骨髓间充质干细胞移植联合益母草碱治疗宫腔粘连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
TGF-β/Smad3信号通路：无活性的TGF-β经水解后获得活性并与TβRII相结合，其配体复合物可激活TPRI的丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化而表现出激酶活性；活化的TβRI激酶区的IV和V亚区的L45环结构特异性结合胞内R-Smads的MH2区L3环结构，在R-Smads端的SSXS基序的2个丝氨酸残基被磷酸化后，MH1与MH2区相互接触的状态接触，分子完全伸展，使R-Smad呈活化构象。
干扰素：是由某些细胞受到一定的反应刺激而产生分泌的一类蛋白质，依据其分子结构与抗原性的不同，将其分为α、β和γ 3种类型。人的IFN γ基因定位于第12对染色体长臂，长度约为6 kb，相对分子质量为40 000，由3个内含子和4个外显子构成，成熟IFN -Y因子由143个氨基酸组成。

摘要
背景：大量动物实验表明骨髓间充质干细胞移植能够促进皮肤损伤、肝损伤、肺损伤的修复；益母草具有活血祛瘀、调经的功效。
目的：验证骨髓间充质干细胞移植联合益母草碱治疗兔宫腔粘连的作用并探讨其机制。
方法：采用双重损伤法建立新西兰大白兔宫腔粘连模型，实验随机分为5组：假手术组、宫腔粘连组、骨髓间充质干细胞组、益母草碱组和骨髓间充质干细胞+益母草碱组(联合组)。假手术组切开子宫后不作任何处理，生理盐水冲洗后关腹；骨髓间充质干细胞组与联合组在子宫缝合前将骨髓间充质干细胞局部移植至子宫组织内；益母草碱组与联合组分别在造模后灌胃益母草碱4 mg/kg，共14 d。苏木精-伊红染色观察子宫内膜形态学变化，免疫组织化学染色法检测组织中转化生长因子β、Smad3的蛋白表达变化，实时荧光定量PCR(qPCR)检测IFN-γ的mRNA表达变化。
结果与结论：①与宫腔粘连组相比，骨髓间充质干细胞组、益母草碱组与联合组的宫腔粘连程度减轻，其中以联合组宫腔粘连程度最小；②与假手术组相比，宫腔粘连组的转化生长因子β、Smad3蛋白表达显著升高，干扰素γ的mRNA表达显著降低；与宫腔粘连组相比，骨髓间充质干细胞组、益母草碱组与联合组中转化生长因子β、Smad3蛋白表达显著降低，干扰素γ的mRNA表达显著升高，其中以联合组的变化程度最大。③结果证实骨髓间充质干细胞移植联合益母草碱能够显著改善宫腔粘连；其作用可能与转化生长因子β/Smad3通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1616-511X(王冰玉)

关键词: 干细胞, 移植, 益母草碱, 骨髓间充质干细胞, 宫腔粘连, 转化生长因子β, Smad3, 干扰素γ

Abstract:

BACKGROUND: Increasing evidence has demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) transplantation can promote skin, liver and lung repair in animal models; and Leonurus sibiricus L. has the ability of promoting blood circulation and regulating menstruation.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of BMSC transplantation with leonurine on intrauterine adhesions (IUA) in rabbits and the relevant mechanism of action.
METHODS: After modeled using dual injury method, rabbit models of IUA were randomly divided into five groups: sham-operated group (sham), model group (IUA), BMSC transplantation group, leonurine treatment group and combined treatment group (BMSCs+leonurine). Rabbits in the sham group were only given normal saline rinsing after hysterotomy, while those in the latter three groups were correspondingly given intrauterine BMSC transplantation or/and intragastric administration of 4 mg/kg leonurine for 14 days. Morphological changes of the endometrium were observed using hematoxylin-eosin staining, and expression levels of transforming growth factor β protein, Smad3 protein and interferon-γ mRNA were detected using immunohistochemical staining and real-time fluorescence quantitative PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the degree of IUA was all significantly improved in the other groups, especially in the combined treatment group. Moreover, BMSC transplantation, leonurine treatment and their combined use all could inhibit IUA-induced increase of transforming growth factor β and Smad3 protein expression and IUA-induced decrease of interferon-γ mRNA level. Importantly, all these alternations were much more pronounced in the combined treatment group. Our results show that the combined use of BMSC transplantation and leonurine treatment can exert a synergistic effect in the improvement of IUA through the transforming growth factor β/Smad3 pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Leonurus, Uterus, Transforming Growth Factor beta, Smad3 Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王冰玉，姬霞. 骨髓间充质干细胞移植联合益母草碱治疗宫腔粘连[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4771-4777.

Wang Bing-yu, Ji Xia. Leonurine combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of intrauterine adhesions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4771-4777.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用西兰大白兔40只，分为5组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 骨髓间充质干细胞形态 显微镜下观察到原代细胞呈圆形，刚接种时悬浮在培养瓶中，24 h后细胞呈梭形，沿壁伸展；3 d后细胞数量增多，呈长梭形并围绕中心呈放射状排列；当细胞融合至80%以上时，细胞平行排列成漩涡状或辐射状。细胞传代后，生长速度加快，迅速贴壁，待传至3代以后细胞形态趋于一致。见图1。

2.3 子宫内膜形态学变化 假手术组子宫腔表面覆盖柱状上皮，内膜层腺体丰富；宫腔粘连组纵向剖开宫腔，可见膜样粘连带形成，显微镜下观察宫腔出现纤维性粘连带，未粘连区几乎由无功能的扁平上皮细胞覆盖，上皮层下腺体极少；骨髓间充质干细胞组宫腔部分闭锁，表面可见纤维性粘连带，未粘连区有扁平上皮细胞覆盖，上皮层下腺体极少；益母草碱组可见大量膜样粘连带，粘连区大部分覆盖扁平上皮细胞；联合组大部分宫腔表面上皮再生，上皮细胞呈立方形，再生上皮层下见少量腺体。见图2。

2.4 各组组织中转化生长因子β、Smad3的蛋白表达变化 宫腔粘连组组织中转化生长因子β、Smad3的蛋白表达呈强阳性；与宫腔粘连组相比，益母草碱组、骨髓间充质干细胞组与联合组组织中转化生长因子β、Smad3的蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，其蛋白表达的强弱程度为：益母草碱组>骨髓间充质干细胞组>联合组。见图3，4。

2.5 各组组织中干扰素γ的mRNA表达变化 如图5所示，宫腔粘连组组中干扰素γ的mRNA表达呈阴性；与宫腔粘连组相比，益母草碱组、骨髓间充质干细胞组与联合组组织中干扰素γ的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)，其蛋白表达的强弱程度为：益母草碱组<骨髓间充质干细胞组<联合组。

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引言

宫腔粘连是一种常见的妇科继发性疾病，主要是由子宫内膜创伤或感染导致子宫腔或宫颈部分或完全粘连，从而引起月经减少或闭经、周期性腹痛、不孕或反复流产^[1-5]，严重影响育龄期妇女患者的生育能力。有报道指出由于宫腔粘连导致发生不孕的概率为43%，在不孕症患者中发生宫腔粘连概率高达13%^[6]。据调查统计，90%以上的宫腔粘连的发生是与妊娠有关，如流产刮宫，宫腔镜下子宫肌瘤剥除术等，刮宫次数越多，越容易导致宫腔粘连的发生^[7]。临床研究表明，对宫腔粘连进行分离手术后的复发率较高，高达44.9%^[8-10]。因此，如何采取适当的干预措施，结合药物治疗，对于有效改善宫腔粘连，恢复正常宫腔形态是目前研究的热点。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化的潜能，主要特点为自我更新，取材方便，不存在异体移植免疫排斥以及伦理问题，因此引起广泛的关注。大量动物实验表明骨髓间充质干细胞移植能够促进皮肤损伤、肝损伤、肺损伤的修复^[11-1⁶^]。Gargett等^[17]研究中认为子宫内膜基底层与肌壁交汇处的子宫内膜干细胞可能参与月经周期中子宫内膜脱落后的生理性修复。子宫内膜的基底层损伤主要是引起内膜修复的阻碍，而基底层是子宫内膜干细胞富集的位点^[18]。唇形科益母草属植物益母草具有活血祛瘀、调经的功效，临床上主要用于月经不调及产后腹痛^[19^-^20]。益母草碱是其有效活性成分之一，尚未有报道指出益母草碱对宫腔粘连有疗效。实验通过建立宫腔粘连动物模型，研究骨髓间充质干细胞移植联合益母草碱对宫腔粘连的作用及相关机制。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年8月至2015年6月在河南中医药大学动物中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康新西兰大白兔，4周龄5只和12周龄40只，体质量分别约1 kg和2.5 kg，由广东药学院实验动物中心提供。饲养环境：(22±2) ℃室温，(50±5)%湿度，日照12 h，自由进食与饮水。

实验试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司，青霉素-链霉素购自武汉博士德公司，益母草碱由安徽省新星药物开发有限责任公司提供；转化生长因子β、Smad3抗体购自santa cruz公司。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养 在严格无菌条件下，对4周龄的5只新西兰大白兔耳缘静脉注射20%乌拉坦进行麻醉，7 mL/kg，仰卧固定后，剪毛后用体积分数的75%乙醇消毒背部与下肢皮肤，切开皮肤后，用器械去除双侧股骨和胫骨，从股骨和胫骨中段剪断，用5 mL注射器抽取DMEM/F12培养基注入骨髓腔中，收集至离心管中，反复冲洗直至髓腔变白，制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，取沉淀用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂，95%湿度的培养箱中培养。24 h后换液，之后每隔三四天换液1次，待细胞铺满瓶底80%以上，按1∶2传代，取第3代生长良好的细胞进行后续实验。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 参考游佳等^[15]骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定的方法进行。

1.4.3 宫腔粘连模型建立与实验分组 随机分为5组：假手术组、宫腔粘连组、骨髓间充质干细胞组、益母草碱组、联合组(骨髓间充质干细胞+益母草碱组)。宫腔粘连组、益母草碱组与联合组在无菌条件下，耳缘静脉注射20%乌拉坦进行麻醉，5 mL/kg，仰卧固定后，随机于一侧子宫下约1/3处作0.5 cm纵切口，用子宫内膜刮勺(ID 4 mm)搔刮子宫中上段，直至四壁感觉粗糙，刮勺进出子宫的阻碍感消失，停止刮宫。生理盐水冲洗，宫内滞留手术棉线，缝合切口，48 h后取出手术棉线。假手术组切开子宫后不作任何处理，生理盐水冲洗后关腹；骨髓间充质干细胞组与联合组在子宫缝合前将骨髓间充质干细胞局部移植至新西兰大白兔子宫组织内；益母草碱组与联合组分别在造模后灌胃益母草碱4 mg/kg，共14 d。

1.4.4 苏木精-伊红染色 给药完成后，处死新西兰大白兔，切除子宫，置于体积分数10%甲醛溶液中固定，常规石蜡切片，烤片后二甲苯中脱蜡，加入梯度乙醇(体积分数100%，95%，90%，80%，70%)，蒸馏水洗涤，苏木精染色，1%盐酸分化，伊红复染，再次梯度乙醇(体积分数70%，80%，90%，95%，100%)脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.5 免疫组织化学染色法 将石蜡切片烤片后置于二甲苯(I)(II)(III)中脱蜡，梯度乙醇分别脱水，PBS洗涤，置于体积分数3%H₂O₂去离子水孵育10 min，封闭，加入一抗，4 ℃冰箱过夜，PBS洗涤，加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤，加入DAB显色剂。苏木精复染，返蓝，脱水透明，封固晾干。检测宫腔组织中转化生长因子β、Smad3的蛋白表达变化。光镜下观察免疫组织化学切片染色结果，计算阳性细胞率。评分方法：阳性细胞率≤1%为0分，2-25%为1分，26%-50%为2分，51-75%为3分，>75%为4分；无染色为0分，弱强度染色为1分，中等强度染色为2分，强染色为3分；以阳性细胞率和染色强度乘积进行综合判断：0-1分为阴性(-)；2-4分为弱阳性(+)，5-8分为中等阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。

1.4.6 实时荧光定量PCR(qPCR) 取各组新西兰大白兔宫腔组织，按照Trizol说明书提取总RNA，反转录合成cDNA，采用PCR仪进行扩增，所用引物：干扰素γ：上游：5’-GAG GTC GAA GAG CAT CCC AG-3’，下游：5’-GCT TAG GTT GGC TGC CTA GT-3’；GAPDH：上游：5’-CTT GAC GCC GTC GTG TCG-3’，下游：5’-AGA ACC CAA GAT GAG GCA GAG-3’。扩增条件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，共32个循环，74 ℃延伸3 min。检测IFN-γ的mRNA表达变化，所得结果直接在荧光定量操作系统中进行比较分析，目标基因的相对定量用2^-^??Ct计算。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态；②兔子宫内膜形态学观察；③检测兔宫腔组织转化生长因子β、Smad3的蛋白表达；④检测兔宫腔组织干扰素γ的mRNA表达。

1.6 统计学分析 全部实验数据采用SPSS 17.0软件包处理，实验数据采用x(_)±s表示，各组件差异采用单因素方差分析(ANOVA)，Bonferroni校正的t 检验分析两两数据间差异，以P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

转化生长因子β1是主要的促纤维形成因子，是纤维瘢痕形成的主要内源性生长因子，其过度表达可能是形成纤维瘢痕的主要原因^[21-24]。国内学者研究发现转化生长因子β在重度宫腔粘连的患者子宫内膜腺上皮细胞中的表达显著升高，推测子宫内膜纤维化与宫腔粘连的形成是由于转化生长因子β过度表达引肥市起^[25-27]。

Smads蛋白是将转化生长因子β活化信号传到至细胞核进而调节靶基因转录的重要信号转导分子，在纤维瘢痕形成的过程中起重要作用。Smads蛋白家族包括Smad1-11，在转化生长因子β/Smad3信号转导通路中，通过各Smads蛋白互相协调，从而维持转化生长因子β的正常功能^[28-31]。Gordon等^[32]研究发现胶原分泌细胞中Smad3的激活导致组织纤维化的产生。此外，Smad3的过度表达显著增加皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成，当阻断Smad3表达后，则不再通过转化生长因子β/Smad3信号转导通路诱导Ⅰ型胶原的合成。推测Smad3蛋白可能参与了宫腔粘连的发生与发展，同时结合转化生长因子β在宫腔粘连中的过度表达，转化生长因子β/Smad3信号转导通路可能与宫腔粘联的发生机制有关。

实验发现，宫腔粘连组的新西兰大白兔子宫组织中转化生长因子β与Smad3蛋白均呈强阳性表达，益母草碱组与骨髓间充质干细胞组均在一定程度降低转化生长因子β与Smad3蛋白的表达；骨髓间充质干细胞联合益母草碱能够显著降低宫腔粘连中转化生长因子β与Smad3蛋白表达水平。提示骨髓间充质干细胞联合益母草碱是通过调控转化生长因子β/ Smad3信号转导通路抑制转化生长因子β与Smad3蛋白的表达，从而抑制皮肤成纤维细胞大量的Ⅰ型胶原生成，促进细胞外基质降解蛋白的合成，抑制组织纤维化的产生，进而改善宫腔粘连的状况。国内学者研究发现转化生长因子β1在早期妊娠胎儿皮肤中呈弱阳性表达，可能与皮肤创面愈合无瘢痕有关^[33]，此外，研究发现转化生长因子β1具有促进纤维瘢痕的形成。

干扰素γ(IFN-γ)具有影响细胞生长、诱导细胞分化、免疫调节和抗肿瘤等多种生物学功能。干扰素γ主要在炎症和免疫反应中，由自然杀伤细胞、巨噬细胞和激活的T淋巴细胞分泌产生，具有抑制纤维细胞增殖并诱导其分化的作用。干扰素γ被认为具有抑制胶原蛋白合成与细胞外机制沉积的因子之一，在纤维瘢痕形成中具有负性调节的作用，同时具有调节炎性反应的作用。

临床上公认干扰素γ为抗纤维化药物，主要通过增加Smad7的表达，从而诱导Smad3磷酸化，阻滞转化生长因子β/Smad3信号转导通路，从而抑制转化生长因子β和Smad3的表达，抑制转化生长因子β和Smad3的表达，进而减少成纤维细胞的增殖^[34-36]。报道指出在抗四氯化碳大鼠肝纤维化模型中，沙苑子黄酮通过促进干扰素γ表达，抑制转化生长因子β表达，对肝纤维化具有一定的治疗作用^[37]。国外报道指出，当干扰素γ达到一定浓度值时，对胆管瘢痕的成纤维细胞的增殖与分化具有显著的抑制作用，并与干扰素γ的浓度具有一定的相关性^[38^-^39]。实验中干扰素γ26的mRNA表达在骨髓间充质干细胞与益母草碱联合作用下显著高于宫腔粘连组，提示骨髓间充质干细胞与益母草碱能够通过增加干扰素γ的表达，从而减轻子宫内膜纤维化的程度。转化生长因子β、Smad3和干扰素γ在宫腔粘连组织的表达成负相关，转化生长因子β和Smad3的高表达，干扰素γ的低表达，共同参与了宫腔粘连的发生机制。骨髓间充质干细胞与益母草碱联合应用，通过调控转化生长因子β、Smad3和干扰素γ的表达，从而抑制子宫内膜纤维化的形成，缓解子宫粘连的情况。

综上所述，骨髓间充质干细胞与益母草碱能够改善新西兰大白兔宫腔粘连的状况，其作用机制可能与调控转化生长因子β/Smad3信号转导通路有关。