微环境是重要因素之一。海藻酸盐-明胶材料可为细胞提供合适的软骨细胞生长微环境[38]。在电喷雾法制备微球中采取了4种质量浓度的明胶与海藻酸盐配比作为相互对照，结果表明，在海藻酸钠中添加B型明胶5 g/L是制备完整微球的最佳质量浓度，证明了较高质量浓度的明胶无法合成完整微球或者在常温条件下凝固，无法通过电喷雾方法合成微球。实验结果显示5 g/L明胶成分的加入与传统海藻酸盐微球直径相似，球形完整。对于明胶成分而言，高质量浓度在常温下黏性较强，无法完全溶解而通过电喷雾针头使液体分散成小液滴，无法通过简便的电喷雾法制备出完整微球，临床转化能力差。
另外，种子细胞需要适合培养方法，如模仿软骨形成的微环境是必不可少的[39]。海藻酸盐和明胶是天然的生物材料，其具有生物相容性好、成本低等诸多优点，在软骨组织工程领域多有报道[40-43]。然而，海藻酸盐对细胞的黏附能力较差，限制了其广泛应用。有文献报道明胶可有效促进细胞的黏附与增殖[20]，加入明胶成分的生物材料可以克服藻酸盐促进细胞黏附增殖能力差的缺点[19]。然而目前含明胶海藻酸盐微球对脂肪干细胞影响的研究缺乏，因此作者进行了探索。此次实验细胞计数及Live/Dead染色定量和定性分析结果发现，
ADSCs在含有明胶成分的微球中比无明胶成分的藻酸盐微球中增殖更快、存活率更高；通过共聚焦显微镜观察结果发现，经过培养后的微球内细胞形态发生了变化，细胞极小范围的伸展，在含有明胶成分的微球上尤其如此。不过，在微球中的细胞伸展范围极小，不同于平板培养中形成的大量细胞伪足，作者认为这是由于含细胞微球是通过两种液相交联形成，细胞被包裹在微球之中，对于细胞而言所留存的空间较小。海藻酸盐和明胶已经被证明是一种可降解的生物材料，随着其代谢增殖的细胞释放迁移[44-45]，用于修复组织损伤。实验制备了目的微球，证明了微球中的细胞可分泌软骨相关的糖胺多糖成分，初步探索了其用于关节软骨损伤修复的可行性，更深入的相关基因表达、分子信号通路等机制将在下一步深入研究。
此次实验证明了含细胞的海藻酸盐-明胶微球中分泌的硫酸化糖胺聚糖量在培养的实验周期中持续上升，并且多于含细胞的海藻酸盐微球，在软骨相关蛋白层面证明了其优势所在，更适合在软骨组织工程领域应用。根据目前的实验数据和结果，下一步将开展相关动物实验以便更充分地证明该方法对软骨缺损的修复能力，继续提供理论基础以便争取早日进行临床转化。
实验加入了明胶成分通过电喷雾法制备了优化的海藻酸盐微球，其中15 g/L海藻酸钠+5 g/L明胶可以通过电喷雾法制备出完整的微球，该微球可以将高活性和具有成软骨分化能力的ADSCs通过电喷雾的方式进行包埋，结果显示，该微球与纯海藻酸盐微球相比具有更好的生物相容性以促进ADSCs增殖，其中ADSCs的生物活性和增殖水平高于纯海藻酸盐微球，并且其促进ADSCs分泌硫酸化糖胺聚糖的能力强于纯海藻酸盐微球，对软骨损伤修复更具优势。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性

Preparation of alginate-gelatin-adipose-derived stem cells microspheres by electrospray and feasibility on repairing articular cartilage injury

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